Un modèle de boucle hémodynamique in vitro pour étudier l’hémocytocompatibilité et l’activation cellulaire hôte des dispositifs médicaux vasculaires

L’essai d’hémocompatibilité des dispositifs médicaux est une étape cruciale dans le développement de nouveaux dispositifs tels que des enchevêtrements vasculaires ou des tubes de perfusion pour l’oxygénation extracorporeal de membrane. Jusqu’à aujourd’hui, les modèles animaux sont considérés comme des outils standard pour finaliser la procédure de test des dispositifs médicaux avant sa mise en œuvre chez l’homme. Désormais, il est nécessaire de trouver d’autres modèles in vitro qui aident davantage à minimiser les enquêtes sur les animaux. Dans cette étude, nous avons donc exploré un modèle miniature en boucle hémodynamique in vitro. L’objectif de cette méthode présentée est de tester la compatibilité sanguine in vitro des dispositifs médicaux conformément à la norme ISO 10993-4.

La norme ISO 10993-4 décrit des ensembles normalisés de paramètres cliniques à étudier sur l’échantillon de sang¹. En bref, il s’agit de thrombose (agrégation et dénombrement des plaquettes), de coagulation (fibrinopeptide A, FPA), d’analyse hématologique (nombre de cellules sanguines entières), d’indice d’hémolyse (hémoglobine plasmatique libre) et du système de complément (complexe terminal de complément, sC5b9). Cependant, d’autres marqueurs, tels que l’élastase polymorphonucléaire de neutrophile (PMN), l’interleukine 6 (IL-6) et le facteur de nécrose de tumeur - alpha (TNF) reflétant le statut d’activation des leucocytes peuvent également être expliqués pour des mesures. Pour déterminer et quantifier les protéines libres de cellules circulant qui sont présentes dans le plasma sanguin, l’analyse immunosorbent liée enzymatique de sandwich (ELISA) représente une méthode conventionnelle et la plus^{fiable 2,3.} De même, le phénotype et l’état d’activation des cellules hôtes (p. ex., les leucocytes) peuvent être quantifiés en détectant l’expression de surface cellulaire des molécules par cytométrie d’écoulement (FACS) qui fournit des readouts basés sur la suspension cellulaire unique, où les anticorps spécifiques étiquetés fluorescents se lient aux molécules ciblées de surface^{cellulaire 4}. La microscopie électronique à balayage (SEM) est également recommandée pour déterminer la formation de thrombus sur le matériau testé par la norme ISO 10993-4¹. Cette méthode peut être complétée par une microtomographie aux rayons X (μCT), pour effectuer une analyse structurelle du thrombus par exemple, son épaisseur, sa taille et sa localisation dans une image rendue 3D⁵.

La raison d’être de l’utilisation de ce modèle hémodynamique in vitro est de dépister les dispositifs médicaux les plus performants et compatibles en comprenant la dynamique physiologique de base des composants sanguins tels que les plaquettes, qui sont impliqués dans l’hémostase primaire ou les leucocytes et leur interaction avec différents types d’appareils vasculaires. Ces systèmes in vitro sont très demandés car ils réduisent le besoin d’études sur les animaux.

Le modèle de boucle présenté ici répond à ces exigences. Ce modèle a d’abord été décrit par A.B. Chandler en 1958 pour la production de thrombi de sang et est, par conséquent, également appelé Chandler Loop modèle⁶. Jusqu’à présent, ce modèle a été utilisé dans une série d’expériences et de modifications pour étudier la biocompatibilité sanguine des dispositifs^{médicaux 7,8,9,10,11,12,13,14}. Il se compose de tubes polymères, qui sont partiellement remplis de sang et formés en boucles refermables. Ces boucles tournent dans un bain d’eau à température contrôlée pour simuler les conditions d’écoulement vasculaire avec ses effets hémorologiques. Des méthodes alternatives telles que les modèles entraînés par pompe ou les modèles qui utilisent des valves mécaniques à billes à l’intérieur des boucles pour induire un flux sanguin à l’intérieur des tubes^{polymères ont déjà été décrits 15,16}. Cependant, l’avantage global de la méthode présentée ici est que la force mécanique appliquée aux cellules sanguines et aux protéines est faible, évitant l’hémolyse, et il n’y a aucun contact entre le sang et les connecteurs, qui pourrait éventuellement mener aux turbulences de flux et à l’activation des composants sanguins. Les principaux facteurs d’activation à l’intérieur de la boucle sont le matériau d’essai lui-même et l’air qui est emprisonné à l’intérieur. Ceci aide à réduire au minimum des sources d’erreur de mesure et à fournir une reproductibilité élevée, même si l’interface sang-air peut mener à la dénaturation de^{protéine 17.} Il est également possible d’étudier des variétés de matériaux tubulaires et de diamètres de stent sans restrictions de longueur ou de taille permettant ainsi l’utilisation de tubes de longueur et de diamètre intérieur différents. De plus, il est également possible d’étudier les hémocompatibilités de l’hôte lors de la fermeture inexacte des boucles et de l’exposition à la surface du tube non encoated. D’autres applications médicales similaires de ce modèle de boucle hémodynamique in vitro est qu’il pourrait également être utilisé pour étudier les interactions entre l’immunothérapie (médicaments) et les composants sanguins pendant le développement préclinique ou le dépistage individuel de l’innocuité des médicaments avant le premier essai clinique de phase I chez l’homme, ou pour la génération de matériaux thrombus qui peuvent être utilisés dans d’autres^{expériences 18,19,20}.

