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Article de méthode

Obtention d’ostéocytes primaires par fractionnement calvariaire murin d’ostéocytes exprimant la GFP

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DOI :

10.3791/61513

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2 juin 2020

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1Division of Orthodontics and Dentofacial Orthopedics, Department of Translational Medicine, Tohoku University Graduate School of Dentistry

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la dissection du calvaire néonatal de souris dmp1-topaze et l’isolement des ostéocytes exprimant la protéine fluorescente verte par digestion et fractionnement cellulaire, en plus de la préparation des ostéocytes pour le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).

Résumé

L’ostéocytes, autrefois considéré comme un résident passif de l’os étant donné la fonction de détection de la charge mécanique en coulisses, est maintenant mis en lumière et a été montré pour avoir de multiples fonctions majeures comme la modification active de la matrice extracellulaire et la formation d’un organe endocrinien avec le système lacunocanaliculaire qui l’entoure envoyant des messages à des sites distants. Grâce aux méthodes qui ont permis de tester l’ostéocyte in vitro à partir d’ostéocytes primaires isolés en lignées cellulaires de type ostéocytes, les ostéocytes connaissent aujourd’hui un intérêt retentissant et une vague de connaissances sur la structure et la fonction. De nombreux aspects de la biologie des ostéocytes et de l’interaction avec d’autres composants moléculaires restent à découvrir. Dans ce protocole, nous décrivons en détail l’isolement efficace des ostéocytes primaires à partir du calvaire néonatal de souris dmp1-topaze, qui expriment la protéine fluorescente verte dans les ostéocytes, par fractionnement cellulaire et acquisition ultérieure de cultures d’ostéocytes primaires par FACS.

Introduction

Les ostéocytes sont des cellules terminales différenciées des progéniteurs ostéoblastiques qui se sont intégrés dans leur matrice sécrétée1. Ce sont les cellules les plus abondantes et les plus anciennes parmi les populations de cellules osseuses. Ils résident dans des lacunes et ont une morphologie stellaire caractéristique avec des dendrites qui s’étendent à travers des canaux appelés canalicules formant un vaste réseau de communication et d’échange métabolique avec leur environnement et la surface osseuse2. Les ostéocytes chorégraphient à la fois les rôles des ostéoblastes et des ostéoclastes dans le remodelage osseux, ils sont les cellules mécanosensorielles primaires conférant une adaptation à la charge mécanique3, sont impliqués dans l’homéostasie phosphate4 et la minéralisation de la matrice osseuse5, et avec le système lacunocanaliculaire, ils agissent comme un organe endocrinien signalant des tissus distants6.

Les ostéocytes sont situés dans une matrice minéralisée, ce qui limite l’accessibilité et rend leur isolement difficile, entravant ainsi l’investigation in vitro. L’une des premières méthodes d’isolement a décrit des ostéocytes isolés du calvaire de poulet à l’aide d’un anticorps monoclonal spécifique aux ostéocytes (OB7.3)7 qui a été connu plus tard pour être la variante aviaire de PHEX (gène régulateur de PHosphate avec homologie aux endopeptidases sur le chromosome X)8. D’autres chercheurs ont utilisé la digestion séquentielle d’os longs de rat 9 ou de souris 10 pour obtenir des fractions riches en ostéocytes dans lesquelles la pureté des ostéocytes était d’environ70%9. Les limites de cette procédure comprennent la pureté sous-optimale des cultures contaminées par d’autres types de cellules que les ostéocytes et le fait que les ostéocytes pourraient être potentiellement envahis par d’autres cellules en culture puisque les ostéocytes ont perdu la capacité de se diviser. Ces défis limitent la facilité d’utilisation des cultures à long terme.

Pour surmonter ces limitations, différentes lignées cellulaires ostéopacytaires ont été développées. La lignée cellulaire MLO-Y411 et la lignée cellulaire MLO-A512 sont notamment les lignées cellulaires les plus étudiées qui sont utiles pour l’étude des ostéocytes à un stade précoce; cependant, ils sont moins utiles pour étudier la signalisation des ostéocytes matures car ils expriment de faibles niveaux de sclérostine et de FGF2313, qui sont tous deux des marqueurs ostéocytes matures. D’autres lignées cellulaires, y compris IDG-SW3 14 et Ocy45415, expriment des niveaux élevés de sclérostine et de FGF23 et sont utiles pour étudier le stade ostéocytaire tardif. Les lignées cellulaires s’avèrent être des outils de recherche utiles; Néanmoins, ils ne viennent pas sans limites car ils ne représentent pas pleinement la biologie de la cellule primaire. Différentes lignées cellulaires représentent différents stades de développement du spectre de maturité des ostéocytes, et les lignées cellulaires ne parviennent pas à représenter l’hétérogénéité des ostéocytes primaires16,17.

