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Article de méthode

Analyse du métabolisme des cellules tueuses naturelles humaines

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DOI :

10.3791/61466

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22 juin 2020

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1Cardiovascular Branch, National Heart, Lung and Blood Institute, National Institutes of Health, 2Departamento de Biología Molecular, Centro de Biología Molecular Severo Ochoa, Consejo Superior de Investigaciones Científicas-Universidad Autónoma de Madrid (CSIC-UAM), 3Lymphoid Malignancies Branch, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health

Dans cet article

Résumé

Dans cet article, nous décrivons une méthode pour mesurer la glycolyse et la respiration mitochondriale dans les cellules humaines primaires de tueur naturel (NK) isolées du sang périphérique, au repos ou après l’activation induite par l’IL15. Le protocole décrit pourrait être facilement étendu aux cellules NK humaines primaires activées par d’autres cytokines ou stimuli solubles.

Résumé

Les cellules tueurs naturels (NK) interviennent principalement des réponses immunitaires antitumorales et antivirales innées et répondent à une variété de cytokines et d’autres stimuli pour favoriser la survie, la prolifération cellulaire, la production de cytokines telles que les programmes d’interféron gamma (IFNγ) et/ou de cytotoxicité. L’activation des cellules NK par stimulation de cytokine nécessite un remodelage substantiel des voies métaboliques pour soutenir leurs besoins bioénergétiques et biosynthétiques. Il existe un grand nombre de preuves qui suggèrent que le métabolisme altéré des cellules NK est associé à un certain nombre de maladies chroniques, y compris l’obésité et le cancer, ce qui souligne l’importance clinique de la disponibilité d’une méthode pour déterminer le métabolisme cellulaire NK. Ici, nous décrivons l’utilisation d’un analyseur de flux extracellulaire, une plate-forme qui permet des mesures en temps réel de la glycolyse et de la consommation d’oxygène mitochondrial, comme un outil pour surveiller les changements dans le métabolisme énergétique des cellules humaines NK. La méthode décrite ici permet également la surveillance des changements métaboliques après la stimulation des cellules NK avec des cytokines telles que l’IL-15, un système qui est actuellement à l’étude dans un large éventail d’essais cliniques.

Introduction

Les cellules de tueur naturel (NK) sont des lymphocytes innés qui pédiment les réponses anti-tumorales et antivirales. Les cellules NK représentent 5 à 15 % de tous les lymphocytes dans le sang périphérique humain, et peuvent également être trouvées dans la rate, le foie, la moelle osseuse et les ganglions lymphatiques. Les cellules NK n’expriment pas les récepteurs clonotypic polymorphes, tels que les récepteurs à cellules T (TCR) ou les récepteurs à cellules B (BCR). En revanche, l’activation de leurs fonctions cytolytiques est motivée par l’engagement de récepteurs qui reconnaissent les ligands invariables à la surface d’une cellule cible1,2.

Les cellules nk humaines au repos isolées du sang périphérique peuvent survivre pendant plusieurs jours dans le milieu de culture complété avec le sérum humain. L’activation des cellules NK par des cytokines telles que l’IL-15 ou l’IL-2 entraîne la prolifération des cellules et une augmentation de leur capacité de tuer, entre autres effets3,4,5. Plusieurs études ont montré une corrélation directe entre l’activation des cellules NK et les changements dans leur activité métabolique6. Ces changements métaboliques sont destinés à répondre aux exigences particulières des cellules en termes d’énergie et de biosynthèse.

Les cellules et les organismes aérobiques obtiennent de l’énergie grâce à une série de réactions chimiques qui impliquent le catabolisme et l’oxydation des glucides, des graisses et des protéines. Grâce à une combinaison de glycolyse, le cycle de l’acide tricarboxylique (TCA) et la phosphorylation oxydative, les cellules eucaryotes répondent à la majorité de leur demande d’ATP et obtiennent des intermédiaires requis comme éléments constitutifs des macromolécules essentielles à la croissance et à la prolifération des cellules. Le processus de glycolyse (figure 1A) commence par l’entrée du glucose dans la cellule. Dans le cytosol, le glucose est phosphorylé et transformé en pyruvate (avec une production nette de 2 molécules d’ATP par molécule de glucose), qui peut être réduit au lactate ou transporté dans les mitochondries pour être transformé en Acétyl-CoA et entrer dans le cycle TCA. Le cycle TCA continue le cycle alimenté avec plus de molécules d’Acétyl-CoA et produit du CO2 (qui finira par se diffuser à l’extérieur de la cellule et, en réagissant avec H2O dans le milieu, générera de l’acide carbonique qui conduira à l’acidification du milieu) et NADH, la molécule en charge de donner des électrons à la chaîne de transport d’électrons (ETC). Les électrons voyagent à travers différents complexes protéiques et sont finalement acceptés par l’oxygène. Ces complexes (I, III et IV) pompent également H+ de la matrice mitochondriale dans l’espace intermembrane. En conséquence du gradient électrochimique généré, le H+ entrera à nouveau dans la matrice à travers le complexe V (ATP-synthase), en investissant l’énergie potentielle accumulée dans la génération d’ATP.