Cette étude décrit un protocole détaillé pour tester les hémocompatibilités des tubes de perfusion et/ou des enchevêtrés. Ici, la comparaison entre les tubes de PVC non encoated et enduits (hepPVC : revêtement d’héparine, polyPVC : revêtement avec un polymère bioactif). L’activation abaissée des plaquettes, mais une activation plus élevée du système de coagulation (FPA) ont été trouvées pour les deux tubes enduits par rapport aux tubes non encoated. Les tubes hepPVC utilisés ici sont modifiés avec de l’héparine covalente liée pour les rendre thromborésistants²¹ et ont déjà été utilisés dans un modèle de boucle pour optimiser et caractériser différents paramètres²². Les tubes en polyPVC utilisés dans cette étude sont des tubes disponibles dans le commerce utilisés dans les milieux cliniques de perfusion sanguine extracorporelle et sont recouverts d’un polymère héparine pour réduire leur thrombogénicité²³. Parfois, dans les applications cliniques, même les tubes de PVC non encoated sont utilisés. Par conséquent, nous avons inclus des tubes de latex comme groupe témoin positif qui a montré l’activation excessive des plaquettes, du système de coagulation, et des facteurs solubles comme IL-6, TNF et elastase de PMN. La formation de Thrombus a été remarquée lorsque la fermeture inexacte de la boucle a été simulée. Ceci a mené à l’activation du système de coagulation et de complément aussi bien que des leucocytes et des plaquettes comparés aux conditions de base. En outre, le contact de sang au matériel de stent ici utilisé (stent nitinol en métal nu, couvert de polytetrafluoroethylène étendu imprégné de carbone) a mené à l’activation plus élevée de plaquette et de leucocyte en termes d’élasstase de PMN. Dans l’ensemble, le modèle présenté n’a induit l’hémolyse dans aucun des dispositifs vasculaires examinés car ils étaient comparables aux conditions de ligne de base ou statiques, excepté les tubes de latex, où l’hémolyse de globule rouge (RBC) était évidente. En outre, ces tubes de perfusion peuvent être examinés soit par imagerie, soit par histologie. Bien que des évaluations histologiques puissent être réalisables, nous nous sommes principalement concentrés sur l’ELISA et la cytométrie de flux pour effectuer ces expériences et ainsi permettre les faisabilités de mener des expériences basées sur le modèle présenté ici pour de nombreux laboratoires. Ainsi, cette méthode représente une méthode réalisable pour tester la biocompatibilité sanguine des dispositifs médicaux vasculaires conformément aux recommandations de la norme ISO 10993-4. En outre, cette méthode peut être utilisée chaque fois qu’une interaction entre le sang et les matériaux doit être testée dans des conditions d’écoulement, imitant les conditions in vivo.

Cette étude a été approuvée par le Comité d’éthique de la faculté de médecine de l’Hôpital universitaire de Magdebourg (numéro de demande 88/18) et les sujets ont fourni un consentement écrit éclairé avant la procédure de prise de sang.

1. Préparation des stocks d’héparine et prélèvement sanguin

1. Calculez la quantité de sang nécessaire pour l’ensemble des expériences.
   REMARQUE : Presque 5 mL de sang héparinisé sont nécessaires pour chaque appareil vasculaire en doublons (boucles). De même, 5 mL de sang sont nécessaires pour chaque condition de base et statique qui est maintenue de côté à température ambiante.
2. Préparer une solution de stock d’héparine à la concentration de 100 UI/mL en diluant l’héparine non fracturée (p. ex., Rotexmedia) dans l’eau déionisée. Utilisez 150 μL de cette solution pour l’héparinisation de 10 mL de sang frais.
3. Calculez la quantité de sang ainsi que le plasma nécessaire pour le dénombrement des cellules sanguines entières, les analyses ELISA et FACS.
   REMARQUE : Les mesures représentées dans cette étude sont obtenues à partir de deux boucles fonctionnant en parallèle (une en double) avec un volume sanguin total de 10 mL.
4. Basé sur la quantité requise de sang, remplissez 10 seringues de mL avec 150 μL de solution de stock d’héparine pour empêcher la coagulation de sang avec une concentration finale d’héparine de 1.5 sang d’UI/mL.
5. Tirez du sang à l’aide d’un papillon (taille : 21 G). Remplissez les seringues très doucement pour éviter l’hémolyse ou l’activation cellulaire due à un vide excessif.
   REMARQUE : L’autorisation du comité d’éthique local doit être obtenue avant le début des expériences. Obtenir le consentement éclairé de chaque donneur de sang humain. Assurez-vous que le donneur de sang est en bonne santé et ne prend aucun médicament, en particulier pas d’agents antiplaquettaires ou d’anti-inflammatoires non stéroïdiens pendant au moins 10 jours avant les expériences. Il convient de noter que le même donneur est préféré lors de la comparaison de différents types de dispositifs vasculaires pour la première fois comme présenté dans ce manuscrit. Pour évaluer davantage les différences inter-individuelles, le protocole peut être répété avec différents donateurs.
6. Recueillir le sang dans un bécher en verre, éviter l’agitation excessive.

