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Retard de l’accouchement intramyocardique des cellules souches après une blessure à l’Ischémie Reperfusion dans un modèle murine

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DOI :

10.3791/61546

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3 septembre 2020

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1Department of Cardiovascular Medicine, Mayo Clinic, 2Department of Radiology and Molecular Imaging Program at Stanford (MIPS), Stanford University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

Les cellules de tiges sont continuellement étudiées comme traitements potentiels pour des individus avec des dommages myocardiques, cependant, leur viabilité diminuée et la rétention dans les tissus blessés peuvent avoir un impact sur leur efficacité à long terme. Dans ce manuscrit, nous décrivons une méthode alternative pour l’administration de cellules souches dans un modèle murine de lésion de la reperfusion d’ischémie.

Résumé

Il y a un intérêt significatif dans l’utilisation des cellules souches (SC) pour le rétablissement de la fonction cardiaque dans les personnes avec des dommages myocardiques. Le plus souvent, la thérapie cardiaque de cellules souches est étudiée en fournissant des SC en même temps que l’induction des dommages myocardiques. Cependant, cette approche présente deux limites importantes : l’environnement ischémique pro-inflammatoire hostile précoce peut affecter la survie des SC transplantés, et elle ne représente pas le scénario d’infarctus subaigu où les SC seront probablement utilisés. Ici nous décrivons une série en deux parties des procédures chirurgicales pour l’induction des dommages d’ischémie-reperfusion et la livraison des cellules souches mésenchymales (MSCs). Cette méthode d’administration des cellules souches peut permettre une viabilité et une rétention plus longues autour des tissus endommagés en contournant la réponse immunitaire initiale. Un modèle de blessure de reperfusion d’ischémie a été induit chez des souris accompagnées de la livraison des cellules souches mésenchymales (3.0 x 105),exprimant stably le luciferase de luciferase de gène de journaliste sous le promoteur constitutivement exprimé de CMV, intramyocardially 7 jours plus tard. Les animaux ont été photographiés par ultrason et imagerie bioluminescente pour la confirmation des dommages et l’injection des cellules, respectivement. Fait important, il n’y avait aucun taux de complication supplémentaire lors de l’exécution de cette approche à deux procédures pour la livraison sc. Cette méthode d’administration des cellules souches, collectivement avec l’utilisation de gènes de reporter de pointe, peut permettre l’étude in vivo de la viabilité et de la rétention des SC transplantés dans une situation d’ischémie chronique couramment observée cliniquement, tout en contournant la réponse pro-inflammatoire initiale. En résumé, nous avons établi un protocole pour la livraison retardée des cellules souches dans le myocarde, qui peut être utilisé comme une nouvelle approche potentielle dans la promotion de la régénération des tissus endommagés.

Introduction

Les maladies cardiovasculaires demeurent la cause la plus fréquente de morbidité et de mortalité dans le monde. Les événements ischémiques cardiaques se sont avérés préjudiciables à la fonction globale du myocarde et des cellules environnantes1. Seulement ̴0,45-1,0% des cardiomyocytes se régénérera chaque année après des dommages myocardes se produit2. Malgré la demande croissante et l’accent inhérent sur le développement de traitements, les thérapies aidant à la régénération des tissus blessés ont été difficiles à établir et nécessitent encore une optimisation supplémentaire3,4,5. Les thérapies de cellules souches ont été introduites comme voie alternative pour rajeunir les tissus endommagés après un événement ischémique ; cependant, l’avancement de ces thérapies a été remis en question par la survie et la rétention limitées des cellules dans une zone blessée6.

Le microenvironnement du cœur après un événement ischémique peut être caractérisé comme hypoxique, pro-oxydant, et pro-inflammatoire, présentant des conditions hostiles pour les cellules souches thérapeutiques à s’adapter à la survie7,8. Comme une réponse immunitaire est déclenchée à la suite d’une blessure, les lymphocytes naïfs, les macrophages, les neutrophiles et les mastocytes tentent de réparer les dommages en enlevant les cellules mourantes et en modulant le processus de remodelage tissu9,10,11. Dans les 3 premiers jours post-ischémie, l’inflammation est à son apogée avec la libération de cytokines pro-inflammatoires avec un grand nombre de neutrophiles et monocytes dans la zone10,12. Après 7 jours, une grande partie de l’inflammation s’est calmée et la transition vers les cellules réparatrices commence, se poursuivant jusqu’à ce que la cascade de remodelage est terminée, environ 14 jours chez les souris13. Notre méthode chirurgicale est une approche alternative potentielle à l’introduction des produits biologiques dans le myocarde pour contourner la réponse immunitaire innée de pointe après la blessure de reperfusion d’ischémie. Dans le même temps, il permettra l’étude de tout traitement dans un état d’ischémie subaigue/chronique où il peut y avoir différentes variables à considérer par rapport à l’infarctus aigu du myocarde.

