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Article de méthode

Stratégie phosphoproteomic pour profiler la signalisation osmotique de stress dans Arabidopsis

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DOI :

10.3791/61489

⸱

25 juin 2020

 ,  ,  , 
1Department of Plant Biology, Carnegie Institute for Science, 2Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Kyoto University, 3Department of Biochemistry, Purdue University, 4Department of Chemistry, Purdue University, 5Shanghai Center for Plant Stress Biology, CAS Center for Excellence in Molecular Plant Sciences, Chinese Academy of Sciences

Dans cet article

Résumé

Présenté ici est une approche phosphoproteomic, à savoir arrêter et aller pointe d’extraction à base de phosphoproteomic, qui fournit un haut débit et une couverture profonde du phosphoprotéome Arabidopsis. Cette approche délimite la vue d’ensemble de la signalisation osmotique de stress dans Arabidopsis.

Résumé

La phosphorylation des protéines est cruciale pour la régulation de l’activité enzymatique et de l’expression des gènes dans un état osmotique. La spectrométrie de masse (MS) à base de phosphoproteomics a transformé la façon d’étudier la transduction du signal végétal. Toutefois, l’exigence d’un grand nombre de matériaux de départ et d’un temps de mesure prolongé de la SP pour atteindre la profondeur de la couverture a été le facteur limitant pour l’étude à haut débit des changements phosphoproteomic mondiaux dans les plantes. Afin d’améliorer la sensibilité et le débit de la phosphoproteomics végétale, nous avons mis au point une approche phosphoproteomics à base de pointes d’extraction (étape) couplée à l’étiquetage Tandem Mass Tag (TMT) pour l’analyse rapide et complète de la perturbation de la phosphorylation des plantes en réponse au stress osmotique. Tirant parti de la simplicité et du débit élevé de la technique de pointe de scène, l’ensemble de la procédure prend environ une heure en utilisant deux pointes pour terminer l’enrichissement du phosphopeptide, la fractionnement et les étapes de nettoyage de l’échantillon, ce qui suggère une utilisation facile à utiliser et une grande efficacité de l’approche. Cette approche fournit non seulement une analyse approfondie de la phosphoproteomics végétale (> 11 000 identification au phosphopeptide), mais démontre également l’efficacité supérieure de séparation (< chevauchement de 5 % ) entre les fractions adjacentes. En outre, le multiplexage a été réalisé à l’aide de l’étiquetage TMT pour quantifier les changements phosphoproteomic des plantes mutantes de type sauvage et de snrk2 decuple. Cette approche a été utilisée avec succès pour révéler les événements de phosphorylation des kinases de type Raf en réponse au stress osmotique, qui met en lumière la compréhension de la signalisation osmotique précoce chez les plantes terrestres.

Introduction

La salinité élevée, la basse température et la sécheresse causent des contraintes osmotiques, qui est un facteur environnemental majeur qui affecte la productivitédes plantes 1,2. La phosphorylation des protéines est l’une des modifications post-translationnelles les plus significatives qui médient la perception et la transduction du signal dans la réponse des plantes au stressosmotique 3,4,5. Kinase 2s de protéine SNF1-connexe (SnRK2s) sont impliqués dans le stress osmotique signalant6. Neuf des dix membres de la famille SnRK2 montrent une activation significative en réponse au stressosmotique 7,8. Le snrk2.1/2/3/4/5/6/7/8/9/10 decuple(snrk2-dec)mutant ayant des mutations dans les dix SnRK2 a montré l’hypersensibilité au stress osmotique. Chez le mutant snrk2-dec, l’accumulation osmotique induite par le stress de l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP3),de la biosynthèse de l’acide abscisique (ABA) et des expressions géniques est fortement réduite, mettant en évidence le rôle vital des SnRK2 dans les réponses osmotiques au stress6. Cependant, on ne sait toujours pas comment les kinases SnRK2s régulent ces processus biologiques. Le profilage des changements phosphoproteomic en réponse au stress osmotique est un moyen efficace de combler cet écart et de délimifier les mécanismes de défense osmotiques déclenchés par le stress chez les plantes.