2. Assemblage en boucle hémodynamique in vitro

1. Remplissez le bain d’eau jusqu’à ce que le niveau d’eau atteigne le centre de l’unité de rotation. Réglez la température de l’eau à 37 °C.
2. Assemblage en boucle pour tester différents matériaux de tubes (polyPVC, hepPVC, PVC et latex)
   1. Couper deux morceaux de 50 cm de long de chaque matériau tube (diamètre intérieur de 5 mm) à l’aide du coupe-tube. Assurez-vous que la surface de coupe est plate, car cela est particulièrement important pour une fermeture parfaite pour les boucles de petits diamètres de sorte que le sang coule sans aucune distorsion sur le bord d’ajustement.
      REMARQUE : Tout ce protocole utilise les tubes d’un diamètre intérieur de 5 mm.
   2. Pour faciliter la manipulation et éviter les retards de traitement post-échantillon après rotation, ne exécutez que quatre boucles (2 matériaux en double) en parallèle.
   3. Pour générer une forme de boucle, branchez les terminaisons ouvertes des tubes dans un court morceau de tube de silicium qui s’approche du diamètre extérieur du tube d’investigation.
   4. Utilisez les bandes de tension en polycarbonate pour assurer une fermeture correcte des boucles. Lorsqu’il est utilisé pour la première fois, ajuster la longueur des bandes pour s’adapter au diamètre extérieur de la boucle en coupant la bande de tension avec des ciseaux dans les longueurs requises et le fixer avec une clé de couple de 3 mm.
   5. Serrez soigneusement la vis de verrouillage du connecteur à bande de tension lors de l’inspection des terminaisons du tube. Ajustez la force de fermeture de sorte qu’il n’y ait pas d’espace entre les terminaisons du tube. Si la vis de verrouillage est totalement resserrée et que la tension de la bande de polycarbonate semble trop faible pour combler l’écart entre les terminaisons du tube, ouvrez le verrouillage du système et coupez quelques mm de la bande de tension. Répétez cela, jusqu’à ce que la fermeture précise de la boucle soitatteinte ( Figure 1A).
   6. Si le tube est très doux et a tendance à glisser à l’intérieur des bandes de tension, fixez la boucle avec du ruban électrique à la bande de tension (figure 1B,C).
   7. Préparez une boucle supplémentaire de PVC pour le contrôle de la température avec les mêmes dimensions que les boucles d’essai.
   8. Sécurisez les boucles dans le berceau en boucle de l’unité de rotation à l’extérieur du bain d’eau. Par la suite, fixez le berceau de la boucle à l’unité de rotation à l’intérieur du baind’eau ( figure 1E).
   9. Démantèlez la bande de tension en partie à partir des boucles et débranchez une extrémité de chaque tube pour ouvrir la boucle.
   10. Remplissez doucement chaque boucle de 5 mL de sang avec une pipette sérologique de 5 mL. Mélanger le sang doucement deux fois dans le bécher en verre en pipetting lentement de haut en bas avant de charger dans les boucles.
   11. Prenez le thermomètre jetable et placez-le à l’intérieur de la boucle de contrôle de la température. Si le thermomètre est trop grand, coupez-le avec des ciseaux pour s’adapter à de plus petits tubes. Remplissez la boucle de 5 mL d’eau déionisée à température ambiante.
   12. Fermez les boucles et assurez-vous que les boucles, les bandes de tension et le support sont bien ajustés.
   13. Réglez la vitesse de rotation à 30 tours par minute (régime) et tournez pendant 3 h.
3. Assemblage de boucles pour tester l’impact d’une fermeture de boucle incorrecte (écart)
   1. Préparez quatre boucles (polyPVC) telles que décrites dans 2.2.
   2. Fermez deux des boucles correctement avec les bandes de tension et évitez tout écart entre les terminaisons du tube.
   3. Pour les deux autres boucles brancher les terminaisons ouvertes dans le tube plus grand tel que décrit dans 2.2.3, mais laisser un écart de 1-2 mm entre les terminaisons de boucle. N’utilisez pas les bandes de tension pour ces boucles( Figure 1D).
   4. Préparez une boucle de contrôle de la température décrite en 2.2.7 et 2.2.11.
   5. Remplissez toutes les boucles de sang tel que décrit dans 2.2.10.
   6. Réglez la vitesse de rotation à 30 rpm et tournez pendant 3 h.
4. Assemblage en boucle pour les tests en stent
   1. Préparez quatre boucles décrites dans 2.2 et suivantes.
      REMARQUE : Pour évaluer la biocompatibilité sanguine des enfiles, le matériau de tube lui-même doit être testé pour être biocompatible afin d’empêcher le masquage de l’activation cellulaire. S’il n’existe pas de données, le matériau du tube lui-même peut être testé tel que décrit dans 2.2. En outre, la plage de diamètre dans le stent peut être appliquée (voir les instructions du fabricant) et doit s’adapter au diamètre intérieur du matériau du tube.
   2. Ouvrez deux des boucles et sortez le tube du système de bande de tension.
   3. Insérez le stent au milieu du tube selon les instructions du fabricant.
   4. Utilisez les deux autres boucles sans enfiler comme contrôle. Remplissez toutes les boucles de sang tel que décrit dans 2.2.10.
   5. Réglez la vitesse de rotation à 30 rpm et tournez pendant 3 h.
5. Contrôle de la température
   1. À tout moment pendant la durée et lorsque la rotation est arrêtée, la température du sang à l’intérieur des boucles est indiquée par le thermomètre à l’intérieur de la boucle de contrôle de la température. Pour lire la température, arrêtez la rotation et lisez immédiatement la température indiquée par le thermomètre.