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Protocole

Les expériences ont été réalisées sur des souris femelles C57BL/6, âgées de 10 à 12 semaines et pesant 20-25 g. Toutes les procédures animales étaient conformes aux normes énoncées dans le Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (Institute of Laboratory Animal Resources, National Academy of Sciences, Bethesda, MD, USA) et ont été approuvées par le Mayo Clinic College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).

1. Préparation et intubation

  1. Autoclave tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Si plusieurs chirurgies doivent être effectuées en une seule séance, nettoyez les instruments après chaque animal et réstérilisez à l’aide d’un stérilisateur de perles chaudes.
  2. Anesthésiez les souris avec 3,5-4% d’isoflurane à 1 L/min O2 dans une chambre d’induction.
  3. Administrer la buprénorphine SR 1 mg/kg (analgésique) sous-cutanée, peser l’animal et entrer le poids dans le ventilateur.
  4. Raser le côté gauche de la poitrine du sternum au niveau de l’épaule et appliquer de la crème dépilatoire pour enlever l’excès de fourrure.
  5. Pour la procédure de reperfusion d’ischémie maintenir la pression positive d’expiration de fin (PEEP) sur le ventilateur à 2 cmH2O. Pour l’injection retardée des cellules procédure changer le PEEP à 3 cmH2O pour prévenir l’effondrement du poumon.
  6. Intuber l’animal à l’aide d’un tube endotrachéal de 20 G, transférer sur un coussin chauffant contrôlé pour maintenir une température corporelle de 35 à 37 °C.
  7. Placez la souris sur un ventilateur dans la réumbétrie latérale avec l’extrémité crânienne sur l’extrémité gauche et caudale sur la droite.
  8. Maintenir l’anesthésie à 2-2,5% isoflurane à 1 L/min O2 pour le reste de la procédure.
  9. Frottez la zone chirurgicale en alternant entre povidone-iode et écouvillons d’alcool trois fois et appliquez l’onguent ophtalmique aux deux yeux.

2. Blessure à la reperfusion d’Ischémie

  1. À l’aide d’un scalpel à lame #10 faire une incision verticale de 2,5 mm à droite du mamelon le plus gauche dans le champ de vision.
  2. À l’aide de ciseaux couper à travers les couches musculaires superficielles jusqu’à ce que les muscles intercostaux et les côtes sont visibles.
  3. Tout en soulevant les côtes et les tissus environnants, couper à travers l’espace intercostal entre les 4e et 5e côtes, puis insérer le rétracteur de paupières dans l’espace ouvert.
  4. Rétractez le péricarde à l’aide de forceps incurvés, en déplaçant le poumon vers le haut et hors de vue.
  5. Visualisez l’artère LAD et, à l’aide d’une suture en nylon 9-0, passez à travers le myocarde sous l’artère 2,5 mm distal à l’auricule gauche et attachez un nœud carré lâche.
  6. Couper 1 cm de tubes en polyéthylène et le placer dans le nœud lâche.
  7. Fixer la suture autour du tube, confirmer l’ischémie, puis relâcher après 35 min.
    REMARQUE : Confirmez l’ischémie par la pâleur et l’arythmie ventriculaire.
  8. Après avoir libéré la ligature et enlevé le tube, attendre 5 min pour confirmer la reperfusion du myocarde.
  9. Placez un tube de cathéter i.V. de 24 G dans la cavité thoracique un espace intercostal à droite de l’ouverture.
  10. Fermez l’incision intercostal avec une suture absorbable de 6-0 dans un simple motif interrompu.
  11. Fermez la couche musculaire avec une suture absorbable de 6-0 dans un motif de suture continue.
  12. Après avoir fermé la couche musculaire superficielle, retirer le tube thoracique tout en retirant l’air de la cavité thoracique à l’aide d’une seringue de tuberculine de 1 mL.
  13. Fermez l’incision de la peau avec une suture absorbable 6-0 dans un modèle de matelas horizontal continu
    REMARQUE : Des sutures en nylon et un motif de suture discontinue peuvent également être utilisés pour la couche cutanée.
  14. Administrer 1,5 mL de sous-cutanée saline chaude et appliquer un onguent triple antibiotique au site d’incision pour prévenir l’infection.
  15. Éteignez l’isoflurane et laissez l’animal respirer à travers le ventilateur à 100% O2 jusqu’à ce qu’il puisse respirer continuellement sans aide.
  16. Transférer la souris dans une cage sans literie ou dans une cage avec literie couverte (serviette en papier ou drapé) sur un tampon chaud à une température de 35 à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit entièrement récupérée.