La glycolyse et la respiration mitochondriale peuvent être bloquées à différents points en utilisant des inhibiteurs. La connaissance et l’utilisation de ces inhibiteurs ont été la base pour le développement de l’essai de flux extracellulaire. En mesurant deux paramètres simples en temps réel comme le pH et l’oxygène, l’analyseur de flux extracellulaire infère le taux de glycolyse et de respiration mitochondriale dans une plaque de 96 puits. Le test de résistance à la glycolyse est effectué dans un milieu basal sans glucose (Figure 1B)7. Les premières mesures du taux d’acidification extracellulaire (ECAR) sont indicatives de l’acidification indépendante de la glycolyse. Il est appelé acidification non glycolytique et est en corrélation avec le CO2 produit par le TCA qui, comme expliqué précédemment, se combine avec H2O dans le milieu pour générer H+ (ECAR lié au TCA). La première injection est le glucose pour induire l’utilisation du glucose et stimuler la glycolyse. La deuxième injection combine à la fois la roténone, un inhibiteur du complexe I, et l’antimycine A, un inhibiteur complexe III ensemble, pour bloquer l’ETC. Les cellules répondent à cette diminution spectaculaire de la production d’ATP mitochondrial en activant la glycolyse pour maintenir les niveaux d’ATP cellulaire, ce qui représente la quantité de glycolyse qui n’est pas utilisée par la cellule dans l’état basal mais pourrait être potentiellement recrutée en réponse à l’augmentation de la demande d’ATP (glycolyse compensatoiree). La troisième injection est l’analogue du glucose 2-Désoxyglucose (DG), qui rivalise avec le glucose comme substrat pour l’enzyme hexokinase. Le produit de cette phosphorylation, 2-désoxyglucose-6-phosphate ne peut pas être transformé en pyruvate, et donc la glycolyse est bloquée, ce qui abaisse l’ECAR à son minimum. L’ECAR mesurée à ce stade comprend d’autres sources d’acidification extracellulaire qui ne sont pas attribuées à la glycolyse ou à l’activité respiratoire ainsi que toute glycolyse résiduelle non totalement inhibée par 2-DG (post 2-DG-acidification).

Le test de stress mitochondrial est effectué dans un milieu avec du glucose (Figure 1C)8. Les premières mesures du taux de consommation d’oxygène (OCR) correspondent à la ligne de base de la respiration mitochondriale (respiration basale). La première injection est l’oligomycine, qui inhibe le retour des protons par la synthase ATP (complexe V), bloquant la synthèse de l’ATP et donc hyperpolariser rapidement la membrane mitochondriale, ce qui empêche le pompage de protons par les complexes respiratoires, et conduit à une diminution de l’OCR. La comparaison entre la respiration de base et la valeur donnée par addition d’oligomycine représente la respiration liée à l’ATP. Le taux restant d’oligomycine insensible à la consommation d’oxygène est appelé fuite de protons, qui représente le flux de protons à travers la bicouche lipidique ou les protéines dans la membrane mitochondriale interne comme le translocale nucléotide adénine9. La deuxième injection est le uncoupler 2,4-dinitrophénol (DNP), une ionophore qui induit une entrée massive de H+ dans la matrice mitochondriale, ce qui conduit à la dépolarisation de la membrane mitochondriale et la perturbation de la synthèse mitochondriale ATP. Les cellules réagissent à la dissipation de la force proton-motrice en augmentant le taux de transport des électrons et la consommation d’oxygène à des niveaux maximums dans une tentative futile de récupérer le potentiel de la membrane (capacité respiratoire maximale). La différence entre la capacité respiratoire maximale et la respiration basale est la capacité respiratoire de rechange de la cellule, qui représente la quantité de respiration qui n’est pas utilisée par la cellule pour générer de l’ATP dans l’état basal, mais qui pourrait être potentiellement recrutée en réponse à l’augmentation de la demande d’ATP ou dans des conditions de stress8. La troisième injection est une combinaison de roténone et d’antimycine A. Cette injection arrête complètement l’ETC et l’OCR diminue à son niveau le plus bas, la consommation d’oxygène restante étant non mitochondriale (causée par les NADPH-oxydases, etc.).

Les changements dans les voies métaboliques pourraient en quelque sorte prédire le fonctionnement des cellules NK, car il a été suggéré que l’activation continue des cellules NK avec des cytokines in vitro pourrait conduire à l’épuisement cellulaire NK par l’étude des différentes voies métaboliques10,11. La corrélation entre le statut métabolique des cellules NK et la fonction est très importante du point de vue de l’immunothérapie contre le cancer. Dans ce domaine, l’activation des cellules NK avec perfusion d’IL-15, seule ou en combinaison avec des anticorps thérapeutiques monoclonaux ont été testées afin d’améliorer la cellule tumorale tuant12,13,14. La connaissance de l’état métabolique des cellules NK en réponse à ces stratégies de traitement fournirait un prédicteur précieux de l’état d’activation des cellules NK et de la fonction de mise à mort.