La spectrométrie de masse (SP) est une technique puissante pour cartographier le phosphoproteomevégétal 9. La caractérisation du phosphoproteomics végétal, cependant, reste un défi dû à la gamme dynamique du protéome végétal et à la complexité du lysatevégétal 4. Pour surmonter ces défis, nous avons développé un flux de travail phosphoproteomic végétal universel, qui élimine les interférences indésirables telles que des pigments photosynthétiques et des métabolites secondaires, et permettant la couverture profonde du phosphoproteomevégétal 10. Plusieurs méthodes d’enrichissement du phosphopeptide telles que la chromatographie d’affinité irationnelle métallique immobilisée (IMAC) et la chromatographie par oxyde métallique (MOC) ont été développées pour enrichir les phosphopeptides avant l’analyse de la SP11,12,13,14,15,16. Les non-phosphopeptides acides co-purifiant avec les phosphopeptides sont les principales interférences pour la détection du phosphopeptide. Auparavant, nous avons normalisé la valeur du pH et la concentration d’acide organique du tampon de chargement IMAC afin d’éliminer la liaison des non-phosphopeptides, afin d’obtenir plus de 90 % de spécificité d’enrichissement en contournant l’étape de pré-fractionnement11.

La perte d’échantillon dans le processus en plusieurs étapes de l’enrichissement et de la fractionnement de phosphopeptide entrave la sensibilité de l’identification de phosphopeptide et la profondeur de la couverture phosphoproteomic. Les pointes d’arrêt et d’extraction (pointes d’étape) sont des bouts de pipette qui contiennent de petits disques pour plafonner l’extrémité de la pointe, qui peuvent être incorporés avec la chromatographie pour la fractionnement de peptide et lenettoyage 17. La perte d’échantillon pendant la procédure de pointe de l’étape peut être réduite au minimum en évitant le transfert d’échantillon entre les tubes. Nous avons mis en œuvre avec succès la pointe de stade dans Ga3+-IMAC et Fe3+-IMAC pour séparer les peptides phosphorylatés multiples abondants bas des peptides phosphorylatés singly, qui ont amélioré la profondeur du phosphoproteomehumain 15. En outre, l’utilisation de la pointe de phase inversée à pH élevé (Hp-RP) a démontré la couverture plus large du protéome de membrane humaine comparée à celle de l’échange fort de cation (SCX) et de la chromatographie forte d’échange d’anion (SAX)18. Par conséquent, l’intégration des techniques de pointe de scène IMAC et Hp-RP peut augmenter la couverture du phosphoprotéome végétal avec simplicité, haute spécificité et débit élevé. Nous avons démontré que cette stratégie a permis d’identifier plus de 20 000 sites de phosphorylation provenant de semis d’Arabidopsis, ce qui représente une profondeur accrue du phosphoprotéomevégétal 19.

Ici, nous rapportons un protocole phosphoproteomic basé sur la pointe de étape pour le profilage phosphoproteomic dans Arabidopsis. Ce flux de travail a été appliqué pour étudier la perturbation phosphoproteomic des semis mutants de type sauvage et de snrk2-dec en réponse au stress osmotique. L’analyse phosphoproteomic a indiqué les emplacements de phosphorylation impliqués dans l’activation de kinase et la signalisation osmotic tôt de stress. L’analyse comparative des données de phosphoproteome mutant de type sauvage et de snrk2-dec a mené à la découverte d’une cascade de kinase raf-like (RAF)-SnRK2 qui joue un rôle clé dans la signalisation de stress d’osmore dans les usines élevées.

