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Article de méthode

Isolement des noyaux à partir de tumeurs cérébrales fraîchement congelées pour l’ARN-seq à noyau unique et ATAC-seq

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DOI :

10.3791/61542

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25 août 2020

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1Neurology Clinic and National Center for Tumor Diseases, University Hospital Heidelberg, 2Bioinformatics and Omics Data Analytics, German Cancer Research Center (DKFZ), 3Clinical Cooperation Unit Neurooncology, German Cancer Research Center (DKFZ), 4Division of Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery, University of Heidelberg, INF 400, Heidelberg, Germany

Dans cet article

Résumé

L’hétérogénéité intratumorale est une caractéristique inhérente aux tumeurs, y compris les gliomes. Nous avons développé un protocole simple et efficace qui utilise une combinaison de tampons et de centrifugation par gradient pour isoler des noyaux uniques à partir de tissus de gliome frais congelés pour des études de séquençage de l’ARN à noyau unique et de l’ATAC.

Résumé

Les gliomes diffus adultes présentent une hétérogénéité inter- et intra-tumorale. Jusqu’à récemment, la majorité des efforts de profilage moléculaire à grande échelle se concentraient sur des approches en vrac qui ont conduit à la classification moléculaire des tumeurs cérébrales. Au cours des cinq dernières années, les approches de séquençage unicellulaire ont mis en évidence plusieurs caractéristiques importantes des gliomes. La majorité de ces études ont utilisé des échantillons de tumeurs cérébrales fraîches pour isoler des cellules individuelles en utilisant la cytométrie en flux ou des méthodes de séparation à base d’anticorps. À l’avenir, l’utilisation d’échantillons de tissus fraîchement congelés provenant de biobanques offrira une plus grande flexibilité aux applications unicellulaires. De plus, à mesure que le champ unicellulaire progresse, le prochain défi consistera à générer des données multi-omiques à partir d’une seule cellule ou de la même préparation d’échantillon pour mieux démêler la complexité tumorale. Par conséquent, des protocoles simples et flexibles qui permettent la génération de données pour diverses méthodes telles que le séquençage de l’ARN à noyau unique (snRNA-seq) et le test à noyau unique pour la chromatine accessible par transposase avec séquençage à haut débit (snATAC-seq) seront importants pour le domaine.

Les progrès récents dans le domaine des cellules uniques, associés à des instruments microfluidiques accessibles tels que la plate-forme génomique 10x, ont facilité les applications unicellulaires dans les laboratoires de recherche. Pour étudier l’hétérogénéité des tumeurs cérébrales, nous avons développé un protocole amélioré pour l’isolement des noyaux simples des gliomes fraîchement congelés. Ce protocole fusionne les protocoles existants à cellule unique et combine une étape d’homogénéisation suivie d’une filtration et d’une centrifugation de gradient médiée par tampon. Les échantillons résultants sont des suspensions pures à noyau unique qui peuvent être utilisées pour générer des données sur l’expression génique d’un seul noyau et l’accessibilité de la chromatine à partir de la même préparation de noyaux.

Introduction

Les gliomes diffus de bas grade (LGG), la tumeur cérébrale primaire la plus courante chez l’adulte, sont des néoplasmes infiltrants qui surviennent souvent dans l’hémisphère cérébral. Les LG présentent à la fois une hétérogénéité inter- et intra-tumorale, qui n’est pas seulement entraînée par la population tumorale, mais aussi par les cellules non malignes impliquées de manière complexe dans le développement et la progression de la tumeur1,2,3,4,5.

Au cours de la dernière décennie, il y a eu une avalanche de données génomiques recueillies dans le domaine des gliomes. Ces données proviennent principalement d’études de séquençage de tumeurs en vrac et ont énormément contribué à la caractérisation moléculaire et à la classification actuelle des tumeurs cérébrales5,6,7,8,9,10,11. Cependant, même si ces études ont révélé le vaste paysage moléculaire associé aux gliomes, il y a encore un manque décevant de progrès en matière d’intervention thérapeutique. L’un des obstacles à la résistance au traitement dans les tumeurs cérébrales est l’hétérogénéité intra-tumorale. Pour résoudre ce problème, diverses études se sont concentrées sur l’hétérogénéité génomique, transcriptomique, protéomique et épigénétique présente dans une tumeur au niveau d’une seule cellule12,13,14,15,16,17.