3. Livraison de cellules souches mésenchymales de souris

REMARQUE : La souche de souris utilisée pour la procédure est une lignée consanguine et est considérée comme génétiquement identique. Les cellules souches mésenchymales ont été obtenues à partir d’animaux de la même souche et, par conception de protocole, l’immunosuppression n’a pas été induite1.

  1. Terminez les étapes de préparation et d’intubation comme cela a été fait précédemment pour la première procédure.
  2. Retirez la suture de la couche de peau à l’aide de ciseaux et de forceps.
  3. Avec un scalpel #10, faire une incision au même endroit que la chirurgie précédente.
  4. Continuer à utiliser le scalpel pour couper à travers le tissu cicatriciel jusqu’à ce que la suture de couche musculaire est visible
  5. À l’aide des ciseaux et des forceps, enlever la suture et couper la couche musculaire ouverte.
  6. Visualisez et retirez les sutures qui maintiennent les côtes ensemble et continuez à couper à travers le muscle intercostal de l’incision précédente.
    REMARQUE : Les poumons peuvent avoir adhéré à la paroi thoracique, si cela se produit, utiliser des forceps émoussés ou incurvés pour les séparer soigneusement et les relâcher.
  7. Placez le rétracteur de paupière dans l’espace intercostal et localisez la zone de la ligature précédente.
  8. Charger les cellules souches mésenchymales (3,0 x 105), suspendues dans 20 μL PBS, dans une seringue à insuline de 30 G, plier l’aiguille légèrement au besoin pour que l’angle approprié s’injecte.
    REMARQUE : Les cellules souches mésenchymales (MSC) ont été isolées du tissu adipeux des souris C56BL/6 de 4-6 semaines. Les cellules de passage précoce (p3) ont été transduites avec un vecteur exprimant le gène de luciferase de luciferase de lucfly sous le promoteur de CMV pour permettre la surveillance de la viabilité in vivo de cellules. La souris dérivée de l’adipeux MSC était caractérisée par une cytométrie de flux et les cellules étaient positives pour CD44, CD29, CD90 et CD105, mais négatives pour le marqueur hématopoïétique CD4514. Avant l’injection, les MSC étaient cultivés pendant au moins un passage afin d’éviter la perte de cellules du processus de dégel.
  9. Se déplaçant dans la direction de l’apex vers la base du cœur insérer la seringue dans la région péri-infarctus jusqu’à ce que l’ouverture de l’aiguille est complètement à l’intérieur du myocarde.
  10. Une fois à l’intérieur injecter lentement les cellules dans le myocarde, attendre 3 s, puis retirer l’aiguille.
  11. Observez le cœur de près pendant 3 min pour être sûr de ne pas avoir de réactions anormales aux cellules telles que la fibrillation ventriculaire.
  12. Placez un tube de cathéter iv de 24 G dans la cavité thoracique un espace intercostal à droite de l’ouverture.
  13. Fermez les couches intercostal, musculaire et cutanée et retirez le tube thoracique dans la même méthode que la première procédure.
  14. Administrer 1,5 mL de sous-cutanée saline chaude et appliquer un onguent triple antibiotique au site d’incision pour prévenir l’infection.
  15. Éteindre l’isoflurane et permettre à l’animal de respirer à travers le ventilateur à 100% O2 jusqu’à ce qu’il soit capable de respirer continuellement sans aide.
  16. Transférer la souris dans une cage sans literie ou dans une cage avec literie couverte (serviette en papier ou drapé) sur un tampon chaud à une température de 35 à 37 °C jusqu’à ce qu’elle soit entièrement récupérée.

4. Soins postopératoires suivant les deux procédures

  1. Observez l’animal en permanence jusqu’à ce que la respiration spontanée, la réumbétrie sternale et le mouvement normal soient établis.
  2. Continuer l’observation toutes les 15-30 min pendant au moins 3 h le jour de la chirurgie.
  3. Vérifiez les souris pour la déhiscence de blessure ou la douleur anormale une fois par jour pendant 5 jours, puis 2-3 fois par semaine.
  4. Si l’animal présente des signes de douleur (c.-à-d. dos arqué, mouvement minimal, grimace, ou fourrure débraillée) après 72 h post-op, fournir une dose supplémentaire de buprénorphine SR analgésique.