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Protocole

1. Préparation de l’échantillon

  1. Récolter les semis traités à la lutte et au stress (1 g) dans une feuille d’aluminium et congeler les échantillons dans de l’azote liquide.
    REMARQUE : Une concentration plus élevée en protéines est habituellement observée chez les semis vieux de deux semaines que chez les plantes matures. Un gramme de semis génère environ 10 mg de lysate protéique, ce qui est suffisant pour l’analyse de la SP. Toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 16 000 x g à l’étape 1.
  2. Moudre les semis congelés en poudre fine à l’aide d’un mortier et d’un pilon remplis d’azote liquide.
  3. Ajouter 1 mL de tampon de lyse ((6 M guanidine-HCl en 100 mM Tris-HCl, pH 8.5) avec 10 mM Tris (2 carboxyethyl)phosphine hydrochlorure (TCEP), 40 mM 2-chloroacetamide (CAA), inhibiteur de la protéase et cocktails inhibiteurs de la phosphatase) au mortier et mélanger à l’aide d’un pilon.
  4. Transférer le lysate de la plante dans un tube de 1,5 mL et chauffer à 95 °C pendant 5 min.
  5. Placer le tube sur la glace pendant 10 min. Sonicate le tube sur la glace pendant 10 s, pause pendant 10 s, et répéter trois fois.
  6. Centrifuger le tube pendant 20 min et aliquot 150 μL de lysate végétal dans un tube de 1,5 mL.
  7. Ajouter 600 μL de 100% de méthanol dans le tube. Vortex et tourner dans le tube.
  8. Ajouter 150 μL de chloroforme à 100 % dans le tube. Vortex et tourner dans le tube.
  9. Ajouter 450 μL de ddH2O dans le tube. Vortex et centrifugeuse du tube pendant 3 min.
  10. Jetez la couche aqueuse supérieure. Ajouter 600 μL de 100% de méthanol dans le tube. Centrifuger le tube pendant 3 min, puis jeter la solution.
  11. Laver les granulés de protéines avec 600 μL de 100 % de méthanol. Jetez la solution et séchez l’air de la pastille protéique.
  12. Resuspendez les granulés de protéines en 600 μL de tampon de digestion (désoxycholate de sodium (DDC) de 12 mM/12 mM de sarcosine lauroyle de sodium (SLS) en 100 mM Tris-HCl, pH 8,5). Sonicate le tube jusqu’à ce que la suspension soit homogénéisée.
  13. Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un kit BCA et ajustez la concentration à 4 μg/μL avec le tampon de digestion. Transférer 100 μL de lysate (protéines de 400 μg) dans un nouveau tube.
  14. Ajouter 292 μL de bicarbonate de triéthylammonium de 50 mM (TEAB) et 8 μL de Lys-C (2,5 unité/mL) au tube. Incuber le tube à 37 °C pendant 3 h.
  15. Ajouter 100 μL de TEAB de 50 mM avec 8 trypsines de μg au tube. Incuber le tube à 37 °C pendant 12 h.
  16. Ajouter 25 μL d’acide trifluoroacétique (ALE) à 10 % au tube. Vortex et centrifugeuse du tube pendant 20 min à 4 °C.
  17. Transférer le supernatant dans une colonne de dessalage conditionnée pour le desalage. Séchez l’élixate à l’aide d’un concentrateur de centrifugeuse sous vide.
    REMARQUE : Activez la résine avec 1 mL de méthanol suivi de 1 mL de 0,1 % de TFA dans 80 % d’acétyltrile (ACN). Laver le solvant organique avec au moins 3 mL de 0,1 % d’ALE dans 5 % d’ACN. Chargez les échantillons acidifiés de peptide préparés à l’étape 1.16 dans la colonne, puis lavez la colonne avec au moins 3 mL de TFA de 0,1 % dans 5 % d’ACN. D’autres lavages peuvent être nécessaires pour les échantillons à forte concentration de sel. Elute les phosphopeptides avec 1 mL de 0,1% de TFA dans 80% ACN.

