Les formulations de poudre sèche pour inhalation ont un grand potentiel dans le traitement des maladies respiratoires. Avant d’entrer dans les études humaines, il est nécessaire d’évaluer l’efficacité de la formulation de poudre sèche dans les études précliniques. Une méthode simple et non envahissante de l’administration de la poudre sèche chez les souris par l’itinéraire intratrachéal est présentée.
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Article de méthode
Administration intratrachéale de formulation de poudre sèche chez la souris
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans le développement de formulations de poudre sèche inhalable, il est essentiel d’évaluer leurs activités biologiques dans des modèles animaux précliniques. Ce document présente une méthode non envahissante de livraison intratrachéale de formulation sèche de poudre chez les souris. Un dispositif de chargement de poudre sèche constitué d’une pointe de pipette de chargement de gel de 200 μL reliée à une seringue de 1 mL par l’intermédiaire d’un robinet d’arrêt à trois voies est présenté. Une petite quantité de poudre sèche (1-2 mg) est chargée dans la pointe de la pipette et dispersée par 0,6 mL d’air dans la seringue. Parce que les pointes de pipette sont jetables et peu coûteuses, différentes formulations de poudre sèche peuvent être chargées dans différentes pointes à l’avance. Diverses formulations peuvent être évaluées dans le cadre d’une même expérience animale sans nettoyage de l’appareil et remplissage de dose, ce qui permet de gagner du temps et d’éliminer le risque de contamination croisée par la poudre résiduelle. L’étendue de la dispersion de la poudre peut être inspectée par la quantité de poudre restant dans la pointe de la pipette. Un protocole d’intubation chez la souris avec une source lumineuse sur mesure et une canule de guidage est inclus. L’intubation appropriée est l’un des facteurs clés qui influencent l’administration intratrachéale de la formulation de poudre sèche à la région pulmonaire profonde de la souris.
Introduction
La voie pulmonaire de l’administration offre de divers avantages en fournissant la thérapeutique pour des actions locales et systémiques. Pour le traitement des maladies pulmonaires, une concentration locale élevée de médicament peut être obtenue par administration pulmonaire, réduisant ainsi la dose requise et réduisant l’incidence des effets secondaires systémiques. De plus, les activités enzymatiques relativement faibles dans les poumons peuvent réduire le métabolisme prématuré des médicaments. Les poumons sont également efficaces pour l’absorption des médicaments pour l’action systémique en raison de la grande surface bien perfusée, de la couche de cellules épithéliales extrêmement mince et du volume sanguin élevé dans les capillaires pulmonaires1.
Les formulations de poudre sèche inhalée ont été largement étudiées pour la prévention et le traitement de diverses maladies telles que l’asthme, la maladie pulmonaire obstructive chronique, le diabète sucré et la vaccination pulmonaire2,3,4. Les médicaments à l’état solide sont généralement plus stables que sous forme liquide, et les inhalateurs à poudre sèche sont plus portables et conviviaux que les nébuliseurs5,6. Dans le développement de formulations de poudre sèche inhalée, l’innocuité, le profil pharmacocinétique et l’efficacité thérapeutique doivent être évalués dans des modèles animaux précliniques après administration pulmonaire7. Contrairement aux humains qui peuvent inhaler activement de la poudre sèche, l’administration pulmonaire de poudre sèche aux petits animaux est difficile. Il est nécessaire d’établir un protocole efficace d’administration de poudre sèche aux poumons des animaux.