Pour obtenir des cultures pures d’ostéocytes primaires, les chercheurs ont tiré parti du modèle murin cre dans lequel le promoteur dmp1 de 8 kb est utilisé pour stimuler l’expression de la protéine fluorescente verte (GFP) dans les ostéocytes18,19. Des souris transgéniques doubles (pOB-Col 2.3- GFP-cyan et DMP1-GFP-topaz) de Paic et al.19 et des souris transgéniques dmp1-topaze de Nakashima et al.20 ont été utilisées pour obtenir des populations d’ostéocytes. Dans lequel ils ont utilisé la digestion séquentielle et le FACS des ostéocytes exprimant la GFP pour acquérir des cultures d’ostéocytes primaires19,20. La direction de cre chez la souris rapporteure dmp1 de 10 kb Ai9, qui active la protéine tdTomato, s’est avérée présente dans les ostéocytes, les ostéoblastes, les muscles et les cellules de la moelle osseuse. Le promoteur dmp1 de 8 kb avait le même schéma d’expression, mais seule une proportion d’ostéoblastes et de cellules de moelle osseuse exprimait la protéine, ce qui indique que le promoteur dmp1 de 8 kb est plus spécifique21. Malgré cela, les résultats obtenus à l’aide du promoteur dmp1 de 8 kb doivent être interprétés avec prudence, et les profils d’expression génique doivent être systématiquement réalisés à l’aide de marqueurs spécifiques aux ostéocytes par rapport aux ostéoblastes pour s’assurer que la population obtenue est d’une pureté suffisamment élevée.

Les marqueurs ostéoclastes OSCAR et Dcstamp ont été trouvés dans des populations d’ostéocytes hématopoïétiques non appauvris vs appauvris, cette découverte a conduit les auteurs à conclure que les digestions obtenues par fractionnement de calvaire néonatal dmp1-topaze de 8 kb et le tri GFP sont contaminés par des cellules hématopoïétiques. La contamination par les cellules hématopoïétiques aurait pu être atténuée en resserrant la porte de tri de la GFP puisque les cellules hématopoïétiques GFP positives avaient une intensité de GFP raisonnablement inférieure à celle des cellules mésenchymateuses (ostéocytes) GFP-positives22.

Les méthodes d’étude des ostéocytes in vitro ont contribué à la richesse récente des informations sur la biologie des ostéocytes. Cependant, l’isolement des ostéocytes reste une procédure longue et laborieuse avec de faibles rendements cellulaires. La méthode décrite de digestion osseuse utilisant la collagénase et l’EDTA souvent jusqu’à la fraction 823, prend plusieurs heures au cours desquelles la viabilité des ostéocytes est taxée. Des chercheurs ont rapporté utiliser des fractions (2\u20125) pour le tri cellulaire 20, et ont montré que le profil d’expression des gènes associés aux ostéocytes par rapport à ceux des ostéoblastes confirme le succès de l’isolement des populations d’ostéocytes purs20. Dans cet article, nous décrivons le processus d’obtention des fractions (2\u20125), et nous comparons le rendement des ostéocytes de chaque fraction en commençant par la fraction 1 à 8 pour déterminer le retour des ostéocytes dans chaque fraction. Nous décrivons également la dissection du calvaria de souris dmp1-topaze nouveau-née et la digestion calvariaire à l’aide de collagénase et d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), ainsi que la préparation de cellules pour FACS.

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Protocole

Toutes les procédures et tous les soins aux animaux ont été effectués conformément aux règles et règlements de l’Université de Tohoku.

1. Dissection du calvaire de souris dmp1-topaze nouveau-né

  1. Pour ce protocole, utilisez des petits de 6 à jours de souris C57BL/6-Tg(Dmp1-Topaz)1Ikal/J. Euthanasier les souris avec une inhalation d’isoflurane à 5%, puis transférer les petits dans de l’éthanol à 70%.
  2. Transférer le chiot euthanasié dans un plat de culture non traité.
  3. À l’aide de ciseaux et de pincettes, saisissez la peau à la base du crâne et faites une incision.
  4. En utilisant la première incision comme point de départ, coupez les deux côtés latéraux du crâne devant les oreilles, retirez la peau et exposez le calvaire.
  5. Tenez la tête de l’arête nasale et coupez le calvaire le long de la suture lambdoïde. Coupez le long des bords latéraux des os pariétaux et étendez-le pour inclure la partie frontale.
  6. Séparez le calvaire du tissu cérébral sous-jacent.
    REMARQUE: Pour assurer un calvaire osseux propre avec une fixation minimale des tissus mous, ne coupez pas profondément dans l’os; Pour référence, on devrait pouvoir voir l’ombre des ciseaux sous l’os.
  7. Transférer le calvaire dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4 tout au long du protocole). Assurez-vous que la partie concave est orientée vers le haut.