2. Étiquetage tandem mass tag (TMT)

  1. Resuspendez les peptides séchés en 100 μL de 200 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES), pH 8.5.
  2. Dissoudre le réagencé TMT de chaque canal (0,8 mg) dans 40 μL d’ACN anhydre. Vortex le tube de reagent TMT pendant 5 min et tournez-le vers le bas.
  3. Transférer 40 μL de TMT dans le tube de l’échantillon et incuber pendant 1 h à température ambiante.
    REMARQUE : Dans cette expérience, le canal 126 à 128 a été étiqueté avec trois répliques biologiques des plantes sans traitement de mannitol, et le canal 129 à 131 ont été étiquetés avec trois répétitions biologiques des usines avec le traitement de mannitol.
  4. Ajouter 8 μL d’hydroxylamine à 5 % et incuber pendant 15 min.
  5. Mélanger 6 échantillons dans un tube de 5 mL et ajouter 14 μL de 10 % de TFA.
  6. Ajouter 3 876 μL de 0,1 % de TFA au tube. Vortex et spin down.
  7. Transférez la solution dans une colonne de dessalage conditionnée pour le dessalage. Séchez l’allongement à l’aide d’un évaporateur.

3. Préparation de la pointe de scène de l’IMAC

  1. Utilisez une aiguille émoussée de 16 G pour pénétrer dans un disque frit en polypropylène.
    REMARQUE : Maintenez le cutter perpendiculairement à la surface du disque et roulez le coupeur quelques fois pour vous assurer que le disque est complètement excisé. Placer le disque dans une boîte de Pétri pour le stockage. Placez l’aiguille dans une pointe de pipette de 200 μL et poussez la frite dans la pointe à l’aide d’un piston.
  2. Appuyez doucement sur la frite dans la pointe à l’aide d’un piston pour couronner l’extrémité de la pointe.
    1. Placez le disque frit dans des pointes avec la même pression, ce qui offre une meilleure reproductibilité. La reproductibilité de la production de pointes de stade est importante pour la pression constante du dos, ce qui affecte le moment des étapes de centrifugeuse et la reproductibilité entre les répliques techniques.
    2. Si les pointes de scène montrent une pression arrière élevée pendant l’étape de conditionnement, jetez les pointes pour éviter l’obstruction potentielle de pointe lors du chargement des échantillons. Il se peut que le disque ait été pressé trop fort en position.
  3. Inverser la colonne de spin Ni-NTA et la placer sur un tube de 1,5 mL.
  4. Utilisez un piston pour presser doucement la frite de perles Ni-NTA et pousser les perles dans le tube.
    REMARQUE : Assurez-vous de pousser le frit doucement pour éviter la perte potentielle de perles ou l’adsorption sur la colonne de rotation.

4. Préparation de la pointe d’étape hp-RP

  1. Préparez la pointe de scène Hp-RP telle que décrite pour la pointe de scène IMAC à l’aide d’un disque C8.
    REMARQUE : N’appliquez pas une grande force sur le disque, car cela peut entraîner une frite densément emballée et augmenter la pression arrière de la pointe de la scène. Toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 1 000 x g pendant 5 minutes à l’étape 4.
  2. Suspendre 1 mg de perles C18 dans 100 μL 100% méthanol et passer la solution perles à travers la pointe.
  3. Ajouter 20 μL de tampon 8 (80% ACN/20% 200 mM NH4HCO2, pH 10.0) à la pointe de l’étape et passer tampon 8 à travers la pointe par centrifugation.
  4. Ajouter 20 μL de tampon A (200 mM NH4HCO2) à la pointe de l’étape et passer le tampon A à travers la pointe par centrifugation.
    REMARQUE : Équilibrez la centrifugeuse pendant l’utilisation et assurez-vous que la pointe de l’étape Hp-RP n’est pas complètement séchée.

5. Préparation de l’adaptateur de spin

  1. Utilisez des pinces à épiler pointues pour percer un trou au centre du couvercle d’un tube de 1,5 mL.
  2. Insérez la pointe de scène IMAC ou la pointe de scène Hp-RP dans le trou de l’adaptateur de spin.
    REMARQUE : Assurez-vous que la pointe de la scène n’est pas près du fond de l’adaptateur de spin.

