Ce protocole décrit la construction d’un système de micro-injection à faible coût, son implantation stéréotaxique dans les structures cérébrales profondes et la procédure de microinjections chronométrées de tétrodotoxine chez des rats éveillés et non effrénés. L’objectif est de révéler la participation des structures hypothalamiques à la régulation de l’ovulation en inhibant leur activité neuronale.
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Article de méthode
Démêler le rôle des zones discrètes du cerveau du rat dans la régulation de l’ovulation par inactivation réversible par des microinjections de tétrodotoxines
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Dans cet article
Résumé
Résumé
De nombreuses approches expérimentales ont été utilisées pour étudier le rôle du cerveau dans la régulation de l’ovulation. Les exemples incluent la lésion et la désafférentation des groupes neuronaux, qui sont deux méthodes invasives qui nuisent de manière permanente à l’intégrité de la zone cible. Ces méthodes s’accompagnent d’effets collatéraux qui peuvent affecter l’analyse des mécanismes de régulation aiguë et temporelle. L’implantation stéréotaxique de canules guides visant des régions spécifiques du cerveau, suivie d’une période de récupération, permet aux chercheurs de micro-injecter différents médicaments après la disparition des effets indésirables de la chirurgie. La tétrodotoxine a été utilisée pour déterminer les rôles de plusieurs zones du cerveau dans divers processus physiologiques, car elle inhibe transitoirement les potentiels d’action dépendants du sodium, bloquant ainsi toute activité neuronale dans la région cible. Ce protocole combine cette méthode avec des stratégies d’évaluation du cycle œstré et de l’ovulation pour révéler le rôle des régions cérébrales discrètes dans la régulation de l’ovulation à des moments particuliers d’un stade donné du cycle œstré. Des rats éveillés et non effrénés (Rattus norvegicus) ont été utilisés pour éviter les effets bloquants que les anesthésiques et les hormones de stress exercent sur l’ovulation. Ce protocole peut être facilement adapté à d’autres espèces, cibles cérébrales et agents pharmacologiques pour étudier différents processus physiologiques. Les améliorations futures de cette méthode comprennent la conception d’un système de micro-injection utilisant des capillaires en verre de petit diamètre au lieu de canules de guidage. Cela réduira la quantité de tissu endommagé pendant l’implantation et diminuera la propagation des médicaments perfusés en dehors de la zone cible.
Introduction
L’ovulation est le processus par lequel un ou plusieurs ovocytes matures sont libérés des ovaires une fois par cycle estral / menstruel. Comme toutes les espèces de mammifères dépendent de la production de gamètes pour se reproduire, la compréhension des mécanismes qui régulent l’ovulation a un impact énorme dans des domaines allant de la biomédecine à l’industrie de l’élevage et au maintien des espèces menacées. L’ovulation est régulée par l’axe hypothalamo-hypophyso-ovarien, qui implique plusieurs zones hypothalamiques et extra-hypothalamiques, les gonadotropes de l’hypophyse antérieure et les cellules thèque et granulosa qui, avec les ovocytes, forment les follicules ovariens à l’intérieur des ovaires1.
Les follicules ovariens se développent, se développent et éventuellement ovulent en réponse à la sécrétion tonique et phasique de l’hormone folliculo-stimulante et de l’hormone lutéinisante, les deux gonadotrophines sécrétées par les gonadotrophes. Le schéma de sécrétion de gonadotrophine est essentiel pour le bon développement folliculaire et l’ovulation et il est régulé par l’hormone de libération des gonadotrophines (GnRH)1,2. Ce neuropeptide est synthétisé par des neurones dispersés dans tout le dencéphale basal puis sécrétés dans le système vasculaire portail qui relie l’hypothalamus et l’hypophyse antérieure. L’activité sécrétoire des neurones de la GnRH est à son tour modulée par l’entrée synaptique provenant de diverses structures cérébrales. Ces structures transmettent des informations sur l’état de l’environnement externe et interne de l’organisme, y compris la disponibilité de la nourriture, la durée de la photopériode et la concentration d’hormones dans le sang. En ce sens, ils façonnent le schéma de reproduction de chaque espèce et les rôles spécifiques de ces structures doivent être déterminés afin de bien comprendre les mécanismes régissant l’ovulation. À titre d’exemple, il a été démontré que la fluctuation des niveaux d’œstradiol au cours du cycle œstré régule la sécrétion de GnRH; cependant, les neurones de la GnRH n’expriment pas l’isoforme du récepteur de l’œstradiol nécessaire pour détecter de tels changements. Deux populations de neurones exprimant ces récepteurs sont situées dans la région périventriculaire rostrale du troisième ventricule et dans le noyau arquié, respectivement, et forment des synapses avec des neurones GnRH. Il existe des preuves suggérant que ces neurones interprètent la concentration d’œstradiol et stimulent ensuite l’activité des neurones de la GnRH en libérant de la kisspeptine, un puissant inducteur de la sécrétion de GnRH3.
