Scrunching planaire comme une lecture comportementale quantitative pour la détection de stimuli nocifs

Résumé

Les planaires d’eau douce présentent trois démarches (glisse, péristalse et scrunching) qui se distinguent par l’analyse comportementale quantitative. Nous décrivons une méthode pour induire le scrunching utilisant divers stimuli nocifs, quantification de celui-ci, et la distinction du péristaltisme et de la glisse. En utilisant le knockdown de gène, nous démontrons la spécificité du scrunching comme lecture phénotypique quantitative.

Résumé

Les planaires d’eau douce glissent normalement en douceur à travers la propulsion ciliaire sur leur côté ventral. Certaines conditions environnementales, cependant, peuvent induire des formes de locomotion axées sur la musculature : péristalse ou scrunching. Tandis que le péristaltisme résulte d’un défaut ciliaire, le scrunching est indépendant de la fonction de cils et est une réponse spécifique à certains stimuli, y compris l’amputation, la température nocive, le pH extrême, et l’éthanol. Ainsi, ces deux démarches musculature-conduites sont mécanistement distinctes. Cependant, ils peuvent être difficiles à distinguer qualitativement. Ici, nous fournissons un protocole pour induire scrunching en utilisant divers stimuli physiques et chimiques. Nous détaillons la caractérisation quantitative du scrunching, qui peut être utilisé pour le distinguer du péristaltisme et du glissement, en utilisant des logiciels librement disponibles. Étant donné que le scrunching est une démarche planaire universelle, bien qu’avec des différences spécifiques aux espèces caractéristiques, ce protocole peut être largement appliqué à toutes les espèces de planaires, lorsqu’il s’agit de prendre des considérations appropriées. Pour le démontrer, nous comparons la réponse des deux espèces planaires les plus populaires utilisées dans la recherche comportementale, Dugesia japonica et Schmidtea mediterranea, au même ensemble de stimuli physiques et chimiques. En outre, la spécificité du scrunching permet à ce protocole d’être utilisé en conjonction avec l’interférence de l’ARN et /ou l’exposition pharmacologique pour disséquer les cibles moléculaires et les circuits neuronaux impliqués, fournissant potentiellement un aperçu mécaniste dans les aspects importants de la nociception et de la communication neuromusculaire.

Introduction

En plus de leur popularité pour les cellules souches et la recherche de régénération^1,2,3, planaires d’eau douce ont longtemps été utilisés dans les études comportementales^4,5, en profitant de leur taille relativement grande (quelques millimètres de longueur), la facilité et le faible coût de l’entretien de laboratoire, et un large spectre de comportements observables. L’introduction de la vision par ordinateur et du suivi automatisé aux études de comportement planaire^6,

Protocole

1. Essais quantitatifs de comportement planaire

1. Configuration expérimentale
   1. Placez un panneau LED dimmable sur une surface plane. Le panneau LED sert à deux fins : (1) fournir un fond blanc uniforme et (2) être utilisé comme source lumineuse réglable pour obtenir un contraste approprié. Placez une arène de 100 mm de plat Petri sur le panneau LED.
      REMARQUE : Pour augmenter le débit, une plaque multi puits peut être utilisée comme arène^23,24,mais les grandes arènes facilitent l’analyse automatisée de l’image.
   2. Montez une caméra sur un anneau au-dessus de l’arène (

Résultats

La perception extraoculaire proche des UV chez les planaires de S. mediterranea dépend de TRPA1 et a été proposée pour être liée à H₂O₂ version¹⁷. Étant donné que l’exposition à H₂O₂ induit des scrunchings dépendants de trpa1 dans S. mediterranea et D. japonica planarians²⁸, les étapes de la section 2.1.4 peuvent être utilisées pour vérifier si l’exposition à la lumière quasi-UV induit des scrunchings ch.......

Discussion

En utilisant ce protocole, on peut étudier quantitativement les effets des stimuli physiques et chimiques^7,28,29 ou manipulation génétique (RNAi)^28,29 sur la locomotion planaire. Pour maximiser la résolution spatiale, il est préférable de déplacer la caméra aussi près que possible de l’arène tout en s’assurant que l’ensemble de l’arène est dans le champ de vision. Pour a.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Isothiocyanate d’allyle, 95 % (AITC)	Sigma-Aldrich	377430-5G	MISE EN GARDE :&NBSP ; Inflammable et toxique aiguë ; manipuler dans une hotte avec l’EPI approprié.
Objectif de l’appareil photo, 2/3 25mm F/1.4  ;	Tamron	23FM25SP
Plaques de culture cellulaire, 6 puits, culture tissulaire traitée	Genesee Scientific  ;	25-105
Tubes à centrifuger, 50 mL polypropylène, stérile	MedSupply Partners	62-1019-2
Cinnamaldéhyde, >95 %	Sigma-Aldrich	W228613-100G-K
Dimmable A4 LED Tracer Light Box	Amazon	B07HD631RP
Flea3 USB3 camera	FLIR	FL3-U3-13E4M
Gants résistants à la chaleur	Fisher Scientific	11-394-298
Plaque chauffante	Fisher Scientific	HP88854200
Instant Ocean Sel de mer, préparé dans de l’eau déminéralisée	Instant Ocean	SS15-10	Préparer dans de l’eau déminéralisée à 0,5 g/L.
Montjü ; sels iques, préparés dans de l’eau Milli-Q	Sigma-Aldrich	divers	Préparer dans de l’eau milli-Q à 1,6 mM NaCl, 1,0 mM CaCl2, 1,0 mM MgSO4, 0,1 mM MgCl2, 0,1 mM KCl, 1,2 mM NaHCO3 ; ajuster le pH à 7,0 avec HCl.
Boîtes de Pétri, 100 mm x 20 mm, polystyrène stérile	Pipette Simport	D210-7
, 20-200 &mu ; Gamme L	Rainin	17008652
PYREX 150 mL bécher	Sigma-Aldrich	CLS1000150
Lame de rasoir, 0,22 mm	VWR	55411-050
Filtre couleur Roscolux :  ; Ambre doré	Rosco	R21	Vous pouvez également acheter le sélecteur de couleurs Roscolux Designer (produit Musson Theatrical #SBLUX0306) qui comprend les 3 filtres de couleur ensemble.
Filtre de couleur Roscolux :  ; Filtre	Rosco	R27
:  ; Storaro Red	Rosco	R2001
Pipette de transfert Samco, 62 & micro ; L grande ouverture	Thermo Fisher	691TS
Support support  ;	Fisher Scientific	12-947-976
Thermomètre	VWR	89095-600
Pointeur laser UV	Amazon	B082DGS86R	Il s’agit d’un laser de classe II (405nm ± ; 10nm) avec puissance de sortie < 5 mW.