L’étude des voies métaboliques dans d’autres cellules myéloïdes et lymphoïdes telles que les monocytes, les cellules T et B a été décrite15 et des méthodes optimisées ont été publiées16. Dans ce protocole, nous fournissons une méthode qui combine à la fois un protocole d’isolement NK qui produit un nombre élevé de cellules NK pures et viables et un protocole optimisé pour mesurer l’activité métabolique à l’aide d’un analyseur de flux extracellulaire. Ici, nous montrons qu’il s’agit d’une méthode valable pour l’étude des changements métaboliques dans le repos et IL-15 activé cellules NK humaines. Pour l’essai de flux extracellulaire, des paramètres tels que le nombre de cellules et les concentrations de médicaments ont été testés et optimisés. Par rapport à d’autres méthodes respiratoires, l’analyseur de flux extracellulaire est entièrement automatisé et capable de tester en temps réel, avec de très faibles quantités de cellules, jusqu’à 92 échantillons simultanément, et permet ainsi des dépistages à haut débit (avec plusieurs échantillons et répliques) d’une manière relativement rapide17.

Cette méthode peut être utilisée par des chercheurs intéressés à évaluer la fonction cellulaire NK en étudiant le métabolisme des cellules NK. Il pourrait également être appliqué aux cellules activées par d’autres cytokines, anticorps ou stimuli solubles.

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Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux principes éthiques de la recherche médicale énoncés dans la Déclaration d’Helsinki. Des échantillons de sang périphériques provenant de donneurs ont été obtenus auprès du Département de médecine transfusionnelle des NIH en vertu du protocole approuvé par la CISR 99-CC-0168, avec le consentement écrit des patients.

1. Préparation de réactifs

  1. Réactifs pour l’isolement des cellules NK
    NOTES : Préparez ces réactifs dans une hotte de culture cellulaire.
    1. Préparer le tampon de séparation NK : Supplément PBS (pH 7.4) avec 1 mM EDTA et 2% Sérum de veau foetal (FCS) qui a déjà été inactivé thermiquement (à 56 °C pendant 30 min).
    2. Préparer le milieu de culture NK : Compléter le Média modifié de Dulbecco (IMDM) d’Iscove avec 10% de sérum humain (SH). Filtre stérile et conserver à 2-8 °C. Chauffer le milieu à 37 °C avant d’ajouter aux cellules.
    3. Resuspend Human IL-15 en PBS à 200 μg/mL.
  2. Réactifs pour un test de flux extracellulaire
    1. Préparer un milieu d’analyse : Pour le milieu d’essai mitochondrial, ajouter 1 mM de pyruvate de sodium, 2 mM L-glutamine et 10 mM de glucose au milieu de base; pour le milieu d’essai de stress de glycolyse, ajoutez 2 mM L-glutamine au milieu de base.
      REMARQUE : Les concentrations de glucose, de pyruvate et de glutamine sont fournies comme recommandé par le fabricant d’analyseur de flux extracellulaire. Cependant, la composition des médias peut être modifiée par les chercheurs pour correspondre parfaitement à celle du milieu de culture, si désiré.
    2. Ajuster le pH des deux supports à 7,4 avec 0,1 N NaOH à l’aide d’un pH mètre de banc, filtre stérile à travers une taille de pore de 0,2 μM et stocker à 2-8 °C. Chauffer le milieu à 37 °C, vérifier le pH et réajuster à 7,4 avant utilisation si nécessaire.
      REMARQUE : Seul le COambiant 2 est contenu dans l’atmosphère de l’analyseur de flux extracellulaire, l’utilisation de supports sans bicarbonate est critique.
    3. Préparer des solutions de stock pour les réactifs : Oligomycine (inhibiteur de la synthase ATP), solution de stock de 10 mM en DMSO; 2,4-dinitrophénol (DNP, uncoupler), 1 M de solution de stock dans DMSO; antimycine A (inhibiteur complexe III), solution de stock de 10 mM dans DMSO; roténone (inhibiteur complexe I), solution de stock de 10 mM dans DMSO. Faire 30 aliquots μL de tous les réactifs et stocker à -20 °C.
      REMARQUE : Ces lignes directrices sont destinées aux réactifs achetés individuellement et préparés par le chercheur. Si des réactifs sont achetés au fabricant de l’analyseur, suivez leurs directives pour la préparation du réactif.