6. Enrichissement au phosphopeptide à l’aide de la pointe du stade IMAC

  1. Suspendre les perles Ni-NTA de 10 mg avec 400 μL de tampon de chargement (6 % d’acide acétique (AA), pH 3,0) et charger toutes les perles de solution par pointe. Passez la solution à travers la pointe par centrifugation.
    REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 200 x g pendant 3 min à l’étape 6 en plus de l’étape 6.8.
  2. Chargez 100 μL d’acide éthylèneediaminetetraacetic de 50 mM (EDTA) pour dépouiller les ions nickel de la pointe du stade IMAC et passer la solution à travers la pointe par centrifugation.
  3. Chargez 100 μL de tampon de chargement jusqu’à la pointe de l’étape et passez la solution à travers la pointe par centrifugation.
  4. Chargez 100 μL de 50 mM FeCl3 en 6% AA jusqu’à la pointe du stade et passez la solution à travers la pointe par centrifugation. Fe3+ ions se chélate à la pointe étape IMAC.
  5. Chargez 100 μL de tampon de chargement pour conditionner la pointe de l’étape et passer la solution à travers la pointe par centrifugation.
  6. Chargez 100 μL de tampon de chargement avec des peptides d’échantillon préparés à l’étape 2.7 jusqu’à la pointe de l’étape et passez la solution à travers la pointe par centrifugation.
    REMARQUE : Prenez un nouveau tube comme adaptateur de spin pour recueillir l’écoulement de l’échantillon et entreposer le flux dans le congélateur pour une analyse future.
  7. Chargez 100 μL de tampon de lavage (4,5% AA et 25% ACN) jusqu’à la pointe du stade et passez la solution à travers la pointe par centrifugation.
  8. Effectuez le deuxième lavage avec tampon de chargement. Chargez 100 μL de tampon de chargement jusqu’à la pointe du stade et passez la solution à travers la pointe à l’aide de 1000 × g centrifugeuse pendant 3 min.
    REMARQUE : Assurez-vous que le tampon de lavage est remplacé par un tampon de chargement dans la pointe de l’étape afin d’éliminer la perte de phosphopeptides pendant l’étape d’élitution. Equilibrer la pointe du stade de l’IMAC avant l’éution du phosphopeptide pour s’assurer que la concentration d’ACN est inférieure à 5 %.
  9. Coupez la pointe de scène IMAC à l’avant avec un ciseaux et placez la pointe de scène IMAC taillée à l’intérieur de la pointe Hp-RP. Assurez-vous que les deux couches de pointes de scène ne touchent pas le couvercle de la centrifugeuse.

7. Fractionnement du phosphopeptide à l’aide de la pointe de l’étape Hp-RP C18

  1. Ajouter 100 μL de tampon d’élitution (phosphate d’ammonium de 200 mM (NH4H2PO4))à la pointe de scène IMAC parée et passer la solution à travers les deux couches de pointes de scène par centrifugation.
    REMARQUE : Si la solution ne passe pas à travers la pointe de l’étape, augmentez la vitesse de rotation vers le bas. Toutes les étapes de centrifugation ont lieu à 1 000 x g pendant 5 minutes à l’étape 7. Tous les tampons Hp-RP sont répertoriés dans le tableau 1.
  2. Jetez la pointe de scène IMAC à l’aide d’une pince à épiler et ajoutez 20 μL de tampon A à la pointe de l’étape Hp-RP et passez le tampon à travers la pointe par centrifugation.
    REMARQUE : Assurez-vous que tout le tampon d’éution passe à travers la pointe de l’étape IMAC avant de la jeter.
  3. Ajouter 20 μL de tampon 1 à la fraction 1 et recueillir l’élitate dans un nouveau tube par centrifugation. Répétez le processus avec les tampons 2, 3, 4, 5, 6, 7 et 8 pour recueillir chaque fraction dans un nouveau tube. Séchez l’allongement final de chaque fraction à l’aide d’un concentrateur à vide.
    REMARQUE : Préparez de nouveaux tampons de fractionnement. Prenez 8 nouveaux tubes comme adaptateur de spin de chaque fraction. Recueillir l’allongement de chaque fraction dans un adaptateur de spin différent. Les phosphopeptides ne sont pas stables dans des conditions de base, de sorte que sécher les évasés par un concentrateur ou acidifié par 10% TFA immédiatement.