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Résultats

La blessure de reperfusion d’Ischémie a été induite chez des souris le jour 0, suivie d’un échocardiogramme post-opératoire et d’un électrocardiogramme le jour précédant l’implantation de cellules souches. L’analyse échographique et électrocardiogramme a confirmé l’infarctus et la diminution de la fonction contractile ventriculaire (figure 1A-D). Un examen plus approfondi des données a montré que la fraction d’éjection et le raccourcissement fractionné ont été diminués chez ...

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Discussion

Plus de 85 millions de personnes dans le monde sont touchées par les maladies cardiovasculaires3. La prévalence élevée de ces événements ischémiques justifie le développement et l’expansion de thérapies alternatives pour promouvoir la régénération des tissus endommagés. Les méthodes traditionnelles utilisent la procédure de reperfusion d’ischémie dans un cadre aigu avec l’administration ultérieure des thérapies1. Les réactions inflammatoires sont à son apogée entre 3-4 jour...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,9 % NaCl Irrigation, USPBaxter0338-0048-04
11x12 » Press n’Seal Champ chirurgical, autoclavableSAI Infusion TechnologiesPSS-SD
24G 3/4 » Tube de cathéter IVJelco4053
28G x 1/2 » 1mL seringue d’allergieBD305500Injection d’analgésique
30G x 1/2 » 3/10cc seringue à insulineUlticare08222.0933.56Injection de cellules souches
6-0 S-29, 12 » Suture vicryleEthiconJ556GFermeture d’incision intercostale, musculaire superficielle et cutanée
9-0 BV100-4, 5 » Suture Ethicon2829GLigature de l’artère LAD
Sous-couche absorbanteThermo Fischer Scientific14-206-64Pour sous l’animal
Coussinets de préparation à l’alcool, 2 plis, moyenCoviden6818
Masque facial anti-buéeHalyard49235
Bonn Ciseaux à strabisme, incurvés, émoussésOutils de science fine14085-09
Buprénorphine HCL SR LAB 1mg/ml, 5 mlZooPharm PharmacyBuprénorphine Analgésique narcotique formulé dans un polymère qui ralentit l’absorption prolongeant la durée d’action (durée de 72 heures de activité).
Castroviejo Porte-aiguilles, courbéFine Science Tools12061-01
Curity éponges de gaze stérilesCoviden397310
Pince à faire des sutures délicates, 45 angle courbéeFine Science Tools11063-07
Rasoir électriqueWahlÉpilation de la
Isoflurane 100 mlCardinal HealthPI23238Anesthésique
Blouse
Monoject 1 mL seringue hypodermiqueCoviden8881501400
Pince à iris Moria, incurvée, dentelée (x2)Fine Science Tools11370-31
Moria speculum retractorFine Science Tools17370-53
Kit d’intubation endotrachéale de sourisKent
Nair crème dépilatoireJohnson & JohnsonFur removal
Optixcare lubrifiant oculaire plusAventixLubrifiant oculaire stérile
Ventilateur PhysiosuiteKent Scientific
PolyE Tube en polyéthylèneHarvard Apparatus72-0191Compression temporaire de l’artère LAD
Écouvillons en povidone iodéPDIS41125
Scalpel, 10 lamesBard-Parker371610
Applicateurs stériles à embout en coton 3 »Cardinal HealthC15055-003
Applicateurs stériles à embout conique en coton 6 »Puritan25-826-5WC
Gants stérilesCardinal HealthN8830
Sachets de stérilisationMedlineMPP100525GS
Capuchonchirurgical
Microscope chirurgicalLeicaM125
Pince à suture, droite (x2)Fine Science Tools10825-10
Ruban chirurgical Transpore3M1527-1
Pommade antibiotique tripleG& W Laboratories11-2683ILNC2Application topique pour prévenir l’infection
Vannas-Tü ; bingen Ciseaux à ressort, incurvéFine Science Tools15004-08
Vaporisateur VetfloKent Scientific
fourrurede laboratoire Scientific

Références

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Mots-clés

Administration retard e de cellules souchescellules souches m senchymateusesinjection intramyocardiqueimagerie bioluminescenteprotocole chirurgicalsuivi de la fonction cardiaquevaluation de la viabilit cellulairetraitement post l sionnel

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