3. Traitement d’échantillon de sang

1. Après rotation, laissez les boucles rester dans la grille pendant 2 min en position ascendante pour laisser le sang s’accumuler au bas des boucles, en évitant tout débordement lors de l’ouverture des boucles.
2. Inspecter le sang laissé pour les conditions statiques: Si ce sang est coagulé, une héparinisation incorrecte est finalement soupçonné. Dans ce cas, répéter l’expérience de préférence aussi avec un autre donneur de sang.
3. Sortez soigneusement les boucles de la grille. Ouvrez les connecteurs et laissez couler le sang dans un bécher en verre de 10 mL.
4. Mettre en commun le sang des tubes qui sont exécutés en doublons.
5. Tirez du sang frais pour l’analyse de base du même donneur que décrit dans 1,5 et 1,6.
6. Collecte de sang de citrate de sodium
   1. Pour la collecte du sang de citrate de sodium, remplissez quatre tubes de 1,5 mL, chacun avec une solution de citrate de sodium de 111 μL prélevée dans des tubes de citrate de sodium, pour générer une concentration finale de 3,2 % de citrate de sodium.
   2. Remplissez chaque tube de 1 mL de sang des bechers en verre tel que décrit dans 1,6 et 3,3.
   3. Gardez le sang à température ambiante et utilisez ce sang pour les analyses FACS comme décrit dans 12.
      REMARQUE : Pour modifier la longueur des boucles pour différentes configurations expérimentales, planifiez correctement les aliquots en fonction de la quantité de mesures à faire. Il peut être nécessaire d’établir toutes les mesures requises avec du sang frais avant les expériences réelles pour s’assurer que le volume de sang dans les boucles est suffisant pour toutes les mesures.
7. Collecte d’échantillons de sang et de plasma d’acide éthylèneediaminetetraacetic (EDTA).
   1. De chaque bécher en verre avec du sang (voir 1,6 et 3,3) transférer 4,5 ml de sang dans un tube EDTA de 5 ml. Remplir de sang deux tubes EDTA de chaque bécher en verre de 10 ml.
   2. Mélanger délicatement le sang et le garder sur la glace.
   3. Transférer 2 mL de sang dans un tube de centrifugation de verrouillage de 2 mL et utiliser ce sang pour le nombre de cellules sanguines et la mesure gratuite de l’hémoglobine comme décrit dans 5. Et 6.
   4. Centrifugeuse le reste du sang à 3500 x g pendant 20 min.
   5. Recueillir soigneusement le plasma dans le supernatant en aliquots de 500 μL et congeler immédiatement à -80 °C.

4. Numérisation d’images de microscopie électronique et de μCT

1. Après le traitement de l’échantillon de sang, rincer les boucles vidées préparées comme décrit dans 2,3 avec 10 mL de solution saline tamponnée de phosphate (PBS) chacune.
2. Couper soigneusement un échantillon de 1 cm de long de chaque extrémité de chaque tube à l’aide d’un scalpel.
3. Échantillon d’incubation pendant la nuit à 4 °C dans une solution de glutaraldehyde de 2 %.
   AVERTISSEMENT : L’inhalation des vapeurs d’aldéhyde peut causer des symptômes nasaux tels qu’une congestion persistante de minerai de nez qui coule et une irritation des voies respiratoires, et le contact avec la peau cause la dermatite. Les aldéhydes doivent être manipulés dans une hotte en fumée tout en portant des gants, une robe de protection et des lunettes de sécurité.
4. Rincer l’échantillon (3 fois) avec du PBS.
5. Préparer une solution de 1 % de tétroxide d’osmium (OsO₄₎dans de l’eau déionisée et incuber l’échantillon pendant 15 min à température ambiante.
   ATTENTION: OsO_{4 est} un agent oxydant fort, il peut être réduit par l’exposition à la lumière. Pour éviter la réduction pendant la préparation, conserver l’OSO₄ dans une bouteille en verre brun. OsO_{4 est} extrêmement volatile, ses vapeurs sont toxiques pour les yeux, le nez et la gorge. Travaillez toujours sous une hotte de fumée et utilisez des gants et protégez les vêtements, en veillant à ce qu’aucune partie du corps ne soit exposée à oso₄. Communiquez avec les lignes directrices de votre établissement concernant le traitement de l’élimination et de l’entreposage des déchets. En général, OsO₄ est storable pendant plusieurs mois, mais il a besoin de bouteilles en verre spéciales avec revêtement en téflon et un desiccator, parce que OsO₄ peut décolorer les surfaces internes et le contenu du réfrigérateur en présence de fumées qui fuient.
6. Prélevez des échantillons, transférez-les dans une nouvelle centrifugeuse de 15 mL et rincez les échantillons 3 fois avec PBS.
7. Préparer une série d’éthanol avec des concentrations variables (25 %, 50 %, 75 %, 95 %, 100 %)
8. Déshydrater les échantillons d’éthanol : incuber pendant 20 min chacun en 25 %, 50 %, 75 % et 90 % et 30 min en 100 %.
9. Prélevez des échantillons à partir de 100 % d’éthanol et laissez-le sécher à l’air libre pendant la nuit à température ambiante.
10. Examinez des échantillons dans le microscope électronique à balayage à une tension d’accélération de 5 kV et avec le scanner μCT à rayons X.