8. Analyse LC-MS/MS et analyse des données

  1. Ajouter 5 μL d’acide formique (FA) de 0,1 % et analyser l’échantillon à l’amiomètre de masse.
  2. Exécutez un gradient de 90 min avec un tampon B de 6 à 30 % (80 % d’ACN et 0,1 % de FA) pour chaque fraction.
  3. Fragmenter les 10 peptides les plus marqués à l’aide d’une dissociation énergétique à haute collision (HCD). Effectuer une recherche de base de données pour identifier les sites de phosphorylation.
  4. Chargez les fichiers bruts dans le logiciel MaxQuant, nommez les expériences et définissez des fractions et PTM.
    REMARQUE: Le tutoriel du logiciel MaxQuant peut être trouvé à https://www.maxquant.org/.
  5. Sélectionnez reporter ion MS2 dans le type de LC-MS/MS run et 6plex TMT sous forme d’étiquettes isobariques. Activer le filtre par fonction PIF et définir le min PIF comme 0,75.
  6. Sélectionnez Acétyl (protéine N-term), oxydation (M) et phospho (STY) au panneau de modifications variables. Sélectionnez Carbamidomethyl (C) comme modifications fixes.
  7. Définissez le mode de digestion comme spécifique, sélectionnez Trypsin/P comme enzyme de digestion, et deux clivages manqués.
  8. Définissez le taux de fausse découverte psm (FDR) et la protéine FDR comme 0,01. Définissez le score minimum pour les peptides modifiés comme 40.
  9. Ajoutez la base de données Arabidopsis thaliana au panel de fichiers fasta et exécutez la recherche de bases de données.
  10. Chargez le fichier txt des sites Phospho (STY) sur le logiciel Perseus au fur et à mesure que la recherche est effectuée.
    REMARQUE : Les didacticiels détaillés du logiciel Persée peuvent être trouvés https://www.maxquant.org/perseus/.
  11. Filtrer les sites de phosphorylation inverse. Filtrer les sites de phosphorylation non localisés en utilisant la probabilité de localisation de 75 % comme coupure.
  12. Utiliser les intensités des sites de phosphorylation pour l’analyse statistique.

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Résultats

Pour démontrer les performances de ce flux de travail, nous avons exploité la pointe de scène IMAC couplée à la fractionnement de pointe de stade Hp-RP pour mesurer les changements phosphoproteomic dans les semis mutants de type sauvage et snrk2-dec avec ou sans traitement de mannitol pendant 30 minutes. Chaque échantillon a été effectué dans des triplicates biologiques, et le flux de travail expérimental est représenté à la figure 1. Les peptides digérés (400 μg) de chaque échantil...