Des expériences impliquant des lésions thermiques ou chimiques, ainsi qu’une désafférentation mécanique, ont permis aux chercheurs de déterminer l’implication de plusieurs structures cérébrales dans la régulation de l’ovulation4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Ces expériences ont cependant l’inconvénient d’être invasives et traumatisantes, nécessitant plusieurs jours de récupération avant d’évaluer les effets du traitement, ce qui entrave l’analyse des effets aigus du traitement. De plus, ils affectent en permanence les zones ciblées et perturbent d’autres processus physiologiques à long terme. En raison de ces problèmes, les résultats de ces expériences sont généralement obscurcis par les mécanismes compensatoires homéostatiques dans le corps de l’animal et il est plutôt difficile d’extraire des informations précises sur la dynamique de régulation temporelle dans laquelle la zone est impliquée.
La microinjection de médicaments qui perturbent transitoirement l’activité des neurones à travers des canules guides est une alternative appropriée qui surpasse les inconvénients mentionnés ci-dessus. Les canules peuvent être placées dans n’importe quelle région du cerveau par une chirurgie stéréotaxique, permettant au chercheur de commencer le traitement médicamenteux après la disparition des effets confondants de la chirurgie. La micro-injection chronométrée des médicaments permet aux chercheurs de tester des hypothèses concernant la contribution de la région à une étape particulière du processus et peut être effectuée chez des animaux éveillés retenus ou en mouvement libre. Une variété de médicaments, y compris les anesthésiques locaux, les agonistes, les antagonistes, les agonistes inverses et les toxines biologiques telles que la tétrodotoxine (TTX) peuvent être microinjectés dans la région d’intérêt à des moments spécifiques.
TTX est une toxine biologique synthétisée par des bactéries vivant dans le corps du poisson-globe ainsi que d’autres vertébrés et invertébrés. TTX réduit au silence l’activité neuronale par le blocage sélectif et transitoire des canaux sodiques, ce qui entraîne l’inhibition des potentiels d’action dépendants du sodium. En présence de TTX, les cellules subissent une altération de la phase de dépolarisation et ne sont donc pas excitables mais restent vivantes. L’effet bloquant du TTX s’explique par sa composition moléculaire: un groupe guanidinium est capable de passer à travers l’aspect extracellulaire du canal sodique, mais le reste de la molécule ne peut pas passer en raison de sa taille, il est donc coincé et bloque le canal13,14,15,16,17 . Le mécanisme d’action du TTX a permis son utilisation comme outil pour étudier le système nerveux à la fois in vitro et in vivo. L’injection intracérébrale de cette toxine a été utilisée pour étudier le rôle des zones cérébrales discrètes dans plusieurs processus tels que la rétention de la mémoire18, le sommeil et l’excitation19, la reconnaissance de lieu20, la navigation spatiale21, l’abus dedrogues 22, la thermorégulation23, le développement de la schizophrénie24, le comportement sexuel25 et la régulation de l’ovulation26 entre autres. Dans ce protocole, nous décrivons les effets sur l’ovulation de l’inactivation transitoire des noyaux hypothalamiques par microinjection TTX chez des rats éveillés et non drainés.
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Protocole
Les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique de facultad de Estudios Superiores Zaragoza, UNAM. Cette institution fonctionne en stricte conformité avec les règles mexicaines pour la manipulation des animaux, norme officielle: NOM-062-ZOO-1999, qui est conforme aux directives internationales.
1. Construction de canules bilatérales
- Extrayez l’arbre en acier inoxydable du moyeu de deux aiguilles hypodermiques de 23 G à l’aide d’une pince à pression, puis retirez toute colle restante à l’aide d’une lame de scalpel.
- Tracez une ligne à 15 mm de l’extrémité émoussée des arbres avec un marqueur permanent fin. Utilisez une pince à épiler pour enlever les extrémités biseautées.
- Tenez les segments de 15 mm avec des hémostats fins et pressez-les perpendiculairement avec un disque de coupure attaché à un outil rotatif jusqu’à l’obtention de segments de tubes de 14 mm. Cette étape est effectuée afin d’éliminer la partie occluse des arbres, en créant des extrémités ouvertes et émoussées. Enfin, insérez une aiguille de 30 G à travers les segments pour éliminer toute obstruction interne.
- Déterminer la distance entre les structures d’intérêt dans les hémisphères gauche et droit du cerveau à l’aide d’un atlas cérébral27. Utilisez de l’argile de moulage pour fixer les deux segments de 14 mm à une lame de microscope et assurez-vous que les deux sont au même niveau horizontal. Observez à travers un micromètre oculaire (10x) et ajustez les segments avec une pince à épile fine jusqu’à ce que la distance souhaitée soit obtenue.
- Mélanger la pâte à souder avec 10% d’acide chlorhydrique dans une proportion de 2:1 et ajouter une goutte du mélange 2 mm en dessous de l’extrémité émoussée des segments. Souder les deux segments avec un seul point à l’aide d’un fer à souder et d’un fil de soudure de 0,5 mm de diamètre. Assurez-vous que la soudure n’obstrue pas la lumière des segments.
- Créez un support pour fixer la canule au support stéréotaxique en coupant un segment de 10 mm de fil en acier inoxydable résilient de 0,3 mm. Utilisez de l’argile de moulage pour placer 2 mm du fil en contact avec le point de soudure précédent et le reste au-dessus de l’extrémité émoussée des canules. Souder le fil aux canules.