5. Nombre de cellules sanguines

1. Prendre 2 mL du sang EDTA obtenu tel que décrit dans 3.7.3
2. Insérez le tube dans l’analyseur d’hématologie automatisé et suivez les instructions du fabricant.

6. Mesure de l’hémoglobine libre (fHb) dans le plasma

1. Décongeler un échantillon de plasma de chaque condition obtenue tel que décrit dans 3.7.5. Conserver sur la glace après le dégel.
   REMARQUE : Décongelez toujours des échantillons de plasma congelés dans un bain d’eau à 37 °C et transférez-les immédiatement sur la glace, contenant un peu d’eau, pour abaisser la température. Ceci est important pour éviter l’activation des composants sanguins pendant le dégel.
2. Utilisez le reagent fHb et suivez les instructions du fabricant. Évitez la contamination après l’ouverture et protégez le réaccente de la lumière directe (soleil, lumière UV).
3. Utilisez un système de pipetage (voir instructions du fabricant) avec dilution 1:5.
4. Ajouter 1000 μL de réagendre d’hémoglobine dans une cuvette semi-micro de 1,6 mL. Utilisez cette cuvette pour déterminer la valeur vierge.
5. Ajouter 1000 μL du réageni d’hémoglobine et 250 μL de l’échantillon plasmatique dans une autre cuvette semi-micro.
6. Mélanger le contenu dans les deux cuvettes en rinçant la pipette à fond en remplissant à plusieurs reprises avec le mélange de réaction, et incuber au moins 3 min à température ambiante.
7. Déterminer l’extinction (E) de l’échantillon contre le reagent fHb en tant que reagent vierge. Calculer la concentration de fHb (mmol/l) de l’échantillon : E₅₄₀-E₆₈₀ x 0,452.

7. Mesure de la FPA

1. Décongeler un échantillon de plasma de chaque condition obtenue comme décrit dans 3.7.5 et stocker sur la glace après le dégel.
2. Utilisez le kit FPA Elisa et suivez les instructions du fabricant.

8. Mesure du sC5b9

1. Décongeler un échantillon de plasma de chaque condition obtenue comme décrit dans 3.7.5 et stocker sur la glace après le dégel.
2. Utilisez le kit ELISA sC5b-9 et suivez les instructions du fabricant.

9. Mesure du PMN

1. Décongeler un échantillon de plasma de chaque condition obtenue comme décrit dans 3.7.5 et stocker sur la glace après le dégel.
2. Utilisez le kit PMN-Elastase ELISA et suivez les instructions du fabricant.

10. Mesure du TNF

1. Les microplaques doivent être enduites un jour avant d’exécuter l’ELISA. Pour le revêtement, ajouter 100 μL de solution d’anticorps de capture à tous les puits, sceller la plaque et incuber toute la nuit à 2 °C-8 °C.
2. Décongeler un échantillon de plasma de chaque condition obtenue tel que décrit dans 3.7.5. Conserver sur la glace après le dégel.
3. Utilisez le kit TNF ELISA et suivez les instructions du fabricant.

11. Mesure de l’IL-6

1. Les microplaques doivent être recouvertes d’anticorps de capture un jour avant l’expérience. Pour le revêtement, ajouter 100 μL de solution anticorps de capture à tous les puits de la microplaque fournis avec l’ensemble, sceller la plaque et incuber toute la nuit à 4 °C
2. Décongeler un échantillon de plasma de chaque condition obtenue comme décrit dans 3.7.5. et conserver sur la glace après le dégel.
3. Utilisez le kit IL-6 ELISA et suivez les instructions du fabricant..