Bien qu’il y ait eu des progrès technologiques remarquables dans le domaine des cellules uniques au cours des deux dernières années, l’un des principaux facteurs limitants est la disponibilité de nouveaux spécimens nécessaires pour isoler les cellules et effectuer ces expériences. Pour surmonter cette limitation, il y a eu plusieurs tentatives réussies d’effectuer des tests, tels que snRNA-seq et snATAC-seq à partir de tissus congelés, en utilisant des noyaux plutôt que des cellules18,19. La majorité de ces méthodes reposent sur le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou sur des stratégies de filtration. Les approches à cellule unique et à noyau unique ont leurs forces et leurs inconvénients. Les approches unicellulaires maintiennent les transcriptions mitochondriales, qui, bien qu’elles puissent être informatives, peuvent également réduire la couverture du transcriptome en raison de leur grande abondance. Les approches d’isolement des noyaux simples éliminent un pourcentage élevé de la fraction mitochondriale, permettant ainsi une couverture plus approfondie des transcriptions nucléaires20.

Il existe diverses plates-formes disponibles dans le commerce qui ont été utilisées au cours des dernières années pour analyser les données génomiques unicellulaires, y compris RNA-seq et ATAC-seq. L’une des plates-formes les plus importantes est la plate-forme 10x Genomics Chromium pour l’expression de gènes unicellulaires et le profilage ATAC unicellulaire. Comme la plate-forme fonctionne à l’aide de chambres microfluidiques, tout débris ou agrégats peut obstruer le système, entraînant une perte de données, de réactifs et d’échantillons cliniques précieux. Par conséquent, le succès des études sur une seule cellule dépend en grande partie de l’isolement précis des cellules / noyaux individuels.

Le protocole que nous allons démontrer ici est une combinaison légèrement modifiée des protocoles DroNc-seq et Omni-ATAC-seq, et utilise une approche similaire aux études récentes qui utilisent snRNA-seq pour comprendre les troubles neurologiques et les types de cellules neuronales dans le cerveau humain18,19,21,22,23,24. Le protocole utilise une combinaison de dissociation enzymatique/mécanique des échantillons congelés suivie d’une filtration et d’une centrifugation par gradient et permet une isolation rapide et précise des noyaux simples des tissus de gliome frais congelés. Nous avons utilisé avec succès ce protocole pour générer des données snRNA-seq et snATAC-seq à partir de la même préparation de noyaux à partir d’échantillons de tumeurs cérébrales.

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Protocole

Des échantillons de gliome frais congelés ont été obtenus à partir de la banque de tissus du Centre national des maladies tumorales (NCT) à Heidelberg, en Allemagne. L’utilisation de matériel patient a été approuvée par le Comité d’examen institutionnel de la Faculté de médecine de Heidelberg, et le consentement éclairé a été obtenu de tous les patients inclus dans l’étude.

1. Préparation expérimentale

  1. Effectuez toutes les étapes sur de la glace ou à 4 °C.
  2. Pré-refroidir les tubes, la vaisselle, les lames de rasoir, les douncers et les pilons à 4 °C.
  3. Préparez tous les tampons à l’avance. Ces tampons sont stables à température ambiante. Une filtration stérile est recommandée, en particulier pour le saccharose. Les préparations de stock sont modifiées à partir de Corces et al.19. Voir tableaux 1 à 7.
  4. Prélever les échantillons de l’azote liquide ou du congélateur à -80 °C et les conserver sur de la glace carbonique jusqu’à l’étape 2.1.