- Nettoyez la surface des canules avec de l’éthanol à 70% pour éliminer l’excès de pâte à souder. Rincer l’intérieur des canules avec de l’eau stérile pour éliminer les particules métalliques. Répétez ce processus jusqu’à ce qu’aucune particule ne puisse être détectée au microscope à un grossissement de 10x.
2. Construction d’obturateurs et de bouchons
- Pour construire les obturateurs, coupez deux segments de 16 mm de fil souple rond en acier inoxydable (0,35 mm de diamètre). Tenez une canule bilatérale avec des hémostats, perpendiculaire à un banc de laboratoire, et insérez l’un de ces segments dans chaque canule jusqu’à ce qu’ils atteignent le banc. Pliez le reste à un angle de 90°.
- Pour les bouchons, coupez deux segments de 2 mm de tubes en silicone (diamètre intérieur = 0,76 mm) et appliquez une goutte de colle de silicium à l’une des extrémités de chaque segment. Ne laissez pas la colle pénétrer dans le tube. Laisser sécher pendant au moins 24 heures.
3. Construction de micro-injecteurs
- Répétez l’étape 1.1, en utilisant plutôt des aiguilles hypodermiques de 30 G pour créer les arbres.
- Tracez une ligne à 18,5 mm de l’extrémité émoussée des arbres et retirez le reste des extrémités biseautées avec une pince à épiler coupante.
- Répétez l’étape 1.1 avec une seule aiguille de 23 G pour construire des adaptateurs en coupant deux segments de 6 mm de long à partir de l’extrémité émoussée.
- Éliminer les parties obstruées des segments de 6 mm en les pressant perpendiculairement contre le disque de coupure jusqu’à l’obtention de deux adaptateurs de 4 mm. Éliminez toute obstruction interne.
- Insérez l’extrémité biseautée des segments 30 G dans les adaptateurs. Regardez à travers un stéréomicroscope pour vous assurer que l’extrémité des deux, segments et adaptateurs, est au même niveau. Appliquez de la colle cyanoacrylate sur l’articulation distale à l’aide d’un coton-tige et laissez sécher pendant 15 minutes.
- Faites tremper deux connecteurs de tubes en téflon dans de l’éthanol à 70% pendant 5 minutes, puis fixez-les aux micro-injecteurs à travers les adaptateurs. Attendez que le diamètre des connecteurs rétrécisse pendant au moins 24 heures, puis stérilisez le micro-injecteur avec une méthode à basse température pour éviter d’endommager les connecteurs (la stérilisation à l’oxyde d’éthylène est recommandée).
4. Entretien des animaux et frottis vaginaux
- Utilisez des rats à capuchon femelles adultes cycliques (Rattus norvegicus, souche CIIZ-V) pesant entre 230 et 260 grammes. Hébergez les rats par groupes de quatre dans des cages en polypropylène standard dans une pièce avec une photopériode clair-foncé de 14:10. Réglez la température et l’humidité à 22 ± 2 °C et à 40 %, respectivement. Fournir de la nourriture et de l’eau ad libitum.
- Prendre des frottis vaginaux tous les jours entre 10h00 et 12h00.
- Stériliser une boucle bactériologique modifiée d’un diamètre intérieur de 1 mm à l’aide d’une lampe à alcool et la refroidir avec de l’eau stérile. Tenez le rat avec une prise sûre et introduisez 5 mm de la boucle bactériologique dans le vagin, en touchant ses parois internes. Retirez la boucle bactériologique. En cas de succès, une goutte nuageuse sera vue à la pointe. Placez cette goutte sur une lame de microscope.
- Répétez ce processus pour chaque rat en stérilisant et en refroidissant la boucle entre chaque animal.
- Une fois les gouttes sèches, colorez avec de l’hématoxyline-éosine et observez les échantillons au microscope à 10x.
- Déterminer la proportion de leucocytes, de cellules nucléées épithéliales et de cellules kératinisées sur chaque frottis et le classer selon les critères des stades du cycle œstrous rapportés à la figure 1, ce qui concorde avec la littérature précédente28,29.
5. Implantation stéréotaxique des canules
REMARQUE: Effectuer l’implantation des canules après une chirurgie stéréotaxique aseptique régulière et en respectant les normes institutionnelles.
- Avant la chirurgie
- Stériliser les instruments chirurgicaux, les canules, les vis chirurgicales, les obturateurs, la gaze et les cotons-tiges en bois 24 h avant la chirurgie à l’aide d’un autoclave à vapeur. Stérilisez les pointes des instruments métalliques entre les chirurgies consécutives en les nettoyant avec 10% de peroxyde d’hydrogène suivi d’eau, puis placez-les dans un stérilisateur à billes chaudes.
- Préparez les zones de travail et l’instrument stéréotaxique avant de retirer l’animal de la salle de bain. Préparez l’animal à la chirurgie dans une zone située aussi loin que possible de la table de chirurgie pour éviter toute contamination pendant la procédure.