12. Analyses facs

1. Préparer 500 mL de tampon FACS en ajoutant 10 mL de sérum fœtal de veau et 2 mL de solution EDTA (0,5 M) à 488 mL de 1x PBS. Le tampon FACS peut être stocké pendant 4 semaines à 4°C.
2. Utiliser 100 μL du sang de citrate de sodium (voir 3,6,3) pour chaque procédure de coloration (agrégats de plaquettes monocytes (MPA), activation plaquettète (PA), intégines leucocytes (LI)).
3. Pipette 100 μL de sang de chaque échantillon dans un tube FACS de 5 mL. À partir de chaque échantillon, préparer 3 tubes pour la coloration des anticorps et l’étiqueter à l’aide d’un panneau MPA (agrégats de plaquettes monocytes), d’un panneau pa (agrégats plaquettaux) et d’un panneau LI (intégrine de leucocyte).
4. Mélanger le reste des 4 échantillons dans un tube FACS de 5 mL. Utilisez ce mélange pour les contrôles non tachés et fluorescence moins un (FMO).
5. Préparer 6 tubes FACS en pipetant 100 μL du sang échantillonné mélangé dans chaque tube. Étiquetez 3 tubes non tachés et 3 tubes comme FMO-CD41, FMO-CD62P et FMO-CD162.
6. Ajouter 100 μL de solution de paraformaldéhyde à 4 % et incuber pendant 15 min dans l’obscurité à température ambiante.
   ATTENTION : Le paraformaldéhyde est toxique pour la peau et les yeux. Il peut causer une irritation pulmonaire grave lorsqu’il est inhalé et peut entraîner des lésions pulmonaires après une exposition prolongée. En outre, il est classé comme cancérogène et toxine reproductrice. Portez toujours des gants et des lunettes de sécurité et travaillez sous le capot des fumées.
7. Ajouter 1 mL de tampon de lavage à chaque tube et centrifugeuse à 287 x g pendant 5 min. Jetez le surnatant et répétez l’étape de lavage deux fois.
8. Pour la lyse des globules rouges (RBC), ajouter 1 mL de tampon de lyse RBC tampon 1x (diluer le tampon de lyse RBC 10x dans l’eau déionisée), mélanger en pipetant lentement de haut en bas et incuber pendant 5 min à RT dans l’obscurité.
9. Préparer des perles de compensation pour les taches simples. À 1 mL de tampon FACS ajouter 4 gouttes de chaque perle positive et négative. Vortex complet et ajouter 100 μL de solution de perles à un tube FACS de 5 mL.
10. Préparer 4 tubes avec des perles et les étiqueter comme CD14-FITC, CD41-BV421, CD45-APC et CD62P-PE. Ajouter 1 mL de tampon FACS à chaque tube et centrifugeuse à 287 x g pendant 5 min. Jeter le surnatant et garder sur la glace.
11. Après la lyse RBC, ajouter 1 mL de tampon FACS à chaque tube et laver comme décrit dans 12,7. Jeter le surnatant.
12. Préparer des cocktails d’anticorps :
    1. Panneau MPA : Ajouter 4 μL de CD45-APC, 4 μL de CD14-FITC et 4 μL de CD41-BV421 à 388 μL de tampon FACS.
    2. Panneau de sonorisation : Ajouter 1,6 μL de CD41-BV421 et 12 μL de CD62P-PE à 386,4 μL de tampon FACS.
    3. Panneau LI : Ajouter 4 μL de CD45-APC et 8 μL de CD162-BV421 à 388 μL de tampon FACS. Restez sur la glace.
13. Préparer des taches simples : Ajouter 0,5 μL à 499,5 μL de tampon FACS chacun pour le CD14-FITC, le CD41-BV421 et le CD45-APC. Pour cd62P-PE ajouter 0,3 μL à 499,7 μL de tampon FACS. Restez sur la glace.
14. Préparer les commandes FMO : (i) panneau MPA (FMO-CD41) : Ajouter 1 anticorps CD14-FITC de μL et 1 μL d’anticorps CD45-APC à 98 μL facs tampon. (ii) panneau PA (FMO-CD62P) : Ajouter 0,4 μL de CD41-BV421 à 99,6 μL de tampon FACS. (iii) Panneau LI (FMO-CD162) : Ajouter 1 μL de CD45-APC à 99 μL de tampon FACS. Gardez les commandes fmo sur la glace.
15. Vortex cocktails anticorps et ajouter 100 μL de chaque cocktail d’anticorps tel que préparé en 12,12 à chacun des tubes étiquetés respectifs (MPA, PA et LI panneau) tel que décrit dans 12.3 et mélanger doucement par pipetting de haut en bas. Continuez sur RT dans le noir.
16. Vortex dilutions anticorps tache unique et ajouter 100 μL de dilutions anticorps tache unique comme préparé en 12,13. à chacun des tubes étiquetés respectifs avec des perles tel que décrit dans 12.7 et mélanger doucement en pipetting de haut en bas. Continuez sur RT dans le noir.
17. Vortex FMO cocktails anticorps et ajouter 100 μL de chaque cocktail anticorps FMO-1 comme préparé en 12.14. à chacun des tubes étiquetés respectifs (contrôles FMO) tels que décrits dans 12,5. et mélanger délicatement en pipetting de haut en bas. Restez à RT dans le noir.
18. Incuber tous les tubes avec des taches d’anticorps pendant 30 min à RT dans l’obscurité.
19. Prenez les trois tubes pour le contrôle non taché (voir 12.4) et réutilisez la pastille dans 250 μL de tampon FACS. Restez sur la glace.
20. Après le temps d’incubation, lavez tous les tubes à l’exception des commandes non tachées une fois avec le tampon FACS tel que décrit dans 12,7. Resuspendez les granulés dans 250 μL de tampon FACS et acquérez des données sur le cytomètre d’écoulement.
21. Utilisez des cellules non tachées pour les paramètres négatifs et les perles de souris de compensation pour les paramètres positifs dans le logiciel FACS. En outre, utilisez FMO pour contrôler la stratégie de gating, où FMO-CD41 est utilisé dans le panneau MPA, FMO-CD62P est utilisé dans le panneau PA et FMO-CD162 est utilisé dans le panneau LI.
22. Acquérir près de 0,5 x 10⁶ - 0,25 x 10⁶ événements par tube pour FACS. Enregistrer les données et les analyser à l’aide d’un logiciel d’analyse (version 9.9.6).