Les souris sont largement utilisées comme modèles animaux de recherche parce qu’elles sont économiques et qu’elles se reproduisent bien. Ils sont également faciles à manipuler et de nombreux modèles de maladies sont bien établis. Il existe deux approches principales pour administrer de la poudre sèche au poumon de la souris : l’inhalation et l’administration intratrachéale. Pour l’inhalation, la souris est placée dans une chambre du corps entier ou du nez seulement où la poudre sèche est aérosolisée et où les animaux respirent l’aérosol sans sédation8,9. Un équipement coûteux est nécessaire et l’efficacité de l’administration des médicaments est faible. Bien que la chambre du corps entier puisse être techniquement moins difficile, la chambre d’exposition du nez seulement pourrait minimiser l’exposition des médicaments à la surface du corps. Quoi qu’il en soit, il est toujours difficile de contrôler et de déterminer avec précision la dose administrée aux poumons. La poudre sèche est principalement déposée dans la région du nasopharynx où la clairance mucociliaire est proéminente10. De plus, les souris à l’intérieur de la chambre sont soumises à un stress important pendant le processus d’administration car elles sont contraintes et privées de nourriture et d’eau11. Pour l’administration intratrachéale, il s’agit généralement de l’introduction de la substance directement dans la trachée. Il existe deux techniques différentes pour y parvenir : la trachéotomie et l’intubation orotracheal. Le premier nécessite une intervention chirurgicale qui fait une incision dans la trachée, qui est invasive et rarement utilisée pour l’administration de poudre. Seule la deuxième technique est décrite ici. Par rapport à la méthode d’inhalation, l’administration intratrachéale est la méthode la plus couramment utilisée pour l’administration pulmonaire chez la souris en raison de son efficacité d’administration élevée avec une perte minimale de médicament12,13. C’est une méthode simple et rapide pour livrer avec précision une petite quantité de poudre en quelques milligrammes à la souris. Bien que la souris soit anatomiquement et physiologiquement distincte de l’homme et que l’anesthésie soit nécessaire pendant le processus d’intubation, l’administration intratrachéale contourne les voies respiratoires supérieures et offre un moyen plus efficace d’évaluer les activités biologiques de la formulation de poudre sèche telles que l’absorption pulmonaire, la biodisponibilité et les effets thérapeutiques14,15.
Pour administrer de la poudre sèche par voie intratrachéale, la souris doit être intubée, ce qui pourrait être difficile. Dans cet article, la fabrication d’un insufflateur de poudre sèche sur mesure et d’un dispositif d’intubation est décrite. Les procédures d’intubation et d’insufflation de poudre sèche dans le poumon de la souris sont démontrées.
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Protocole
Les expériences menées dans le présent rapport ont été approuvées par le Comité sur l’utilisation d’animaux vivants à des fins d’enseignement et de recherche (CULATR) de l’Université de Hong Kong. Des formulations de poudre sèche préparées par lyophilisation par pulvérisation (DFC) contenant 0,5 % d’ARN messager de luciférase (ARNm), 5 % de peptide synthétique PEG12KL4 et 94,5 % de mannitol (p/p) sont utilisées dans cette étude pour démontrer l’expression de l’ARNm dans le poumon16. Le diamètre aérodynamique médian de masse (MMAD) de la poudre sfd est de 2,4 μm. La poudre de mannitol séchée par pulvérisation (SD) est utilisée pour étudier l’effet du volume d’air utilisé dans la dispersion de poudre16. Le MMAD de la poudre SD est de 1,5 μm.
1. Fabrication d’un insufflateur de poudre sèche et chargement de poudre sèche
- (Facultatif) Neutraliser les charges statiques de la poudre sèche (dans un flacon) et de la pointe de pipette ronde à chargement de gel sans filtre de 200 μL. Utilisez un pistolet antistatique ou une balance avec fonction de désionisation selon les instructions du fabricant.
- Préparez un papier de pesée d’une taille d’environ 4 cm x 4 cm. Pliez le papier en deux en diagonale, puis dépliez-le.
- Peser 1-2 mg de poudre sèche sur le papier de pesage.
- Remplissez une pointe de pipette à chargement de gel avec de la poudre à travers l’ouverture plus large de la pointe. Appuyez doucement pour emballer la poudre jusqu’à ce que la poudre forme des agglomérats lâches près de l’extrémité étroite de la pointe (Figure 1A). Évitez d’emballer la poudre trop étroitement car elle peut entraver la dispersion de la poudre.
- Raccorder la pointe chargée en poudre à une seringue de 1 mL à l’intermédiaire d’un robinet d’arrêt à trois voies(figure 1B). La taille de la seringue peut être modifiée en fonction du volume d’air utilisé pour disperser la poudre. Tenez la pointe et la seringue verticalement pendant la connexion pour éviter le déversement de poudre. Si l’administration n’est pas effectuée immédiatement, utilisez du parafilm pour sceller les ouvertures de la pointe et conservez-la temporairement dans des conditions appropriées jusqu’à l’administration.
2. Fabrication d’un dispositif d’intubation
- Source lumineuse (Figure 2)
- Préparez une source lumineuse sur mesure avec une torche à diode électroluminescente (LED) et une fibre optique flexible d’un diamètre de 0,8 à 1 mm.