2. Les cellules NK s’isolent du sang périphérique

  1. Préparation des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à partir du sang humain
    REMARQUE : Effectuez ces étapes dans un capot de culture cellulaire. Décontaminer tous les résidus et matériaux en contact avec le sang avec de l’eau de Javel et les jeter dans le récipient approprié à incinérer.
    1. Pipette 20 ml de lymphocytes Separation Medium (LSM) dans un tube conique de 50 mL.
    2. Soigneusement, tout en gardant le tube à un angle de 30°, pipette 20 ml de sang sur le LSM, très doucement et en touchant le mur du tube. Évitez le mélange de sang avec le LSM et créez une interphase visible et bien définie entre les deux fluides.
      REMARQUE : On peut utiliser du sang périphérique ou des produits enrichis de leukaphérèse.
    3. Centrifugez les tubes pendant 25 min, 1000 x g à température ambiante. N’utilisez pas de frein, car il pourrait faire les deux phases dans le tube (LSM et sang) mélange.
    4. Retirez soigneusement les tubes de la centrifugeuse et placez-les dans un rack. Vérifiez la présence d’une couche visible de cellules (cellules mononucléaires) qui se formeront à l’interphase entre le LSM (clair) et le plasma (jaune), tandis que les globules rouges se granulent au fond du tube.
    5. Aspirate doucement la couche de cellules mononucléaires à l’aide d’une pipette en plastique de 10 ml (environ 5-8 ml) et placez-la dans un nouveau tube conique de 50 mL. L’interphase des lymphocytes de jusqu’à 2 tubes différents peut être mis en commun.
    6. Laver les cellules mononucléaires 2x en résuspendant dans 45 mL PBS et centrifugez à 800 x g pendant 5 min, à température ambiante.
      REMARQUE : Après cette étape, une pastille de cellules monnucléaires périphériques de sang (PBMC) est obtenue et le chercheur peut passer à l’étape d’isolement de NK.
  2. NK isolement des PBMC
    1. Comptez les cellules à partir de 2.1.6 et resuspendez-les dans le tampon de séparation NK (1x10 8 PBMC/mL).
    2. Prenez 10 ml de la resuspension cellulaire (109 PBMC) et placez-les dans un tube de 50 ml.
    3. Ajouter 500 μL (50 μL/mL de tampon) du mélange d’anticorps d’isolement cellulaire NK et 10 μL (1 μL/mL de tampon) du mélange d’anticorps d’isolement positif anti-CD3 aux PBMC et incuber à température ambiante pendant 10 min.
    4. Vortex les perles magnétiques et ajouter 1 ml au mélange de PBMC avec des anticorps (100 perles μL/ml PBMC). Incuber pendant 10 min à température ambiante en remuant de temps en temps.
    5. Ajouter 35 ml de tampon d’isolement NK (3,5 ml de tampon/ml pbmcs), mélanger et placer sur l’aimant pendant 15 min (2,2 x 107 PBMC/mL). Après ce temps, les perles et les cellules positivement sélectionnées (toutes les cellules sauf NK) auront adhéré aux parois du tube.
    6. Recueillir soigneusement le supernatant (contenant des cellules NK) avec une pipette en plastique de 50 mL sans toucher les côtés ou le fond du tube.
    7. Compter les cellules à l’aide d’un compteur cellulaire et d’une centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min.
    8. Resuspend les cellules NK isolées à 5 x 106 cellules/mL dans IMDM contenant 10% de SH et placez-les dans un incubateur à 37 °C avec 5% de CO2 jusqu’à ce que l’expérience soit réalisée.
      REMARQUE : Ce protocole d’isolement NK indique les nombres cellulaires et les volumes de réactifs adaptés à l’utilisation d’un tube de 50 ml et d’un grand aimant. Ce protocole peut être mis à l’échelle (au cas où d’autres PBMC sont obtenus) en répétant les étapes d’isolement dans différents tubes ou réduits en réduisant le volume dans le tube. Pour les volumes finaux de 14-45 mL un tube de polystyrène de 50 mL est utilisé, pour les volumes 4-14, un tube de polystyrène de 15 mL est utilisé et pour les volumes 1-4 mL, un tube de polystyrène de 5 mL est utilisé. L’aimant est différent et s’adapte au tube approprié dans chaque cas. La quantité de mélange d’anticorps et de perles magnétiques peut également être mise à l’échelle en fonction du nombre de cellules et du volume final.
  3. Coloration de la population de cellules NK pour la cytométrie de flux
    1. Prendre 0,25 x 106 cellules par échantillon à partir de l’étape 2.2.8, retirer le milieu par centrifuge à 800 x g pendant 5 min à température ambiante et resuspender le granulé cellulaire dans 500 μL de PBS.
    2. Ajouter le colorant de viabilité conformément à la recommandation du fabricant (1 μL de colorant reconstitué par DMSO à 1 mL de resuspension cellulaire) et incuber à température ambiante pendant 30 min.
    3. Laver 2x en resuspendant en PBS de 5 mL et en centrifuge à 800 x g pendant 5 min, à température ambiante.
    4. Tacher avec les anticorps antihumaines correspondants dans 100 μL d’IMDM contenant 10 % de SH pendant 30 min sur de la glace protégée de la lumière (voir le tableau 1). Tous les anticorps peuvent être combinés et utilisés en une seule étape de coloration.
    5. Analyser les échantillons par cytométrie de flux pour évaluer la pureté de la population de cellules NK obtenue. Utilisez la méthode de gating et d’analyse de cellules qui ont été précédemmentdécrites 18,19.
  4. Stimulation des cellules NK avec l’IL-15 soluble
    1. Resuspend 0,75 x 106 cellules à partir des étapes 2.2.8 ou 2.4.3 dans 100 μL d’IMDM contenant 10% HS dans un puits de 96 bien-plaque (fond rond).
    2. Diluer l’il-15 à 1 μg/mL humain dans l’IMDM contenant 10 % de SH. Ajouter 100 μL de l’IL-15 humain dilué aux cellules pour atteindre une concentration finale de 0,5 μg/mL.
      REMARQUE : 0,5 μg/mL est une concentration saturante d’IL-15. Des concentrations plus faibles d’IL-15 ou d’autres cytokines comme l’IL-2, l’IL-12 ou l’IL-18 peuvent être testées par les chercheurs si désiré.
    3. Placez les cellules dans l’incubateur à 37 °C et stimulez pendant 48 h avant d’effectuer l’essai de flux extracellulaire. Resuspend les cellules non stimulées (témoins) à la même concentration et volume dans IMDM contenant 10% HS sans IL-15, et placez-les dans le même incubateur pendant 48 h.