2. Dissection et dissociation tissulaires

  1. Transférer l’échantillon de tissu frais congelé (10-60 mg) dans une boîte de Petri pré-réfrigérée. Hacher / hacher les tissus frais congelés avec une lame de rasoir en petits morceaux sur de la glace.
  2. Ajouter 500 μL de tampon de lyse des noyaux réfrigérés dans un tube pré-réfrigéré de 1,5 mL. Placez les morceaux de tissu dans le tube de 1,5 mL contenant le tampon de lyse des noyaux et transférez-les dans un Douncer(Table des matériaux).
    REMARQUE: Il existe deux pilons homogénéisateurs Dounce: pilon « lâche » ou « A » pour la réduction initiale de l’échantillon et pilon « serré » ou « B » pour l’homogénéisation complète de l’échantillon.
  3. Dounce les morceaux de tissu avec le pilon « lâche » pendant environ 20 coups, jusqu’à ce que la friction soit réduite. Si des débris sont présents, l’échantillon peut être pré-nettoyé par filtration avec une passoire de 100 mm.
  4. Dounce avec le pilon « serré » pendant 20 coups pour obtenir une homogénéisation complète des tissus.
  5. Transférer l’homogénat (environ 500 μL) dans un tube pré-réfrigéré de 2 mL. Ajouter 1 mL de tampon de lyse réfrigéré. Mélanger doucement et incuber sur de la glace pendant 5 min. Mélanger doucement avec une pointe de pipette à large alésage et répéter 1 à 2 fois pendant l’incubation.
  6. Filtrer l’ensemble de l’homogénat à l’aide d’un maillage de crépine de 30 μm, recueillir dans un tube Falcon de 15 mL et transférer dans un nouveau tube pré-refroidi de 2 mL. Une seule passoire est généralement suffisante pour l’ensemble de l’homogénat.
  7. Vérifiez au microscope optique l’élimination des gros débris et l’intégrité de la membrane nucléaire. Les noyaux doivent être ronds et la membrane nucléaire ne doit pas être déformée. Si des débris sont présents, les noyaux peuvent être refiltrés.
  8. Centrifuger les noyaux à 500 x g pendant 5 min à 4 °C sur une centrifugeuse de paillasse. Retirez le surnageant, en laissant derrière lui ~50 μL avec la pastille contenant les noyaux. Remettez doucement la pastille dans un autre tampon de lyse des noyaux de 1 mL et incubez pendant 5 min sur de la glace.
  9. Centrifuger les noyaux à 500 x g pendant 5 min à 4°C. Retirer le surnageant sans déranger la pastille, ajouter 500 mL de 1x tampon d’homogénéisation (HB)(Tableau 4)et incuber pendant 5 min sans ressusser. Ensuite, ressuspendez les noyaux dans un autre 1,0 mL de 1x HB.
  10. Centrifuger les noyaux à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant et remettez doucement les noyaux en 200 μL de 1x HB dans un nouveau tube de 2,0 mL.

3. Centrifugation par gradient

  1. Ajouter 200 μL de solution d’iodixanol à 50 % (Tableau 5) pour donner une concentration finale de 25 % d’iodixanol. Bien mélanger 10 fois avec une pipette réglée sur 300 mL.
  2. Ajouter 300 μL de solution d’iodixanol à 29 % (tableau 6) sous le mélange à 25 %. Utilisez une pointe fine P1000 pour éviter le mélange des couches.
  3. Ajouter 300 μl de solution d’iodixanol à 35 % (tableau 7) sous le mélange à 29 %. Utilisez une pointe fine P1000 pour éviter le mélange des couches.
    Attention : Cette étape nécessite le retrait progressif de l’embout de la pipette pendant le pipetage pour éviter un déplacement de volume excessif.
  4. Placez les échantillons dans une centrifugeuse à godet oscillant, faites tourner pendant 20 min à 3 500 x g à 4 °C avec le frein éteint.
  5. Retirez doucement les échantillons sans secouer et observez sous la lumière. Une bande blanche claire de noyaux purs à 95 % doit être visible entre la deuxième et la troisième couche(Figure 1).

4. Isolement des noyaux

  1. Aspirer les couches supérieures jusqu’à ce que les noyaux blancs bandent à l’interphase de 29% à 35%.
  2. Recueillir la bande nucléique dans un volume de 200 mL, transférer dans un tube frais et filtrer avec un filtre de 20 μm (Table des matériaux).
    REMARQUE: Les noyaux n’ont pas besoin d’être ressuspendés avant la filtration.
  3. Vérifiez au microscope optique l’élimination des gros débris et l’intégrité de la membrane nucléaire. Les noyaux doivent être ronds et la membrane nucléaire ne doit pas être déformée.
  4. Compter les noyaux à l’aide de la coloration bleue de Trypan sur un hémocytomètre et les noyaux aliquotes pour snRNA-seq/snATAC-seq.