- Nettoyez les zones de préparation et de chirurgie avec de l’éthanol à 70%, suivi d’une application d’une solution de chlorure à 10% pendant dix minutes. Nettoyez la base, le cadre et les manipulateurs de l’instrument stéréotaxique avec 70% d’éthanol et stérilisez les extrémités des barres auriculaires à l’aide d’un stérilisateur à billes chaudes et refroidissez-les à l’air avant la chirurgie.
- Effectuez la chirurgie en portant un manteau de laboratoire dédié, un masque facial, un bonnet de tête, des manches chirurgicales, des couvre-chaussures et des gants chirurgicaux. Demandez à l’assistant de préparer les animaux à la chirurgie et de vérifier leur état général pendant la procédure.
- Fixez la canule au support stéréotaxique. Demandez à l’assistant d’amener le premier animal à opérer dans la pièce. Sélectionner des rats dans le diestrus pour la chirurgie, car les observations de notre laboratoire indiquent que ces animaux récupèrent les cycles œstrus appropriés plus rapidement que les rats opérés à d’autres stades, probablement parce que la réponse au stress change avec le cycle œstrueux.
- Peser l’animal et induire une anesthésie avec 4% d’isoflurane dans 100% d’oxygène à l’intérieur d’une chambre d’induction pour rats connectés à un vaporisateur d’isoflurane. Pour éviter de stresser les animaux, ne préremplez pas la chambre. Confirmez un plan chirurgical d’anesthésie en vérifiant la dilatation de la pupille et la perte de douleur mesurée par les tests de pincement de la queue et de l’oreille après avoir observé la perte du réflexe de redressement.
- Anesthésier le rat par injection intrapéritonéale d’un mélange de kétamine (100 mg/kg) et de xylazine (10 mg/kg) si un vaporisateur d’isoflurane n’est pas disponible.
- Retirez le rat de la chambre d’induction et utilisez un cône de nez dans la table de préparation pour maintenir les effets de l’anesthésie avec 2,5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène. Coupez les poils du cuir chevelu avec des tondeuses et enlevez les poils lâches avec un rouleau à charpie. Injecter une dose sous-cutanée préopératoire de 2 mg/kg de méloxicam et de 5 mg/kg d’enrofloxacine comme anti-inflammatoire/analgésique non stéroïdien et antibiotique, respectivement.
- Appliquez des larmes artificielles d’hypromellose sur chaque œil pour éviter la dessiccation pendant la chirurgie.
- Montez l’animal dans l’instrument stéréotaxique au-dessus d’un coussin chauffant à l’aide de barres d’oreille sans rupture et d’un masque d’anesthésie. Ajustez la pince nasale pour vous assurer que la tête de l’animal est plate. Effectuez un gommage chirurgical dans la zone rasée en alternant entre la povidone-iode avec du savon et de l’éthanol à 70% une fois, puis en utilisant deux fois de la povidone-iode et de l’éthanol à 70%. Insérez un thermomètre rectal pour enregistrer la température de l’animal pendant la procédure, puis couvrez-le d’un champ chirurgical stérile.
- Pendant la chirurgie
- Utilisez un scalpel pour faire une incision de 2 cm dans la peau et les muscles au milieu de la zone rasée. Retirez le périoste du crâne à l’aide d’un coton-tige recouvert de peroxyde d’hydrogène à 2% pour révéler bregma ou lambda, les repères qui seront utilisés pour calculer les coordonnées cibles. Séchez le crâne avec de l’air pour une meilleure visualisation du point de repère.
- Utilisez les manipulateurs de l’instrument stéréotaxique pour déplacer la canule dans une position directement au-dessus du point de repère de votre choix. Enregistrez les coordonnées antérieures-postérieures et médiales-latérales de l’instrument stéréotaxique et utilisez-les pour calculer les coordonnées de la zone cible selon l’atlas cérébral27.
- Réglez les coordonnées calculées dans l’instrument stéréotaxique et placez la pointe de la canule à la surface du crâne. Enregistrez la coordonnée dorsale-ventrale et utilisez-la pour calculer la profondeur par endroit de la zone cible.
- Retirez le bras du manipulateur en le dévissant du cadre. Utilisez une bavure dentaire attachée à un outil rotatif à une vitesse de 15 000 tr/min pour marquer à l’endroit où la craniotomie sera effectuée. Ensuite, utilisez la bavure pour faire trois trous, formant un triangle équilatéral autour de la marque. Ces trous ne doivent pas percer le crâne. Insérez les vis chirurgicales dans les trous, en vous assurant qu’elles sont bien placées.
- Faites la craniotomie assez large pour tenir compte de la distance entre les zones cibles dans chaque hémisphère. Il doit être aussi petit que possible en diamètre mais assez grand pour permettre l’abaissement de la canule sans toucher les bords du crâne, car cela modifiera la trajectoire. Effectuez la craniotomie progressivement, en appliquant la pression la plus basse possible. Le crâne du rongeur n’a que quelques millimètres d’épaisseur et il est essentiel pour préserver l’intégrité des tissus en dessous.