3. Hydratation de la cartouche de capteur

REMARQUE : Les 96 extrémités de la sonde de la cartouche de capteur contiennent des fluorophores à état solide individuels pour O2 et H+ qui doivent être hydratés afin de détecter les changements o2 et pH.

  1. Allumez l’analyseur et laissez-le se réchauffer jusqu’à 37 °C.
  2. Ouvrez le paquet de cartouche de capteur et séparez la cartouche de capteur de la plaque d’utilité. Ajouter 200 μL de la solution de calibrant dans chaque puits de la plaque d’utilité et remettre la cartouche du capteur sur la plaque, validant que les capteurs sont complètement immergés dans la solution. Pour obtenir des résultats optimaux, incuber la cartouche pendant la nuit à 37 °C dans un incubateur sans CO2qui est correctement humidifié pour prévenir l’évaporation. Prévenir la formation de bulles sous les capteurs pendant l’hydratation.
    REMARQUE : Le temps minimum d’hydratation de la cartouche est de 4 h à 37 °C dans un incubateur sans CO2. Alternativement, l’hydratation de nuit de la cartouche de capteur avec 200 μL d’eau stérile à 37 °C dans un incubateur sans CO2,suivie d’une incubation de la cartouche de capteur avec 200 μL de solution de calibrant préchauffé 45 – 60 min avant le début de la course, peut être utilisée.