5. ARN à noyau unique et ATAC seq

  1. Traiter immédiatement les noyaux à l’aide de l’expression génique unicellulaire et des kits de réactifs ATAC unicellulaires (Table des matériaux).
    REMARQUE: Les concentrations d’échantillons de noyaux pour le système 10x Genomics sont de 1500-3000 noyaux par μL pour snRNA-seq, et de 3500-7000 noyaux par m μL pour snATAC-seq. Les noyaux peuvent être dilués à l’aide de 1x PBS.
  2. Séquencer les bibliothèques résultantes à l’installation centrale de génomique.
  3. Effectuer une analyse de contrôle de la qualité des données. Les noyaux sont inclus pour une analyse plus approfondie s’ils contiennent un identificateur moléculaire unique (UMI) >1000, le nombre de gènes >500 et le pourcentage de gènes mitochondriaux <5%, et sont dans la moyenne + trois écarts-types des UMI et des gènes.

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Résultats

La génomique à noyau unique est un domaine en évolution avec des données et des protocoles limités. Un facteur critique qui influence le résultat des tests à noyau unique est l’isolement des noyaux purs et intacts. Nous avons combiné deux protocoles publiés (protocoles DroNc-seq et Omni-ATAC-seq) pour isoler des noyaux purs et de haute qualité à partir de blocs de tissus de gliome frais congelés dans un temps relativement court, maintenant ainsi la stabilité des transcriptions(Figure 1).

...

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Discussion

Le domaine de l’hétérogénéité intra-tumorale est à un stade passionnant, avec de nouveaux tests et plates-formes en cours de développement pour remettre en question et élargir les connaissances existantes. L’hétérogénéité intratumorale est un facteur crucial qui contribue à la progression de la maladie et à la résistance aux modalités de traitement actuelles dans les gliomes28. Des études récentes sur les tumeurs cérébrales se sont concentrées sur cet aspect important en utilisant des tests transc...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Nous remercions le Single Cell Open Lab (scOpenLab) du Centre allemand de cancérologie (DKFZ) pour ses discussions utiles. Cette recherche a été soutenue par le programme allemand d’aide contre le cancer, le programme Max-Eder numéro 70111964 (S.T.).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-MercaptoethanolSigmaM6250
CaCl2Sigma21115-100ML
Dounce HomogénéisateurMotif actif40401
EDTA (0,5 M)Thermo ScientificR1021
Falcon 15 mL Tubes à centrifuger coniquesFisher Scientific352096
Iodixanol (aka Optiprep)Stem cell technologies07820
MACs Smart Strainers (30 µ ; m)Miltenyi Biotec130-098-458
MACS SmartStrainers (100 µ ; m)Miltenyi Biotec130-098-463
Mg(Ac)2Sigma63052-100ML
NP-40Abcamab142227
Kit d’isolation des noyaux : Nuclei EZ PrepSigmaNUC101-1KT
Fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)SigmaP7626
Filtres de pré-séparation (20 µ ; m)Miltenyi Biotec130-101-812
Tubes de sécurité 1,5 mLEppendorf0030120086
Tubes de sécurité 2,0 mLEppendorf0030120094
Single Cell ATAC10x Genomics
Single Cell Gene Expression10x Genomics
SucroseSigmaS0389
Pointes de pipette à alésage large (1000 & micro ; L)Themo Fisher Scientific2079GPK
Pointes de pipette à large calibre (200 µ ; L)Themo Fisher Scientific2069GPK