Toutes les données présentées, à l’exception des parcelles FACS, ont été analysées à l’aide d’un logiciel de statistiques. Les parcelles FACS ont été analysées à l’aide d’un logiciel de cytométrie de flux.

L’analyse du nombre de cellules sanguines entières n’a montré aucune différence significative en ce qui concerne les érythrocytes entre toutes les affections testées (figure 2). Mais, les plaquettes et les leucocytes ont été considérablement réduits dans le groupe de latex, indiquant une biocompatibilité très pauvre du latex. Ceci est également souligné par l’augmentation des niveaux d’hémoglobine libre dans le groupe de latex, ce qui indique le fait que, sauf pour le groupe de latex, aucun des autres dispositifs vasculaires ou conditions n’a conduit à une hémolyse étendue (Figure 2). En outre, les tubes enduits de PVC, le polyPVC et l’hepPVC, aussi bien que le stent examiné n’ont pas mené à la thrombose au moyen de la perte de plaquette et de leucocyte, alors que le latex a exhibé la perte la plus élevée de plaquette et de leucocyte, suivie des tubes non encoated de PVC qui ont montré une tendance diminuée.

Bien que tous les dispositifs vasculaires testés aient mené à l’activation accrue du système de coagulation (FPA) et du composant de complément (sC5b-9), les boucles d’hepPVC ont montré une tendance pour des niveaux diminués de FPA et de sC5b-9 par rapport spécifiquement aux boucles de polyPVC (figure 3). Fait intéressant, les boucles de PVC et gap non encoated ont montré des niveaux inférieurs de FPA comparés au polyPVC, bien qu’n’atteignant pas le niveau de signification statistique. Néanmoins, les boucles de latex ont montré des niveaux sensiblement accrus de FPA par rapport aux conditions de ligne de base et statiques.

Conformément au nombre de cellules sanguines entières, les boucles de latex présentaient les niveaux les plus élevés deTNF, IL-6 et PMN elastase (figure 4), atteignant le niveau de signification statistique par rapport au reste des groupes en termes de TNF et IL-6 (Figure 4A,B), tandis que pour les conditions statiques et de base en termes d’élasstase PMN (Figure 4C). Ces résultats indiquent l’activation puissante des leucocytes par latex. Les niveaux de base des marqueurs d’activation étaient toujours comparables aux conditions statiques, indiquant une héparinisation appropriée du sang.

Fait intéressant, il a été démontré que le nombre de plaquettes et de leucocytes pour les boucles induites par l’écart n’a été que légèrement réduit avec l’activation modérée du système coagulatoire (FPA) et des leucocytes (élasstase PMN), bien qu’une fermeture incorrecte de la boucle avec des turbulences d’écoulement résultantes et un contact sanguin avec la surface de coupe rugueuse non cintrée ont conduit à des caillots macroscopiquement visibles à l’épissage(figure 1F). Les caillots et sa distribution sur toute la surface de l’épissage étaient évidents avec des images μCT et SEM, tandis qu’aucun caillot n’a été trouvé lorsque les boucles ont été fermées avec le dispositif de fermeture externe ne laissant aucun écart entre les terminaisons de boucle (figure 5).

L’analyse cytométrique de flux des cellules sanguines hôtes qui ont été tachées avec des marqueurs spécifiques plaquettes, CD41 et marqueur d’activation plaquettaires CD62P, sont indiquées dans la figure 6A,B. Ici, les tubes de latex ont exhibé l’intensité médiane excessivement élevée de fluorescence (IMF) pour CD62P sur des plaquettes de sang, suivies de stent, tandis que les tubes en polyPVC enduits d’héparine ont exhibé l’activation minimale des plaquettes dépeignant la propriété anti-thrombogenic des tubes de polyPVC. En outre, les leucocytes ont été classifiés sur la base de la granularité à base de CD45 et de SSC (dispersion latérale) en (i) granulocytes; (ii) les monocytes et (iii) les lymphocytes (figure 7), et l’expression de CD162+ intégrine a été détectée sur chaque sous-population de leucocytes qui sont connus pour interagir avec le CD62P sur les plaquettes24. On l’a remarqué que les expressions d’intégrine ont été considérablement réduites sur des granulocytes et des lymphocytes dans des boucles de latex. Ce résultat était conforme aux niveaux réduits de fréquences totales des leucocytes dans les boucles de latex (figure 2). En général, les niveaux d’intégrine étaient plus élevés parmi les monocytes par rapport aux granulocytes et aux lymphocytes, indiquant la probabilité pour l’interaction de monocyte avec les plaquettes activées. À cet égard, les agrégats de plaquettes monocytes ont également été évalués en soudant les cellules sanguines avec cd14 (comme marqueur monocyte) et CD41 (comme marqueur plaquettaires) et, en fin de compte, pour identifier les cellules doubles positives, c’est-à-dire CD14+CD41+MPA (Figure 8). Ici, nous avons remarqué que le groupe de stent a exhibé les niveaux les plus élevés d’expression de CD41 sur le MPA, suivi par le groupe de latex, indiquant une tendance accrue à former MPA, en dépit de la fréquence réduite du monocyte (<1 %) dans les boucles de latex.