4. Essai de flux extracellulaire

  1. Préparation de plaques adhésives
    NOTE : Puisque la mesure des paramètres métaboliques a lieu dans une microchamber formée au bas de la plaque d’analyse de 96 puits, les cellules de suspension doivent d’abord être collées au fond du puits. Un adhésif cellulaire extrait de la moule Mytilus edulis est utilisé. Le fabricant de l’adhésif cellulaire recommande une concentration de revêtement de 1 à 5 μg/cm2. Le puits de la microplaque de culture cellulaire de l’analyseur a une surface d’environ 0,110 cm2. Ainsi, pour une concentration de 5 μg/cm2, environ 0,55 μg d’adhésif sont nécessaires. Comme 25 μL de la solution adhésive seront utilisés pour enrober chaque puits, la concentration optimale de solution adhésive pour les microplaques de culture cellulaire analyseuse est d’environ 22,4 μg/mL (22,4 μg/mL x 0,025 mL = 0,56 μg).
    1. Préparer 2,5 mL de solution adhésive cellulaire (22,4 μg/mL) en bicarbonate de sodium de 0,1 M, pH 8,0. Le bicarbonate fournit le pH optimal pour les performances des adhérents cellulaires qui, selon le fabricant, se situe entre 6,5 et 8,0.
    2. Pipette 25 μL de la solution adhésive cellulaire à chaque puits de la plaque d’essai et incuber à température ambiante pendant 20 min. Après cela, retirer la solution et laver 2x avec 200 μL d’eau stérile / puits. Laissez sécher les puits en gardant la plaque ouverte pendant 15 minutes à l’intérieur d’un capot de culture cellulaire.
      REMARQUE : Les plaques enduites peuvent être conservées jusqu’à 1 semaine à 4 °C.
  2. Ensemencement cellulaire dans des plaques recouvertes d’adhésif
    1. Cellules de centrifugeuse de l’étape 2.4.3 à 200 x g pendant 5 min à température ambiante. Enlever les supernatants et laver les cellules dans le milieu de test de stress mitochondrial réchauffé (si un test de stress mitochondrial est effectué) ou le milieu de test de stress de glycolyse (si un test de résistance à la glycolyse est effectué). Les cellules de granulés à nouveau et resuspendent à la concentration de cellules préférée dans le même milieu (le volume de resuspension dépendra de la concentration cellulaire choisie; puisque chaque puits contiendra 180 μL de la suspension cellulaire, préparer 0,26 x 106, 0,52 x 106, 1,04 x 106, 2,08 x 106, 4,17 x 106 et 8,33 x 10 suspensions cellulairesde 6 cellules/mL pour 0,047 x 106, 0,094 x 106, 0,187 x 106, 0,375 x 106, 0,75 x 106 et 1, 5 x 106 cellules par puits respectivement).
    2. Plaque 180 μL de suspension cellulaire par puits le long du côté de chaque puits. Une pipette multicanal est recommandée. Utilisez les puits A1, A12, H1 et H12 de la plaque de culture de l’analyseur comme puits de contrôle pour la correction de fond. Ajouter 180 μL du milieu d’essai dans ces puits (pas de cellules). Des puits de contrôle supplémentaires peuvent être utilisés si désiré et s’il y a suffisamment d’espace dans la plaque.
      REMARQUE : La présence de sérum peut causer une mauvaise fixation cellulaire.
    3. Incuber la plaque pendant 30 min à 37 °C dans un incubateur sans CO2. Préparer 10x composés entre-temps (voir étape 4.3 ci-dessous).
    4. Modifiez les réglages de la centrifugeuse en zéro freinage. Centrifuge la plaque à 200 x g pendant 5 min. Observez les cellules au microscope pour vérifier qu’elles forment une monocouche au fond du puits. Transférer les plaques à l’incubateur CO2-freependant 25 min. Pour de meilleurs résultats, le temps total après le placage ne doit pas être supérieur à environ 1 h.
  3. Préparation de solutions de travail 10x pour charger dans la cartouche de capteur
    REMARQUE : Chacun des 96 extrémités de la sonde de la cartouche de capteur abrite 4 ports (A, B, C et D) qui peuvent être utilisés pour injecter des composés séquentiellement dans des puits individuels.
    1. Pour effectuer un test de stress mitochondrial, préparez 2,5 mL chacun de 10 oligomycine de μM, 1 mM DNP et un mélange de roténone de 10 μM et 10 μM d’antimycine A, dans le milieu d’essai de stress mitochondrial (utiliser les solutions de stock à partir de l’étape 1.2.3). Les concentrations finales dans le puits après l’injection seront de 1 μM d’oligomycine, de 0,1 mM DNP et de 1 μM d’antimycine A/roténone.
    2. Pour effectuer un test de résistance à la glycolyse, préparer 2,5 mL d’un mélange de roténone de 10 μM et 10 μM d’antimycine A dans le milieu d’essai de stress de la glycolyse (utiliser les solutions de stock à partir de l’étape 1.2.3). Dissoudre le glucose dans le milieu d’essai de stress de glycolyse pour une solution de 100 mM et 2-désoxy-glucose (2-DG) dans le milieu d’essai de stress de glycolyse pour une solution de 500 mM. Les concentrations finales dans le puits après l’injection seront de 10 mM de glucose, 1 μM d’antimycine A/roténone et 50 mM 2-DG.
    3. Solutions chaudes à 37 °C, vérifier le pH et réajuster à 7,4 si nécessaire. Composés de charge préparés à l’étape 4.3.1. (pour un test de résistance mitochondrial) ou 4.3.2 (pour un test de résistance à la glycolyse) dans les ports A, B et C de la cartouche de capteur hydraté (à partir de l’étape 3.2) à l’aide d’un micropippers multicanal et des guides de chargement de port fournis avec la cartouche, comme le montre le tableau 2.
      REMARQUE : Pour assurer une injection adéquate dans tous les puits pendant l’essai, chaque série de ports utilisés (p. ex., tous les ports A) doit contenir le même volume d’injection sur l’ensemble de la cartouche du capteur. Cela s’applique aux puits de correction de fond et même aux puits qui ne sont pas utilisés dans l’expérience.
    4. Incuber la cartouche de capteur chargée à 37 °C dans un incubateur sans CO2lors de la mise en place du programme.
  4. Configuration des protocoles d’analyse de flux extracellulaires
    1. Ouvrez le logiciel d’analyseur de flux extracellulaire et à l’aide des onglets Définitions de groupe et plane carte indiquent des groupes de puits qui ont des conditions similaires (p. ex., des puits avec le même nombre de cellules, ou des puits avec des cellules au repos ou des cellules stimulées par l’IL-15). Indiquez également que les puits de correction de fond (par défaut A1, A12, H1 et H12 seront réglés, mais d’autres puits peuvent être utilisés) et des puits vides.
    2. Définissez le programme décrit dans le tableau 3 dans le logiciel à l’aide de l’onglet Protocole.
    3. Commencez le programme à l’aide de l’onglet Exécuter les tests. Placez la cartouche du capteur (hydratée et chargée de composés 10x) et la plaque d’utilité sur le plateau. Après l’étape d’étalonnage (15 – 20 min), lorsqu’il est invité, remplacer la plaque de calibrant pour la plaque d’essai (sans couvercle) par des cellules attachées. Après cela, la course est entièrement automatisée (la machine effectuera toutes les mesures et injections).
      REMARQUE : Il est possible d’effectuer un test de résistance mitochondrial et un test de stress glycolytique dans la même plaque, tant que les composés spécifiques sont chargés dans les ports appropriés (oligomycine, DNP et antimycine/roténone respectivement dans les ports A, B et C des puits où un test de résistance mitochondrial est effectué; glucose, antimycine/roténone et 2-DG dans les ports A, B et C respectivement des puits où un test de résistance à la glycolyse est effectué), les mêmes volumes pour les injections sont utilisés dans chaque série de ports et de puits pour chaque test sont correctement identifiés à l’aide des onglets de définitions de groupe et de plaque du logiciel.
    4. Après la fin de l’exécution, récupérer les données et les analyser à l’aide du logiciel.

