Nous décrivons ici une analyse simple de l’hétérogénéité du compartiment des cellules B immunitaires murines dans le péritoine, la rate et les tissus de la moelle osseuse par cytométrie en flux. Le protocole peut être adapté et étendu à d’autres tissus de souris.
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Article de méthode
Caractérisation cytométrique en flux du développement des lymphocytes B murins
* These authors contributed equally
Dans cet article
Résumé
Résumé
Des études approfondies ont caractérisé le développement et la différenciation des cellules B murines dans les organes lymphoïdes secondaires. Les anticorps sécrétés par les lymphocytes B ont été isolés et développés en thérapies bien établies. La validation du développement des cellules B murines, dans le contexte de souris sujettes auto-immunes, ou chez des souris dont le système immunitaire est modifié, est un élément crucial du développement ou du test d’agents thérapeutiques chez la souris et constitue une utilisation appropriée de la cytométrie en flux. Des paramètres cytométriques en flux de cellules B bien établis peuvent être utilisés pour évaluer le développement des cellules B dans le péritoine murin, la moelle osseuse et la rate, mais un certain nombre de meilleures pratiques doivent être respectées. En outre, l’analyse cytométrique en flux des compartiments des cellules B devrait également compléter des lectures supplémentaires du développement des cellules B. Les données générées à l’aide de cette technique peuvent approfondir notre compréhension des modèles murins de type sauvage et sujets à tendance auto-immune ainsi que des souris humanisées qui peuvent être utilisées pour générer des anticorps ou des molécules semblables à des anticorps à titre thérapeutique.
Introduction
Les anticorps monoclonaux sont devenus de plus en plus la thérapie de choix pour de nombreuses maladies humaines à mesure qu’ils font partie de la médecine traditionnelle1,2. Nous avons déjà décrit des souris génétiquement modifiées qui produisent efficacement des anticorps hébergeant des régions variables entièrement humaines avec des constantes IgH de souris3,4. Plus récemment, nous avons décrit des souris génétiquement modifiées qui produisent des molécules semblables à des anticorps qui ont une liaison distincte à l’antigène....
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Protocole
Toutes les études sur la souris ont été supervisées et approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) de Regeneron. L’expérience a été menée sur des tissus de trois souris femelles C57BL / 6J (âgées de 17 semaines) de Jackson Laboratories. Titrer tous les anticorps avant de commencer l’expérience pour déterminer la concentration idéale. Lorsque vous utilisez des perles de compensation pour une compensation unicolore, assurez-vous qu’elles tachent aussi brillantes ou plus brillantes que vos échantillons. Conservez tous les tampons, anticorps et cellules sur la glace ou à 4 °C. Après l’ajout d’un colorant de viabilité, effectuez t....
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Résultats
Nous présentons ici la stratégie de contrôle pour caractériser le développement des cellules B dans le péritoine, le BM et la rate de souris. La base de l’analyse est formée autour du concept de coloration avec un colorant de viabilité, puis de griller des doublets en fonction de la zone de diffusion avant (FSC-A) et de la hauteur de diffusion avant (FSC-H), et enfin de la rétention des débris en sélectionnant les cellules en fonction de leurs caractéristiques FSC-A et SSC-A (Side-Scatter.......
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Discussion
L’analyse cytométrique en flux des tissus lymphoïdes et non lymphoïdes a permis l’identification et le dénombrement simultanés des sous-populations de cellules B chez la souris et l’homme depuis les années 1980. Il a été utilisé comme mesure de l’immunité humorale et peut être appliqué davantage pour évaluer la fonctionnalité des cellules B. Cette méthode tire parti de la disponibilité des réactifs pour évaluer les différentes étapes de la maturation des lymphocytes B chez la souris et l’homme, par le biais d’une analyse.......