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Discussion

La plage dynamique et la complexité du protéome végétal et du phosphoprotéome sont toujours un facteur limitant à la profondeur des analyses phosphoproteomics. Malgré la capacité de l’analyse LC-MS/MS à durée unique d’identifier 10 000 sites de phosphorylation21,22, la couverture de l’ensemble du phosphoprotéome végétal est encore limitée. Par conséquent, un flux de travail phosphoproteomic qui fournit une sensibilité élevée et une efficacité de séparation supéri...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par le Programme de recherche stratégique prioritaire de l’Académie chinoise des sciences, Grant XDB27040106.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de 1,5 mLeppendorf22431081Protein LoBind, 1,5 mL, PCR propre, incolore, 100 tubes
200 µ ; Pointe de pipette en LGilsonF1739311
2-chloroacétamideSigma-AldrichC0267
acide acétiqueSigma-Aldrich5438080100
acétonitrileSigma-Aldrich271004
hydroxyde d’ammoniumSigma-Aldrich338818
phosphate d’ammonium monbasicSigma-Aldrich216003
Kit de dosage des protéines BCAThermo Fisher Scientific23227
aiguille à extrémité émousséeHamilton90516moyeu Kel-F (KF), style de pointe 3, calibre 16
billes C18-AQDr. MaischReproSil-Pur-C18-AQ 5 µ ; m
C8 Empore disk3 M221447 mm
Centrifugeuseeppendorf22620444
chloroformeSigma-AldrichCX1058
d’analyse de donnéesPerseus 1.6.2.1
éthylènediamineacide tétraacétique (EDTA)Sigma-Aldrich
formic acideSigma-Aldrich5330020050
FritsAgilent12131024Frits pour cartouches SPE
Chlorhydrate de guanidineSigma-Aldrich50933
H2OSigma-Aldrich1153334000
HEPESSigma-AldrichH3375
Chlorure de fer (III)Sigma-Aldrich157740
LTQ-orbitrapThermo Fisher ScientificSpectromètre de masse Velos Pro
Thermo Fisher ScientificLTQ-Orbitrap Velos Pro
méthanolSigma-Aldrich34860
nano LCThermo Fisher ScientificEasy-nLC 1000
Ni-NTAcolonne de spin Qiagen31014
N-Lauroylsarcosine sel de sodiumSigma-AldrichL9150
pistonHamilton1122-01Ensemble de piston N, RN, LT, LTN pour modèle 1702 (25 &mu ; l)
de moteur de rechercheMaxQuant 1.5.4.1https://www.maxquant.org
SEP-PAK Cartouche 50 mgWatersWAT054960
désoxycholatede sodium Sigma-AldrichD6750
SpeedVacThermo Fisher ScientificSPD121P
TMT 6-plexThermo Fisher Scientific90061
Tampon de bicarbonate de triéthylammoniumSigma-AldrichT7408
Acide trifluoroacétiqueSigma-Aldrich91707
Chlorhydrate de tris(2-carboxyéthyl)phosphineSigma-AldrichC4706
Chlorhydrate de trizmaSigma-AldrichT3253
logiciel https://maxquant.net/perseus/logiciel