- Faites un orifice centré sur la lentille claire de la torche LED avec une perceuse à main ou un foret afin que la fibre optique puisse à peine passer à travers.
- Insérez la fibre optique à travers l’orifice. Allumez la torche LED pour ajuster la position et la profondeur d’insertion pour une luminosité maximale à l’autre extrémité de la fibre optique.
- Fixer la fibre optique en position avec de la colle époxy claire.
- Canule de guidage (Figure 3)
- Prenez une pipette Pasteur en plastique de 1 mL(figure 3A)et maintenez la pipette aux deux extrémités.
- Utilisez une lampe à alcool (ou d’autres sources de chaleur en laboratoire comme un brûleur Bunsen) pour chauffer le milieu de la pipette en la plaçant à 5-10 cm au-dessus de la flamme(figure 3B). Faites pivoter la pipette pour vous assurer qu’elle est chauffée uniformément.
- Lorsque le plastique devient doux et déformable, éloignez la pipette de la flamme et étirez doucement la pipette.
- Couper la pipette étirée au milieu à l’aide d’une paire de ciseaux dans les parties A et B(figure 3C-E). Utilisez la partie A comme pipette à pointe fine et la partie B comme canule de guidage. Pour augmenter les chances d’intubation réussie avec la canule de guidage, faites un biseau (pas trop net qui peut augmenter le risque de blesser l’animal) à la fin de la partie B(Figure 3F). Lorsqu’une pointe de pipette à chargement de gel de 200 μL (pour le chargement de poudre) est insérée dans la canule de guidage, elle doit faire saillie de 1 à 2 mm.
NOTA : Une canule de guidage (partie B) ayant la dimension appropriée (diamètre interne et externe) pour l’intubation pourrait avoir une aiguille de calibre 21 insérée à l’intérieur, tandis qu’elle peut également s’adapter à l’intérieur d’une aiguille de calibre 17. Plusieurs tentatives peuvent être nécessaires pour étirer les pipettes afin d’obtenir la dimension appropriée. - (Facultatif) : Coupez une petite ouverture à l’extrémité la plus large de la canule de guidage pour la rendre plus flexible afin qu’il soit plus facile de tenir la fibre optique(Figure 3F). Cette ouverture permet également l’installation d’un microsprayer pour l’administration d’aérosol liquide.
3. Intubation
- Anesthésier la souris (BALB/c, 7-9 semaines) avec de la kétamine (100 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg) par injection intrapéritonéale.
- Préparez une plate-forme en plexiglas et montez-la sur un support avec une pince(Figure 4A). Placez la souris anesthésiée sur la plate-forme (à environ 60° d’inclinaison) en décubitus dorsal. La hauteur et l’angle d’inclinaison de la plate-forme pourraient être ajustés par la position de la pince sur le support.
- Suspendez la souris en accrochant ses incisives sur une soie dentaire en nylon(Figure 4B). Fixez la position de la souris par un morceau de ruban adhésif ou un élastique.
- Insérez la fibre optique dans la canule de guidage avant l’intubation avec l’extrémité du niveau de fibre avec l’ouverture de la canule de guidage. Allumez la torche LED pour l’éclairer.
- Faites doucement saillie sur la langue de la souris avec une paire de pinces pour exposer sa trachée.
- Utilisez l’autre main pour tenir la canule de guidage avec une fibre optique à l’intérieur. Insérez-les dans la cavité buccale. Avec l’éclairage de la fibre optique, l’ouverture de la trachée peut être visualisée comme un orifice entre les cordes vocales.
- Aligner le biseau de la canule de guidage vers la ligne médiane de l’ouverture(figure 5A). Intuber doucement la canule de guidage avec de la fibre optique dans la trachée en visant la pointe la plus fine de la canule à l’ouverture trachéale.
- Lors de l’intubation, retirez rapidement la fibre optique et laissez la canule de guidage à l’intérieur de la trachée(figure 5B). Une respiration normale doit être observée.
- Maintenez la pipette à pointe fine (partie A) à l’ouverture de la canule de guidage et étouffez une petite bouffée d’air (environ 0,2 mL) dans le poumon de la souris. Une légère inflation dans la poitrine de la souris indique une intubation appropriée. Retirez la pipette à pointe fine avant l’administration de poudre.