- Une fois que la dure-mère est visible, utilisez une aiguille stérile de 21 G dont la pointe est incurvée à un angle de 90 ° pour enlever les éclats d’os et faire une coupe antérieure-postérieure dans les méninges. Utilisez la technique Wirtshafter et collègues30 pour éviter d’endommager le sinus sagittal supérieur si la zone cible est située près de la ligne médiane.
- Placez le support avec la canule dans le cadre et utilisez le manipulateur dorsal-ventral pour atteindre la coordonnée ventrale. Vérifiez que l’aiguille ne touche pas les bordures en descendant et augmentez le diamètre de la craniotomie si nécessaire.
REMARQUE: Il est important que la pointe des canules de guidage cible une région allant de 0,5 à 2,0 mm au-dessus de la région d’intérêt. Cela est dû à la réaction inflammatoire du cerveau en réponse à l’introduction de corps étrangers et à la destruction des tissus. Ceci est particulièrement important si la région d’intérêt est petite et que la distance de travail doit être calculée empiriquement à l’avance.
- Placez le support avec la canule dans le cadre et utilisez le manipulateur dorsal-ventral pour atteindre la coordonnée ventrale. Vérifiez que l’aiguille ne touche pas les bordures en descendant et augmentez le diamètre de la craniotomie si nécessaire.
- Appliquez du ciment dentaire pour attacher la canule au crâne et laissez-la sécher. Assurez-vous que le ciment dentaire ne recouvre pas l’extrémité émoussée de la canule, car cela l’obstruerait de manière irréversible. Attendez que le ciment se solidifie complètement.
- Insérez les obturateurs pour éviter d’autres obstructions et pour assurer la perméabilité pendant l’étude. Mettez le capuchon en silicone pour éviter toute contamination.
- Après la chirurgie
- Remplacer les liquides perdus par une injection intrapéritonéale de 1,0 mL de solution saline stérile à une température physiologique. Placez l’animal dans une cage de récupération avec support thermique jusqu’à ce qu’il se rétablisse de l’anesthésie. Vérifiez périodiquement la température et la fréquence cardiaque/respiratoire de l’animal. Les effets de l’isoflurane durent quelques minutes après l’interruption du flux gazeux tandis que les effets de la kétamine / xylazine durent de 40 à 50 minutes.
- Fournir des injections postopératoires de l’antibiotique, de l’analgésique et de l’anti-inflammatoire (aux mêmes doses et voies indiquées précédemment) pendant 48 à 72 heures et inspecter de près les animaux quotidiennement pour le reste de l’expérience. Signalez tout signe de douleur, de stress ou de perte de poids aux services vétérinaires ou à un membre qualifié du laboratoire. N’effectuez aucune autre manipulation aux rats pendant cette période.
- Commencez à prendre des frottis vaginaux après le traitement postopératoire et continuez à le faire jusqu’à ce que l’animal présente trois cycles œs séreux consécutifs de quatre jours.
REMARQUE: Les cathéters jugulaires chroniques peuvent être implantés chirurgicalement, ce qui permet au chercheur de prélever des échantillons de sang en série pour analyser la sécrétion d’hormones telles que l’œstradiol, la progestérone, la testostérone, l’hormone lutéinisante, l’hormone folliculo-stimulante et la corticostérone. Nous recommandons de placer un tel cathéter une fois que l’animal se remet de la chirurgie du cerveau, car cela améliorera le taux de survie tout en évitant le colmatage du cathéter qui peut résulter d’un temps de récupération prolongé.
6. Manipulation des tétrodotoxines et préparation des solutions
ATTENTION : Le TTX est l’une des substances les plus toxiques connues. Il agit sur les muscles squelettiques et les tissus nerveux. L’intoxication par contact est peu probable, mais toute plaie ouverte est une voie potentielle d’inoculation dans le corps. Les principales préoccupations lorsque vous travaillez avec TTX sont la ponction de la peau avec des instruments tranchants qui ont été en contact avec la toxine et la génération d’aérosols qui peuvent atteindre la bouche, les yeux et les muqueuses. Selon la dose, le TTX peut être mortel s’il est inhalé, avalé ou inoculé par la peau. Il provoquera une forte irritation des yeux. La DL50 a été testée chez la souris par administration orale et intraveineuse et elle est de 334 μg/kg et 7,3 μg/kg, respectivement. Il n’y a pas d’antitoxine disponible pour le moment.
REMARQUE: La substance inactivante est une solution de NaOCl à 1,0 % avec ou sans NaOH à 0,25 N ou une solution d’eau de Javel à 10 %. L’inactivation complète se produit après 30 minutes d’exposition. Le TTX ne peut être complètement inactivé par un dérivé de chlorure à une concentration inférieure à 10 %, par autoclavage ni par stérilisation à la chaleur sèche à une température inférieure à 500 °F. Toutes les procédures impliquant TTX doivent être effectuées par deux personnes bien informées portant des paires intérieures et extérieures de gants en nitrile, une blouse de laboratoire dédiée, des lunettes de sécurité, un masque facial jetable, des chaussures fermées et des pantalons longs.
- Préparation de la solution stock
- Placez un tampon imbibé de la substance inactivante dans la hotte pour éviter toute contamination en cas de déversement. Assurez-vous que la hotte fonctionne correctement avant de commencer. Préparez un récipient avec la solution inactivante pour éliminer les embouts de pipette.