Figure 1 : Aperçu du modèle de boucle hémodynamique in vitro et de ses modifications. ( A )Bouclepour l’expérience d’écart avec le système externe de fermeture de boucle, ne laissant aucune lacune à l’épissage. (B) Boucle faite de tube en PVC enduit de polyPVC et en stent à l’intérieur (flèche). (C) Boucle en tube de latex. (D) Boucle pour l’expérience d’écart sans le système de fermeture de boucle externe laissant un espace entre les terminaisons de tube (flèche). (E) Boucles placées dans le berceau de boucle à l’intérieur du bain d’eau et remplies de sang. (F) Thrombus résultant en un écart à l’épissage (flèche) après rotation. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Résultats pour le nombre de cellules sanguines et l’hémoglobine plasmatique. (A) Les érythrocytes comptent. (B) Les plaquettes comptent. (F) Les leucocytes comptent. (D) Hémoglobine plasmatique gratuite. Les résultats indiquent la biocompatibilité pauvre du latex, menant à l’hémolyse excessive. Les données sont présentées comme valeur moyenne; les barres d’erreur indiquent SEM. n=1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Résultats pour l’activation du système de coagulation et de complément. (A) Activation du système de coagulation, mesurée par les niveaux de Fibrinopeptide A (FPA) (B) Activation du système de complément, mesurée par des niveaux de sC5b-9. Tandis que les tubes de latex ont évoqué des niveaux élevés significatifs de la FPA, l’activation de complément était forte pour tous les matériaux examinés. Les données sont présentées comme valeur moyenne, les barres d’erreur indiquent SEM. *p<0.05, n=1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Marqueurs d’activation des leucocytes. (A) Facteur alpha de nécrose tumorale (TNF). (B) Interleukin 6 (IL-6) (C) PMN Elastase. Les résultats indiquent une activation accrue des leucocytes en raison des niveaux élevés des marqueurs analysés, suivis des boucles en stent, qui ont seulement mené aux niveaux accrus pour PMN Elastase mais pas TNF ou IL-6. Les données sont présentées comme valeur moyenne, les barres d’erreur indiquent SEM. *p<0.5; **p<0.01, n=1. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5 : Imagerie de l’épissage des boucles. (A) μ-ordinateur (μCT) de boucles avec fermeture incorrecte (écart). Les zones rouges indiquent le matériau thrombus. (B) Rendu du côté luminal du tube. La sélection rectangulaire indique la zone de numérisation de la microscopie électronique (SEM) (C). (D) μCT de boucles avec dispositif de fermeture de boucle externe et pas d’espace à l’épissage, et (E) rendu et vue de la surface luminale. Aucun matériau thrombus n’a été trouvé. (F) IMAGE SEM de la sélection rectangulaire dans (E). Aucun matériau thrombus n’a été trouvé sur la surface de coupe. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Parcelle FACS pour l’activation des plaquettes (CD62P). (A) Parcelle représentative FACS (état de base) montrant le sang CD41+ plaquettes. (B) Graphique montrant l’état d’activation des plaquettes reflété par l’intensité moyenne de fluorescence (IMF) des différents types d’appareils vasculaires par rapport à la RT statique et les conditions de base. Les barres de données présentent les données à partir de mesures individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 7 : Parcelle facs pour l’intégrine leucocyte (CD162). (A) Parcelle représentative facs (condition de base) montrant le sang CD45+ leucocytes et sous-groupes (B) Graphique montrant le leucocyte CD162+ intensité moyenne de fluorescence intégrine (IMF) des différents types de dispositifs vasculaires par rapport aux conditions statiques et de base. Les barres de données présentent les données à partir de mesures individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 8 : Parcelle FACS pour les agrégats de monocytes plaquettes (CD41/CD14). (A) Parcelle représentative facs (condition de base) montrant le glas des monocytes sanguins (CD45+/CD14+), plaquettes (CD41+) et agrégats plaquettes monocytes (CD41+/CD14+) ( B )Graphiquemontrant l’intensité de fluorescence CD41+ moyenne (IMF) sur les agrégats de plaquettes monocytes pour les différents dispositifs vasculaires par rapport aux conditions statiques et de base. Les barres de données présentent les données à partir de mesures individuelles. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Le bailleurs de fonds [ebo kunze industriedesign, Im Dentel 17, 72639 Neuffen, Allemagne] a fourni un soutien financier sous forme de consommables et de frais de publication à l’auteur de ce manuscrit [Max Wacker]. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle supplémentaire dans la conception, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.