Références

  1. Hasegawa, P. M., Bressan, R. A., Zhu, J. K., Bohnert, H. J. Plant cellular and molecular responses to high salinity. Annual Review Plant Physiology Plant Molecualr Biology. 51, 463-499 (2000).
  2. Janmohammadi, M., Zolla, L., Rinalducci, S. Low temperature tolerance in plants: Changes at the protein level. Phytochemistry. 117, 76-89 (2015).
  3. Umezawa, T., Takahashi, F., Shinozaki, K. Phosphorylation networks in the abscisic acid signaling pathway. Enzymes. 35, 27-56 (2014).
  4. Silva-Sanchez, C., Li, H., Chen, S. Recent advances and challenges in plant phosphoproteomics. Proteomics. 15 (5-6), 1127-1141 (2015).
  5. Wang, P., et al. Mapping proteome-wide targets of protein kinases in plant stress responses. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (6), 3270-3280 (2020).
  6. Fujii, H., Verslues, P. E., Zhu, J. K. Arabidopsis decuple mutant reveals the importance of SnRK2 kinases in osmotic stress responses in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1717-1722 (2011).
  7. Wang, P., et al. Quantitative phosphoproteomics identifies SnRK2 protein kinase substrates and reveals the effectors of abscisic acid action. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (27), 11205-11210 (2013).
  8. Boudsocq, M., Barbier-Brygoo, H., Lauriere, C. Identification of nine sucrose nonfermenting 1-related protein kinases 2 activated by hyperosmotic and saline stresses in Arabidopsis thaliana. Journal of Biological Chemistry. 279 (40), 41758-41766 (2004).
  9. Li, J., Silva-Sanchez, C., Zhang, T., Chen, S., Li, H. Phosphoproteomics technologies and applications in plant biology research. Frontiers in Plant Science. 6, 430(2015).
  10. Hsu, C. C., et al. Universal plant phosphoproteomics workflow and its application to Tomato signaling in response to cold stress. Molecular & Cell Proteomics. 17 (10), 2068(2018).
  11. Tsai, C. F., et al. Immobilized metal affinity chromatography revisited: pH/acid control toward high selectivity in phosphoproteomics. Journal of Proteome Research. 7 (9), 4058-4069 (2008).
  12. Larsen, M. R., Thingholm, T. E., Jensen, O. N., Roepstorff, P., Jorgensen, T. J. Highly selective enrichment of phosphorylated peptides from peptide mixtures using titanium dioxide microcolumns. Molecular & Cell Proteomics. 4 (7), 873-886 (2005).
  13. Ruprecht, B., et al. Comprehensive and reproducible phosphopeptide enrichment using iron immobilized metal ion affinity chromatography (Fe-IMAC) columns. Molecular & Cell Proteomics. 14 (1), 205-215 (2015).
  14. Sugiyama, N., et al. Phosphopeptide enrichment by aliphatic hydroxy acid-modified metal oxide chromatography for nano-LC-MS/MS in proteomics applications. Molecular & Cell Proteomics. 6 (6), 1103-1109 (2007).
  15. Tsai, C. F., et al. Sequential phosphoproteomic enrichment through complementary metal-directed immobilized metal ion affinity chromatography. Analytical Chemistry. 86 (1), 685-693 (2014).
  16. Zhou, H., et al. Enhancing the identification of phosphopeptides from putative basophilic kinase substrates using Ti (IV) based IMAC enrichment. Molecular & Cell Proteomics. 10 (10), (2011).
  17. Rappsilber, J., Mann, M., Ishihama, Y. Protocol for micro-purification, enrichment, pre-fractionation and storage of peptides for proteomics using StageTips. Nature Protocols. 2 (8), 1896-1906 (2007).
  18. Dimayacyac-Esleta, B. R., et al. Rapid high-pH reverse phase stageTip for sensitive small-scale membrane proteomic profiling. Analytical Chemistry. 87 (24), 12016-12023 (2015).
  19. Wang, P., et al. Reciprocal regulation of the TOR Kinase and ABA receptor balances plant growth and stress response. Molecular Cell. 69 (1), 100-112 (2018).
  20. Lin, Z., et al. A RAF-SnRK2 kinase cascade mediates early osmotic stress signaling in higher plants. Nature Communications. 11 (1), 613(2020).
  21. Humphrey, S. J., Azimifar, S. B., Mann, M. High-throughput phosphoproteomics reveals in vivo insulin signaling dynamics. Nature Biotechnology. 33 (9), 990-995 (2015).
  22. Bekker-Jensen, D. B., et al. An optimized shotgun strategy for the rapid generation of comprehensive human proteomes. Cell Systems. 4 (6), 587-599 (2017).
  23. Possemato, A. P., et al. Multiplexed phosphoproteomic profiling using titanium dioxide and immunoaffinity enrichments reveals complementary phosphorylation events. Journal Proteome Research. 16 (4), 1506-1514 (2017).
  24. Hogrebe, A., et al. Benchmarking common quantification strategies for large-scale phosphoproteomics. Nature Communications. 9 (1), 1045(2018).
  25. Wong, M. M., et al. Phosphoproteomics of Arabidopsis Highly ABA-Induced1 identifies AT-Hook-Like10 phosphorylation required for stress growth regulation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (6), 2354-2363 (2019).
  26. Yang, F., Melo-Braga, M. N., Larsen, M. R., Jorgensen, H. J., Battle Palmisano, G. through signaling between wheat and the fungal pathogen Septoria tritici revealed by proteomics and phosphoproteomics. Molecular & Cell Proteomics. 12 (9), 2497-2508 (2013).
  27. Tsai, C. F., et al. Tandem Mass Tag labeling facilitates reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry analysis of hydrophilic phosphopeptides. Analytical Chemistry. 91 (18), 11606-11613 (2019).

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