- Resuspendez la poudre lyophilisée de citrate stérile TTX selon les instructions du fabricant par un titrage extrêmement prudent et lent avec du liquide céphalorachidien artificiel stérile, en rinçant les parois du flacon dans le processus. Évitez la formation de mousse et d’aérosol. Suivez une technique aseptique pour éviter la contamination de la solution de TTX car elle sera injectée dans le cerveau d’animaux vivants. Utilisez une seringue avec une aiguille au lieu d’une micropipette si vos flacons TTX ont une membrane externe pour empêcher la formation d’aérosols.
- Aliquoter la solution d’emballage dans des micro-tubes stériles. Rendre les aliquotes aussi petites que possible, car les cycles de congélation / décongélation peuvent altérer la stabilité des molécules. Ne remplissez pas plus de la moitié des tubes, car l’eau augmente en volume lorsqu’elle est congelée, ce qui peut entraîner l’ouverture du couvercle et la contamination du tube et d’autres échantillons stockés dans le récipient.
- Décontaminer l’extérieur des tubes et les surfaces où le TTX a été utilisé avec la substance inactivante. Conservez les tubes à -20 °C dans une boîte à flacons à l’intérieur d’un récipient secondaire.
- Diluer la solution stock à une concentration de travail
- Préparez des solutions fraîchement diluées le jour où elles seront utilisées, car les solutions diluées sont moins stables. Placez un tampon imbibé de la substance inactivante dans la hotte et un micro-tube-rack sur le dessus. Préparez un récipient avec la solution inactivante pour éliminer les embouts de pipette.
- Pipeter la solution principale au fond d’un microtube stérile, puis ajouter la quantité calculée de liquide céphalorachidien artificiel pour obtenir une concentration de 10 ng/μL. Comme décrit pour la re-suspension de la poudre TTX, effectuez un titrage extrêmement soigneux et lent, en rinçant les parois du flacon et en évitant la formation de mousse et d’aérosol.
- Si des échantillons qui ont été sur le congélateur doivent être utilisés pour la micro-injection, ils doivent être autorisés à s’équilibrer à température ambiante pendant au moins une heure avant l’expérience.
7. Microinjection de TTX ou de solutions de véhicules dans des rats en mouvement libre
- Configurez la pompe à micro-injection avec le débit de perfusion et le temps total d’injection en fonction de l’expérience. Calculez ces paramètres à l’avance en tenant compte du volume occupé par la structure cible et de la quantité de solution à injecter. Pour cette expérience, injecter 200 nL de solution à raison de 50 nL par minute pendant un temps total de perfusion de 4 minutes.
- Remplissez deux seringues Hamilton de 10 μL avec de l’eau distillée stérile, insérez un morceau de tube stérile en téflon dans le connecteur de tuyau de chaque micro-injecteur, en veillant à ce que la longueur du tube ne limite pas le mouvement du rat (le tube peut être stérilisé à l’aide d’oxyde d’éthylène).
- Placez un tampon imbibé de la substance inactivante et un carré de film de paraffine de 2 cm x 2 cm au-dessus. Pipettez une quantité suffisante de TTX pour remplir l’aiguille de l’injecteur et 1 cm du tube au-dessus du film. Absorbez la goutte TTX en rétractant doucement le piston. Montez les seringues dans la pompe à micro-injection et utilisez ses commandes pour manipuler le piston jusqu’à ce qu’une goutte de TTX puisse être vue à l’extrémité de chaque micro-injecteur. Jetez les gouttes dans le tampon imbibé de substance inactivante.
- Sélectionnez les rats qui seront microinjectés. Utilisez uniquement des rats qui ont montré au moins trois cycles consécutifs après la chirurgie. Considérez leur stade du cycle et l’heure de la journée. L’heure et le stade dépendent de l’hypothèse spécifique que vous allez tester, pour cette expérience 14:00 heures de proestrus sélectionné puisque les signaux préovulatoires nerveux régissant la sécrétion phasique de GnRH se produisent en ce moment. Transportez-les dans la pièce où l’injection aura lieu à l’intérieur de leurs propres cages de logement pour éviter la détresse.
- Tenez le rat avec une poignée ferme, retirez le capuchon et les obturateurs des canules, insérez les micro-injecteurs dans les canules de guidage et ramenez l’animal dans la cage.
- Allumez la pompe et attendez que la micro-injection se termine. Observez l’animal pendant cette période afin de détecter un éventuel détachement des micro-injecteurs et d’éviter la torsion des tubes en téflon.
- Laissez les micro-injecteurs en place pendant deux minutes supplémentaires pour éviter le reflux de la solution. Retirez-les, nettoyez la surface de l’implant avec une solution antiseptique d’iodopovidone, en évitant son écoulement à l’intérieur des canules de guidage. Insérez des obturateurs stériles, mettez le capuchon et ramenez l’animal dans la salle de la colonie. Observez l’animal périodiquement pour détecter les effets secondaires possibles du médicament.
- Allumez la pompe avec les mêmes paramètres que pendant la micro-injection et vérifiez qu’un débit correct est maintenu pour vous assurer que la perméabilité du système a été conservée pendant la procédure.