5. Détermination du numéro de cellule

REMARQUE : Les résultats peuvent être normalisés pour tenir compte des différences possibles dans le nombre de cellules. Deux approches principales décrites ci-dessous peuvent être utilisées.

  1. Détermination du contenu de l’ADN
    1. Retirer le milieu d’essai restant à l’aide d’une pipette de chaque puits. Lorsque vous aspirez à un milieu, veillez à ne pas déranger les cellules. La plaque peut être stockée à -20 °C jusqu’à l’analyse.
      REMARQUE : L’étape de congélation est importante pour la lyse cellulaire efficace et la détermination du contenu de l’ADN.
    2. Préparer une solution 1x de tampon de analyse cellulaire (20x) dans de l’eau distillée (200 μL/puits).
    3. Ajoutez la solution de stock de colorant de test de prolifération cellulaire (400x) dans le tampon 1x de cellule-lyse. Pour la détection de 50 à 50.000 cellules par puits, utilisez 1x colorant d’analyse de prolifération cellulaire. Pour des nombres cellulaires plus élevés, il est recommandé d’utiliser le colorant d’essai de prolifération cellulaire à une concentration finale supérieure à 1 x. Dans ce cas, utilisez le colorant d’analyse de prolifération cellulaire à une concentration finale de 5x (diluer la solution de stock d’analyse de prolifération cellulaire 80 fois en tampon 1x cellule-lyse).
    4. Ajouter 200 μL du réactif d’essai de prolifération cellulaire à chaque puits. Incuber les échantillons pendant 2 à 5 min à température ambiante. Protégez-vous de la lumière.
    5. Mesurer la fluorescence des échantillons à l’excitation : 480 nm; émission : 520 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques de fluorescence selon les recommandations du fabricant.
  2. Détermination de la teneur en protéines
    1. Soigneusement, aspiratre complètement le milieu d’essai de chaque puits sans toucher les cellules et congeler les cellules à -20 °C pendant au moins 1 h. Alternativement, les cellules peuvent être conservées congelées pendant plus longtemps (jusqu’à 1 semaine) jusqu’à ce que l’analyse soit effectuée.
    2. Ajouter 50 μL de milieu de lyse par radioimmunoprécipitation (RIPA) complétés par des inhibiteurs de protéase 1x (à partir d’une solution de stock de 100x) à chaque puits. Placer la plaque sur un shaker pendant 5 min à température ambiante, puis incuber la plaque sur la glace pendant 30 min pour une lyse cellulaire complète.
    3. Centrifugez la plaque pendant 5 min à 200 x g à température ambiante. Cette étape va granuler les débris cellulaires pour prévenir les interférences avec la mesure des protéines.
    4. Mesurer la concentration de protéines par test d’acide bicinchoninique (BCA) selon les recommandations du fabricant.

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Résultats

L’isolement des cellules NK du sang périphérique fournit une population pure et viable

L’essai de flux extracellulaire est basé sur la mesure de la concentration de H+ et O2 dans le puits et ne distinguera pas entre les différentes populations de cellules ou leur viabilité. Pour cette raison, l’obtention d’une population très pure et viable de la cellule d’intérêt a été l’étape clé pour réussir dans ces expériences.

L’isolement...