4. Administration de poudre
- Tenez la poudrière chargée qui est reliée à la seringue comme décrit à l’étape 1.5. Assurez-vous que le flux d’air entre la seringue et la pointe est déconnecté.
- Tirez le piston de la seringue vers l’arrière pour retirer 0,6 mL d’air.
NOTA : Le volume d’air utilisé pour disperser la poudre dépend des propriétés de la poudre et de la quantité de poudre chargée. Ceci est décrit plus en détail dans la section des résultats. - Tournez la valve du robinet d’arrêt à trois voies pour connecter le flux d’air entre la seringue et la pointe chargée de poudre.
- Insérez la pointe chargée de poudre dans la canule de guidage qui a déjà été placée dans la trachée de la souris(figure 5C). Tenez la canule de guidage et poussez le piston de la seringue avec force en une seule action continue pour disperser la poudre sous forme d’aérosols dans le poumon.
NOTA : Tout mouvement vers l’avant de l’instrument doit être réduit au minimum afin d’éviter de blesser l’animal. - Retirez la pointe et vérifiez si la poudre à l’intérieur de la pointe a été vidée. Si ce n’est pas le cas, répétez les étapes 4.1 à 4.4.
REMARQUE: Si la poudre est emballée trop étroitement en raison d’un tapotement excessif, il se peut qu’elle ne soit pas dispersée correctement. - Une fois l’administration terminée, retirez la canule directrice de la trachée.
- Laissez la souris récupérer en la positionnant horizontalement en décubitus dorsal avec sa langue à moitié saillante pour éviter le blocage des voies respiratoires.
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Résultats
Lorsqu’un insufflateur de poudre sèche est utilisé pour administrer un aérosol de poudre aux poumons d’un animal, le volume d’air utilisé est essentiel car il affecte la sécurité ainsi que l’efficacité de la dispersion de la poudre. Pour optimiser la méthode, différents volumes d’air (0,3 mL, 0,6 mL et 1,0 mL) ont été utilisés pour disperser la poudre sèche (1 mg de mannitol séché par pulvérisation) et le poids des souris a été surveillé pendant 48 heures après l’administration(figure 6). L’...
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Discussion
En ce document, des dispositifs faits sur mesure pour l’insufflation sèche de poudre et l’intubation intratrachéale sont présentés. Dans l’étape de chargement de la poudre, la poudre sèche est chargée dans une pointe de pipette de chargement de gel de 200 μL. Il est important de taper doucement la pointe pour permettre l’emballage en vrac de poudre à l’extrémité étroite de la pointe. Cependant, si la poudre est emballée trop étroitement, ils resteront coincés dans la pointe et ne pourront pas être correctement dispersés....
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Les auteurs tiennent à remercier M. Ray Lee, M. HC Leung et M. Wallace So pour leur aimable aide dans la fabrication de la source lumineuse et de l’insufflateur de poudre; et l’installation de base de la faculté pour l’aide en imagerie animale. Les travaux ont été soutenus par le Research Grant Council, Hong Kong (17300319).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| souris BALB/c Femelle | ; 7-9 semaines ; Poids corporel 20-25 g | ||
| CleanCap Firefly Luciferase mRNA | TriLink Biotechnology | L-7602 | |
| Insufflateur de poudre sèche | PennCentury | Modèle DP-4M | |
| Kétamine 10 % | Alfasan International B.V. | ||
| Torche à diodes électroluminescentes (LED) | Unilite Internation | PS-K1 | |
| Mannitol (Pearlitol 160C) | Roquette | 450001 | |
| Pointe de pipette ronde à chargement de gel sans filtre (200 µ ; L) | Labcon | 1034-800-000 | |
| Fil | en nylon Reach | 30017050 | |
| Seringue d’un millilitre sans aiguille | Terumo | SS-01T | |
| Fibre optique | Fibre OMPF1000 | ||
| PEG12KL4 peptide | EZ Biolab | (PEG12)-KLLLLLLKLLLLLKLLLLK-NH2 | |
| Pipette en plastique Pasteur à pointe fine | Alpha Labotatories | LW4061 | |
| Robinet d’arrêt à trois voies | Braun | D201 | |
| Xylazine 2 % | Alfasan International B.V. | ||
| NA Zerostat 3 pistolet antistatique | MILTY | 5036694022153 |
Références
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Réimpressions et autorisations