- Appuyez sur le piston pour expulser le TTX/véhicule hors du micro-injecteur jusqu’à ce que la bulle d’air atteigne le bout de l’aiguille. Rappelez-vous le TTX dans son microtube. Remplissez la seringue avec de l’eau distillée et utilisez-la pour nettoyer l’intérieur des tubes. Jetez l’eau dans la substance inactivante et répétez ce processus au moins trois fois. Nettoyez l’extérieur des seringues, des tubes et des micro-injecteurs avec un chiffon imbibé de la substance inactivante.
8. Euthanasie et traitement des tissus
- Le jour de l’oestrus prédit ou confirmé par voie vaginale, injecter au rat un surdosage intrapéritonéal de pentobarbital de sodium (75 mg / kg). Vérifier la perte de conscience et injecter 200 nL d’une solution de bleu de méthylène à 0,5 % à travers les canules guides décrites aux étapes 7.1 à 7.9. Vérifiez les signes de douleur à l’aide du test de pincement des orteils ou de la queue et, si aucun n’est détecté, décapitez le rat à l’aide d’une guillotine de rongeur.
- Utilisez des ciseaux pour ouvrir la cavité abdominale et trouver les ovaires. Utilisez de fins ciseaux à iris pour disséquer chaque ovaire, en coupant à la jonction utéro-tubaire à l’aide d’une loupe. Évitez d’endommager l’oviducte car cela entraînera la perte d’ovocytes.
- Placez les ovaires sous un stéréomicroscope et utilisez une lame de rasoir pour enlever tout le tissu adipeux sans endommager l’organe. Retirez l’oviducte de chaque ovaire en coupant avec la lame de rasoir aussi loin que possible de la région de l’ampoule. Montez chaque oviducte sur un toboggan différent et couvrez-le d’une goutte d’eau. Conservez les ovaires dans un flacon contenant la solution de Bouin.
- Séchez doucement les oviductes avec une serviette en papier absorbante et recherchez l’ampoule sous le stéréomicroscope. Avec la main non dominante, maintenez l’oviducte en place en pinçant loin de l’ampoule avec une aiguille de 23 G, puis utilisez une autre aiguille de 23 G dans la main dominante pour faire une incision de 1 mm dans la région médiane de l’ampoule. Les complexes cumulus-ovocytes dépasseront de l’incision sous la forme d’une goutte de liquide visqueux(Figure 2D). Utilisez l’aiguille dans la main dominante pour tirer doucement et lentement la goutte loin de l’oviducte. Appuyez sur le reste de l’ampoule pour vous assurer qu’aucun ovocyte n’est laissé à l’intérieur. Extraire les ovocytes des oviductes aussi rapidement que possible car la dessiccation de l’oviducte piège irréversiblement les ovocytes à l’intérieur.
- Retirez l’oviducte de la lame et attendez que la goutte de liquide contenant les ovocytes sèche. Colorez l’échantillon avec de l’hématoxyline-éosine. Utilisez un support de montage pour le glissement du couvercle. Observez au microscope (10x) pour déterminer le nombre d’ovocytes excrétés par chaque ovaire.
REMARQUE: Le sacrifice par perfusion cardiaque n’est pas effectué dans ce protocole car les ovocytes seraient piégés dans les oviductes et donc des méthodes histologiques seraient nécessaires pour évaluer l’ovulation. Si l’utilisateur doit perfuser pour analyser d’autres tissus, les ovaires peuvent être enlevés en premier et les artères descendantes serrées avec des hémostats épais sous le foie pour éviter les fuites de fixateur. - Retirez la peau de la tête et immergez le crâne dans un récipient en verre avec une solution de forcline à 10%. Permettre la fixation de la tête pendant au moins dix jours avant de retirer la canule pour éviter toute distorsion du tissu. Pour retirer la canule, utilisez des ciseaux pour détacher tous les muscles de la région du crâne qui l’entoure. Coupez entre les os nasaux et frontaux avec des coupe-os, puis retirez l’os occipital. Insérez la pointe des tondeuses dans le foramen magnum et commencez à couper à travers les crêtes sagnitales jusqu’au reste de l’os nasal.
- La région isolée du sommet du crâne doit contenir les os frontaux et pariétaux. Retirez la canule implantée attachée au sommet du crâne en la tirant lentement perpendiculairement à la tête. Coupez toute partie attachée des méninges avec de fins ciseaux à iris pour éviter la déformation du cerveau.
- Faites une coupe antérieure-postérieure sur les méninges et mettez-les de côté pour retirer le cerveau de la base du crâne. Insérez une pince à épile émoussée sous les bulbes olfactifs et tirez doucement le cerveau vers le haut jusqu’à ce que les nerfs optiques soient visibles. Coupez les nerfs avec de fins ciseaux à iris et retirez le cerveau. Préserver le cerveau en solution fixatrice.
- Obtenez des sections du cerveau de 50 μm d’épaisseur à l’aide d’un vibratome, montez-les dans des lames enduites de poly-L-lysine (0,1% dans de l’eau distillée) et colorez avec la technique Nissl. Observez les lames au microscope (10x) pour déterminer la position finale des canules(Figure 2A-2C)et la propagation du colorant à l’aide d’un atlas du cerveau de rat27.