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Discussion

Dans cet article, nous avons établi un protocole pour isoler et cultiver efficacement les cellules NK primaires primaires pures et viables du sang périphérique. Nous avons également optimisé les conditions pour la mesure de l’activité métabolique de ces cellules NK évaluées par le taux de consommation d’oxygène et le taux d’acidification extracellulaire en utilisant un analyseur de flux extracellulaire. Par rapport à d’autres méthodes respiratoires, l’analyseur de flux extracellulaire est rapide, nécessite un petit nombr...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) pour leur soutien et leur discussion. Cette étude a été soutenue par les programmes de recherche intra-muros des National Institutes of Health, de l’Institut national du cancer et du National Heart, Lung, and Blood Institute. JT est soutenu par le programme Ramon y Cajal (subvention RYC2018-026050-I) de MICINN (Espagne).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-Deoxy-D-glucose (2-DG)MilliporeSigmaD8375-5GGlycolyisis Glycolyis, composé d’injection
2,4-Dinotrophénol (2,4-DNP)MilliporeSigmaD198501ETC : désaccoupleur / test de stress mitochondrial : composé d’injecteur
96 puits : Plaque de culture cellulaire / Fond rond avec couvercleCostar3799Culture cellulaire NK
Antimycine AMilliporeSigmaA8674Inhibiteur du complexe III / glycolyse et test de stress mitochondrial
composé injecteur BD FACSDIVA SoftwareBD BiosciencesAcquisition de données
de flux BD LSR FortessaBD BiosciencesAcquisition de données de flux
Cell-TakCorning354240Adhésif cellulaire
CyQUANT essai de prolifération cellulaireThermoFisher ScientificC7026Essai de prolifération cellulaire pour la quantification de l’ADN. Contient un tampon de lyse cellulaire et un colorant CyQUANT GR
EasySep Human CD3 Positive Selection Kit IITechnologies de cellules souches17851Isolement de cellules NK à partir de PBMC
Kit d’enrichissement de cellules NK humaines EasySepTechnologies de cellules souches19055Isolement de cellules NK à partir de PBMC
EasySep Aimant Technologiescellules souches18001Isolement de cellules NK à partir de PBMC
EDTA 0,5 M, pH 8Qualité Biologique10128-446NK vendre tampon de séparation
Tubes FACSFalcon-Fisher Scientific352235Expérience de cytométrie en flux
Falcon 50 ml Tubes coniquesFalcon-Fisher Scientific14-432-22Séparation cellulaire NK
Sérum de veau fœtal (FCS)Gibco10437-028Tampon de séparation cellulaire NK
FlowJo SoftwareBD BiosciencesAnalyse des données de flux
GlucoseMilliporeSigmaG8270Composant du milieu de test de stress mitochondrial. Glycolyse test d’effort composé injecteur
Halt Protease Inhibitor CocktailThermoFisher Scientific78429Inhibiteur de protéase 100X. Utilisation dans le tampon de lyse RIPA
Humain IL-15Peprotech200-15-50ugStimulation cellulaire NK
Sérum humain (HS)Valley Biomedical9C0539Supplément de milieu de culture cellulaire
NK IMDMGibco12440053NK cell milieu de culture
L-Glutamine (200 mM)ThermoFisher Scientific25030-081Composant du milieu de test d’effort
LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain KitThermoFisher ScientificL34965Colorant de viabilité pour coloration par cytométrie en flux
LSMmpbio50494XPBMC séparation du sang humain
Souris anti-humain CD3 BV711BD Biosciences563725Coloration par cytométrie en flux des lymphocytes T
anti-humaine CD56 PEBD Pharmingen555516NK Coloration par cytométrie en flux NKp46
PEBD Pharmingen557991NK
OligomycineMilliporeSigma75351Inhibiteur du complexe V / test de stress mitochondrial Composé injecteur
PBS pH 7,4Gibco10010-023Cellule NK tampon de séparation
Pierce BCA Protein Assay KitThermoFisher Scientific23225Pour la détermination de la concentration en protéines
Tampon RIPABoston BioProductsBP-115Lyse cellulaire
RotenoneMilliporeSigmaR8875Inhibiteur du complexe II / glycolyse et test de stress mitochondrial composé d’injection
Seahorse Wave Controller SoftwareAgilentContrôleur pour l’analyseur Seahorse XFe96
Logiciel de bureau Seahorse WaveAgilentPour l’analyse de données
Seahorse XF Base MediumAgilent102353-100Base de test de flux extracellulaire moyenne
Analyseur Seahorse XFe96 AnalyseurAgilentAnalyseur de flux extracellulaire
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent102416-100Comprend 20 plaques de culture cellulaire XF96, 18 cartouches de capteur XFe96, des guides de chargement pour le transfert des composés vers la cartouche de dosage et 1 flacon de solution de calibrant (500 ml).
Bicarbonate de sodiumMilliporeSigmaS5761Pour préparer la solution Cell-Tak
Pyruvate de sodium (100 mM)ThermoFisher Scientific11360-070Composant du milieu d’essai de stress mitochondrial
de Coloration par cytométrie en flux NK

Références

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