Références

  1. Huse, J. T., Holland, E. C. Targeting brain cancer: advances in the molecular pathology of malignant glioma and medulloblastoma. Nature Reviews Cancer. 10 (5), 319-331 (2010).
  2. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell Stem Cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  3. Filbin, M. G., Suva, M. L. Gliomas Genomics and Epigenomics: Arriving at the Start and Knowing It for the First Time. Annual Review of Pathology. 11, 497-521 (2016).
  4. Ferris, S. P., Hofmann, J. W., Solomon, D. A., Perry, A. Characterization of gliomas: from morphology to molecules. Virchows Archive. 471 (2), 257-269 (2017).
  5. Louis, D. N., et al. The 2016 World Health Organization Classification of Tumors of the Central Nervous System: a summary. Acta Neuropathologica. 131 (6), 803-820 (2016).
  6. Eckel-Passow, J. E., et al. Glioma Groups Based on 1p/19q, IDH, and TERT Promoter Mutations in Tumors. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2499-2508 (2015).
  7. Suzuki, H., et al. Mutational landscape and clonal architecture in grade II and III gliomas. Nature Genetics. 47 (5), 458-468 (2015).
  8. Cancer Genome Atlas Research. Comprehensive, Integrative Genomic Analysis of Diffuse Lower-Grade Gliomas. The New England Journal of Medicine. 372 (26), 2481-2498 (2015).
  9. Noushmehr, H., et al. Identification of a CpG island methylator phenotype that defines a distinct subgroup of glioma. Cancer Cell. 17 (5), 510-522 (2010).
  10. Yan, H., et al. IDH1 and IDH2 mutations in gliomas. The New England Journal of Medicine. 360 (8), 765-773 (2009).
  11. Yan, H., Bigner, D. D., Velculescu, V., Parsons, D. W. Mutant metabolic enzymes are at the origin of gliomas. Cancer Research. 69 (24), 9157-9159 (2009).
  12. Gawad, C., Koh, W., Quake, S. R. Single-cell genome sequencing: current state of the science. Nature Reviews Genetics. 17 (3), 175-188 (2016).
  13. Tanay, A., Regev, A. Scaling single-cell genomics from phenomenology to mechanism. Nature. 541 (7637), 331-338 (2017).
  14. Wu, M., Singh, A. K. Microfluidic Flow Cytometry for Single-Cell Protein Analysis. Methods in Molecular Biology. 1346, 69-83 (2015).
  15. Schwartzman, O., Tanay, A. Single-cell epigenomics: techniques and emerging applications. Nature Reviews Genetics. 16 (12), 716-726 (2015).
  16. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  17. Buenrostro, J. D., et al. Single-cell chromatin accessibility reveals principles of regulatory variation. Nature. 523 (7561), 486-490 (2015).
  18. Habib, N., et al. Massively parallel single-nucleus RNA-seq with DroNc-seq. Nature Methods. 14 (10), 955-958 (2017).
  19. Corces, M. R., et al. An improved ATAC-seq protocol reduces background and enables interrogation of frozen tissues. Nature Methods. 14 (10), 959-962 (2017).
  20. Slyper, M., et al. A single-cell and single-nucleus RNA-Seq toolbox for fresh and frozen human tumors. Nature Medicine. 26 (5), 792-802 (2020).
  21. Mathys, H., et al. Single-cell transcriptomic analysis of Alzheimer's disease. Nature. 570 (7761), 332-337 (2019).
  22. Krishnaswami, S. R., et al. Using single nuclei for RNA-seq to capture the transcriptome of postmortem neurons. Nature Protocols. 11 (3), 499-524 (2016).
  23. Al-Dalahmah, O., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies Huntington disease astrocyte states. Acta Neuropathologica Communications. 8 (1), 19(2020).
  24. Jakel, S., et al. Altered human oligodendrocyte heterogeneity in multiple sclerosis. Nature. 566 (7745), 543-547 (2019).
  25. Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E., Satija, R. Integrating single-cell transcriptomic data across different conditions, technologies, and species. Nature Biotechnology. , (2018).
  26. Lake, B. B., et al. Integrative single-cell analysis of transcriptional and epigenetic states in the human adult brain. Nature Biotechnology. 36 (1), 70-80 (2018).
  27. Stuart, T., et al. Comprehensive Integration of Single-Cell Data. Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).
  28. Bready, D., Placantonakis, D. G. Molecular Pathogenesis of Low-Grade Glioma. Neurosurgery Clinics of North America. 30 (1), 17-25 (2019).
  29. Venteicher, A. S., et al. Decoupling genetics, lineages, and microenvironment in IDH-mutant gliomas by single-cell RNA-seq. Science. 355 (6332), (2017).
  30. Tirosh, I., et al. Single-cell RNA-seq supports a developmental hierarchy in human oligodendroglioma. Nature. 539 (7628), 309-313 (2016).
  31. Weng, Q., et al. Single-Cell Transcriptomics Uncovers Glial Progenitor Diversity and Cell Fate Determinants during Development and Gliomagenesis. Cell Stem Cell. 24 (5), 707-723 (2019).
  32. Neftel, C., et al. An Integrative Model of Cellular States, Plasticity, and Genetics for Glioblastoma. Cell. 178 (4), 835-849 (2019).
  33. Al-Ali, R., et al. Single-nucleus chromatin accessibility reveals intratumoral epigenetic heterogeneity in IDH1 mutant gliomas. Acta Neuropathologica Communications. 7 (1), 201(2019).

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