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Déclarations de divulgation
Tous les auteurs sont des employés et des actionnaires de Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Remerciements
Nous remercions Matthew Sleeman pour la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également les départements Vivarium Operations et Flow Cytometry Core de Regeneron pour leur soutien à cette recherche.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,5 mL safe-lock Eppendorf tubes | Eppendorf ; | 22363611 | tube de microcentrifugation de 0,5 mL |
| tubes Eppendorf de 1,5 mL | Eppendorf ; | 22364111 | Tube de microcentrifugation de 1,5 mL |
| Tubes Falcon de 15 mL. | Corning ; | 352097 | tube conique de 15 mL |
| aiguille de calibre 18 | BD | 305196 | |
| aiguille de calibre 25 | BD ; | ||
| seringue de 3 mL | BD | 309657 | |
| 70 mM MACS SmartStrainer ; | Miltenyi Biotec ; | 130-110-916 ; | Crépine à cellules de 70 mM |
| Plaque inférieure en U à 96 puits ; | VWR | 10861-564 | |
| Tampon de lyse ACK ; | GIBCO ; | A1049201 | tampon de lyse des globules rouges |
| Acroprep Advance 96 Well Filter Plate | Pall Corporation | 8027 | plaque filtrante |
| B220 | eBiosciences | 17-0452-82 | |
| BD CompBead Anti-Mouse Ig/&kappa ; | BD | 552843 | billes de compensation |
| BD CompBead Anti-Rat Ig/&kappa ; | BD | 552844 | billes de compensation |
| Sérum Bovin Albumine | Sigma-Aldrich ; | A8577 | BSA |
| BP-1 | BD | 740882 | |
| Tampon à taches brillantes | BD | 566349 | tampon à coloration brillante |
| C-Kit BD | 564011 | ||
| CD11b | BD | 563168 | |
| CD11b | BioLegend | 101222 | |
| CD19 | BD | 560143 | |
| CD21/35 | BD | ||
| CD23° ; | BD | 740216 | |
| CD24 (HSA) | BioLegend | 138504 | |
| CD3 | BD | 561388 | |
| CD3 | BioLegend | 100214 | |
| CD43 | BD | 553270 | |
| CD43 | BioLegend | 121206 | |
| CD5 | BD | 563194 | |
| CD93 | BD | 740750 | |
| CD93 | BioLegend | 136504 | |
| DPBS (1x) | ThermoFisher | 14190-144 | DPBS |
| eBioscience Fixable Viability Dye eFluor 506 | ThermoFisher | 65-0866-14 | Spirateur de viabilité |
| Extended Fine Tip Transfer Pipette | Samco | 233 | pipette de transfert jetable |
| FACSymphony A3 flow cytometer | BD | custom order | cytomètre en flux |
| Fc Block, CD16/CD32 (2.4G2) | BD | 553142 | Fc |
| block FlowJo | Flowjo | Logiciel d’analyse de cytomètre | |
| en flux gentleMACS C Tubes ; | Miltenyi Biotec ; | 130-096-334 | Tube de dissociation automatisé |
| gentleMACS Octo Dissociator avec radiateurs ; | Miltenyi Biotec ; | 130-095-937 | Instrument de dissociation tissulaire |
| GR1 (Ly6C/6G) | BioLegend | 108422 | |
| IgD | BioLegend | 405710 | |
| IgM | eBiosciences | 25-5790-82 | |
| Kappa | BD | 550003 | |
| Lambda | BioLegend | 407308 | |
| paraformaldéhyde, 32 % | d’électrons en solution Microscopy Sciences | 15714 | |
| Ter119 | BioLegend | 116220 | |
| Bloqueur de monocytes True Stain | BioLegend | 426103 | bloqueur de monocytes |
| UltraPure EDTA, pH 8.0 | ThermoFisher | 15575038 | EDTA |
| Vi-CELL XR | Beckman Coulter | 731050 | instrument de comptage de cellules ; |
Références
- Shepard, H. M., Philips, G. L., Thanos, D., Feldman, M. Developments in therapy with monoclonal antibodies and related proteins. Clinical Medicine. 17 (3), London. 220(2017).
- Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. The therapeutic monoclonal antibody market. MAbs. 7 (1), 9-1....
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Réimpressions et autorisations