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Résultats
Le protocole décrit ci-dessus a été testé en évaluant les effets d’un seul TTX ou véhicule (liquide céphalorachidien artificiel; ACSF) microinjection dans l’un des deux noyaux différents connus pour être impliqués dans la régulation de l’ovulation chez le rat: le noyau suprachiasmatique et le noyau arquié. Le noyau suprachiasmatique a été choisi car il contient le stimulateur circadien central chez les mammifères. Il est impliqué dans la régulation des événements cycliques comme la sécrétion de gonadotrophines. Le noyau ...
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Discussion
Cet article décrit une méthode pour inactiver transitoirement, à un moment donné, une région discrète dans le cerveau de rats éveillés et non captés. Une méthode simple pour suivre leur cycle œstrous et évaluer l’ovulation est également fournie. Ce protocole permet une analyse simple de la contribution de régions cérébrales spécifiques aux mécanismes qui conduisent à l’ovulation en comparant le résultat ovulatoire des animaux traités par TTX avec celui des animaux traités par véhicule. À l’exception de l’instrument stéré...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer par rapport à cet article.
Remerciements
Nous sommes reconnaissants à Raymond Sanchez de l’Université de Washington pour son aide précieuse dans l’édition de manuscrits et à M.Sc. Georgina Cortés et M.Sc. Cintia Javier pour leur soutien technique dans la normalisation de cette technique. Nous sommes également reconnaissants aux membres des services vétérinaires de Facultad de Estudios Superiores Zaragoza: MVZ. Adriana Altamirano, MVZ. Roman Hernández et MVZ. Dolores-Elizabeth Guzmán pour l’excellent entretien et les soins des animaux de laboratoire. Les expériences décrites dans ce protocole ont été soutenues par le numéro de subvention DGAPA-PAPIIT : IN216015 et par le numéro de subvention CONACyT : 236908 à Roberto Domínguez. Carlos-Camilo Silva est doctorant au Programa de Doctorado en Ciencias Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México (UNAM) et est soutenu par le Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Numéro de subvention: 294555).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 10 &mu ; L Seringues | Hamilton Hamilton | 80314 | |
| 21 G x 1 » Aiguille hypdermique en acier inoxydable | BD | 305165 | |
| 23 G x 1 » Aiguille hypdermique en acier inoxydable | BD | 305145 | |
| 30 G x 1/2 » Aiguille hypdermique en acier inoxydable | BD | 305106 | |
| Liquide céphalo-rachidien artificiel | BASi | MD-2400 | |
| Trimère osseux | Fine Science Tools | 16152-12 | |
| Fraise pour micro perceuse | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Clipper | Wahl | ||
| Disque à tronçonner | Dremel | SM5010 | |
| Pince à épiler Truper | 17367 | ||
| Colle cyanocrylate | Kola loka | K-1 | |
| Ciment dentaire | Nic Tone | ||
| Enrofloxasin | Senosiain | ||
| Eosin | Sigma | E4009 | |
| Estereoscope | Zeiss | ||
| Ciseaux de Bonn extra fins | Outils pour les sciences fines | 14084-08 | |
| Masque facial | Lanceta HG | 60036 | |
| Graefe Forceps | Outils pour les sciences fines | 11050-10 | |
| Hématoxiline | Sigma | H3136 | |
| Hemostats | Fine Science Tools | 13008-12 | |
| Stérilisateur à billes chaudes | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Acide chlorhydrique | Sigma | 320331 | |
| Hypromelose larmes | artificielles Sophia Labs | 8950015 | |
| Isoflurane | Pisa Agropecuaria | ||
| Meloxicam | Aranda | 1183 | |
| Pompe de micro-injection | KD Scientific | 788380 | |
| Monomère | Nic Tone | ||
| Mototool | Dremel | 3000 | |
| Gants en nitrile | Lanceta HG | 69028 | |
| Barres d’oreille non rompantes | David Kopf Instruments | 855 | |
| Poly-L lysine | Sigma | P4707 | |
| Povidone-iode | Dermo Dine | ||
| Povidone-iode avec savon | Germisine espuma | ||
| Pince à épiler | Truper | 17371 | |
| Masque d’anesthésie pour rat | David Kopf Instruments | Modèle 906 | |
| Solution saline | PISA | ||
| Scalpel | Fine Science Tools | 10004-13 | |
| Lame de scalpel | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Pentobarbital de sodium | Pisa Agropecuaria | ||
| Porte-électrode standard | David Kopf Instruments | 1770 | |
| Fil d’acier inoxydable | American Orthodontic | 856-612 | |
| Appareil | stéréotaxiqueDavid Kopf Instruments | Modèle 900LS | |
| Sissors chirurgicaux | Outils scientifiques fins | 14001-12 | |
| Connecteurs en téflon | Basi | MD-1510 | |
| Tube en téflon | Basi | MF-5164 | |
| Tétrodotoxine | Alomone labs | T-500 | |
| Vaporisateur | Kent | scientific VetFlo |
Références
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Réimpressions et autorisations