2. Fractionnement du calvaire de souris nouveau-né

  1. Transvaser jusqu’à 5 calvariae dans un tube conique de 50 mL contenant 5 mL de solution de collagénase à 2 mg/mL. Utilisez une solution de collagénase fraîche préparée juste avant utilisation.
    1. Pour préparer une solution de collagénase fraîche, ajouter la poudre de collagénase au tampon d’isolement (70 mM de NaCl, 10 mM de NaHCO3, 60 mM de sorbitol, 3 mM K 2 HPO4, 1 mM de CaCl 2, 1 mg/mL d’albumine sérique bovine (BSA), 5 mg/mL de glucose et 25 mM de HEPES) à 2mg/mL. Dissoudre la poudre de collagénase sur un agitateur magnétique.
    2. Faites passer la solution de collagénase à travers une unité filtrante stérile de 0,22 μm dans un tube de 50 ml et gardez-la sur la glace tout au long du protocole.
  2. Incuber le calvaire à 37 °C pendant 20 min sur un agitateur à 300 rpm pour obtenir la fraction 1.
  3. Jeter la digestion de la fraction 1, laver le calvaire avec 5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et jeter le lavage.
  4. Incuber le calvaire dans 5 mL d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) 5 mM contenant 1 mg/mL de BSA dans du PBS, PH 7,4 à 37 °C pendant 15 min sur un agitateur à 300 tr/min.
  5. Recueillir le digest dans un tube conique de 50 mL. Laver le calvaire avec 5 mL de PBS et ajouter la solution de lavage à la digestion.
    NOTE: À chaque étape de la collecte de la digestion et du lavage, pipeter les os dans leur solution pour détacher les cellules de l’os et empêcher les doublets et les agrégats cellulaires.
  6. Pour obtenir la fraction 2, centrifuger le digest à 300 x g à 4 °C pendant 5 min. Jeter le surnageant, remettre en suspension la pastille dans 8 mL de milieu essentiel (MEM) α-minimum contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 100 UI/mL de pénicilline G et 100 μg/mL de streptomycine. Semer sur un plat de culture de 10 cm. Incuber la fraction 2 à 37 °C sous 5 % de CO2.
  7. Incuber le calvaire dans 5 mL de solution de collagénase à 37 °C pendant 20 min sur un agitateur à 300 rpm.
  8. Pour collecter la fraction 3, répétez les étapes 2.5\u20122.6. Incuber la fraction 3 à 37 °C sous 5 % de CO2.
    REMARQUE: À ce stade, les os deviendront plus petits et ils seront réduits en fragments. Pour vous assurer qu’aucun os n’est accidentellement aspiré dans les digestes, ce qui entraîne une perte de cellules dans le processus, utilisez une petite pipette à pointe pour recueillir les digestes (1000 à 2000 μL d’embouts de pipette).
  9. Incuber le calvaire dans 5 mL de solution de collagénase à 37 °C pendant 20 min sur un agitateur à 300 rpm.
  10. Pour collecter la fraction 4, répétez les étapes 2.5\u20122.6. Incuber la fraction 4 à 37 °C sous 5 % de CO2.
  11. Incuber le calvaire dans 5 mL de 5 mM d’EDTA contenant 1 mg/mL de BSA dans du PBS (pH 7,4) à 37 °C pendant 15 min sur un agitateur à 300 rpm.
  12. Pour collecter la fraction 5, répétez les étapes 2.5\u20122.6. Incuber la fraction 5 à 37 °C sous 5 % de CO2. Les ostéocytes peuvent être préparés pour le tri le même jour ou cultivés jusqu’à 24 heures avant le tri.

3. Préparation des ostéocytes pour le tri cellulaire activé par fluorescence

  1. Aspirer le milieu de chaque fraction cellulaire et laver doucement avec 10 mL de PBS deux fois.
  2. Ajouter 5 mL de trypsine-EDTA à 0,5 % dans du PBS et incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C. Ajouter 5 mL de FBS à 10 % α-MEM et pipette pour détacher délicatement les cellules. Combiner les cellules de chaque fraction en tamisant une crépine cellulaire de 40 μm dans un tube centrifuge conique de 50 mL.
  3. Laver les cellules avec 10 ml de PBS et recueillir en tamisant à travers une crépine cellulaire de 40 μm dans un tube à centrifuger conique de 50 ml. Centrifuger les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min.
  4. Aspirer le surnageant et ajouter 10% FBS α-MEM à la pastille. Ajuster la concentration cellulaire à environ 1 x 107 cellules/mL.
  5. Filtrer les cellules dans un tube à mailles en nylon de 35 μm. Les cellules sont maintenant prêtes pour FACS.
  6. Pour ce protocole, utilisez une buse de 100 μm. Le liquide de collecte doit être composé de 10% de FBS α-MEM. Maintenir l’échantillon trié sous agitation et à 4 °C pendant toute la durée du tri si possible.
  7. Avant le tri, optimisez les points de contrôle pour supprimer les artefacts et les cellules en ajustant la zone de diffusion latérale (SSC) et la zone de diffusion vers l’avant (FSC). Éliminez les doublets en ajustant la largeur SSC par rapport à la hauteur SSC et la surface FSC par rapport à la largeur FSC. Les ostéocytes GFP négatifs doivent être utilisés comme contrôle pour ajuster les paramètres de l’instrument de tri.
  8. Une fois la collecte des cellules terminée, centrifuger les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 10 min. Lavez les cellules avec du PBS. Centrifuger les cellules à 300 x g à 4 °C pendant 5 min.
  9. Remettez les cellules en suspension et ajustez le nombre comme vous le souhaitez en utilisant 10% FBS α-MEM.

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Résultats

Le but de ce protocole est de démontrer le processus d’obtention de cultures d’ostéocytes primaires à partir de calvaire de souris néonatale dmp1-topaze par un processus de fractionnement utilisant la collagénase pour dégrader la matrice de collagène et l’EDTA pour la chélation du calcium, après quoi les cellules sont préparées pour FACS afin de séparer les ostéocytes des autres populations cellulaires.

Les méthodes d’obtention des ostéocytes primaires du calvaire de souris néonatale décrivent...

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Discussion

Le premier ostéocyte isolé provenait d’un poulet calvaria7 isolé à l’aide de (OB7.3) ou de la variante aviaire de PHEX; Cependant, cette méthode est limitée par la disponibilité d’anticorps exploitables, car des anticorps spécifiques aux ostéocytes qui sont également spécifiques à l’espèce doivent être fabriqués. Les chercheurs ont utilisé une modification différente du processus enzymatique séquentiel pour obtenir des ostéocytes à partir d’os longs de souris et de rats; La pureté déclarée de ces ...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu en partie par une subvention JSPS KAKENHI de la Société japonaise pour la promotion de la science (n ° 19K10397 à H.K. et n ° 18K09862 à I.M.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
BD FACSDiva softwareBD BiosciencesAcquisition et analyse de données
BD Falcon TubeBD Biosciences352235Tube de 12 x 75 mm avec capuchon de crépine de cellule, 35 &mu ; Maille en nylon M.
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-Aldrich, MO, États-Unis
CollagenaseWako, Osaka, Japon034-223630,2 % (p/v), mélange brut de collagénase provenant de C. histolyticum.
EDTADojindo, Kumamoto, Japon5 mM d’EDTA préparé avec 0,1 % de BSA
FACSAriaTM IIBD Biosciences
Sérum de veau fœtal (FBS)Biowest, Nuaillé ;, France
Tampon70 mM NaCl, 10 mM NaHCO, 60 mM de sorbitol, 3 mM K2HPO4, 1 mM CaCl2, 0,1 % (p/v) BSA, 0,5 % (p/v) de glucose et 25 mM HEPES
Millex Unité de filtre stérileMerck Millipore, IrlandeSLGV033RS0,22&mu ; m
Crépine à cellules en nylonFALCON, NY, USA40&mu ; m
Trypsin-EDTALife Technologies, NY, États-Unis0,5 % x10. dilué à x1 dans du PBS
&alpha ;-MEMWako, Osaka, JaponContenant 10 % de sérum fœtal bovin, 100 UI/ml de pénicilline G et 100 &mu ; g/ml de streptomycine
d’isolement

Références

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