Préparation et microinjection d’embryons de drosophile pour la microscopie cellulaire vivante effectuée à l’aide d’un analyseur automatisé à contenu élevé

Résumé

Présenté ici est un protocole de microinject et simultanément l’image de plusieurs embryons de Drosophila au cours du développement embryonnaire à l’aide d’une plaque à base, imageur à haute teneur.

Résumé

Les approches modernes en imagerie quantitative des cellules vivantes sont devenues un outil essentiel pour explorer la biologie cellulaire, en permettant l’utilisation de statistiques et de modélisation computationnelle pour classer et comparer les processus biologiques. Bien que les systèmes modèles de culture cellulaire soient excellents pour l’imagerie à haute teneur, des études à haut débit de morphologie cellulaire suggèrent que les cultures ex vivo sont limitées dans la récapitulation de la complexité morphologique que l’on trouve dans les cellules des organismes vivants. En tant que tel, il est nécessaire d’avoir un système évolutif modèle à haut débit pour l’image des cellules vivantes dans un organisme intact. Décrit ici est un protocole pour l’utilisation d’un analyseur d’image à contenu élevé pour acquérir simultanément plusieurs vidéos time-lapse de développement embryonnaire Drosophila melanogaster au cours de l’étape syncytiale blastoderm. Le blastoderm syncytial a traditionnellement servi de grand modèle in vivo pour l’imagerie des événements biologiques; cependant, l’obtention d’un nombre significatif de répliques expérimentales pour les approches quantitatives et à haut débit a été laborinelle et limitée par l’imagerie d’un seul embryon par répétition expérimentale. Présenté ici est une méthode pour adapter l’imagerie et les approches de microinjection pour convenir à un système d’imagerie à haute teneur, ou tout microscope inversé capable d’acquisition automatisée multipoint. Cette approche permet l’acquisition simultanée de 6 à 12 embryons, selon les facteurs d’acquisition souhaités, en une seule séance d’imagerie.

Introduction

Au cours des 30 dernières années, les progrès des technologies d’imagerie et des sondes moléculaires pour l’imagerie cellulaire vivante ont fait progresser notre compréhension de la complexité et du fonctionnement interne de la cellule. Cette avancée technologique s’accompagne d’une plus grande dépendance à l’égard de l’utilisation de modèles de culture cellulaire ex vivo pour l’acquisition de données d’imagerie à haut débit. Les modèles de culture cellulaire offrent plusieurs avantages, y compris le contrôle du microenvironnement par des systèmes microfluidiques, et la capacité d’image de plusieurs cellules simultanément, permettant l’utilisation d’approches quantitatives nécessaires pour le criblage à haut^{débit 1,2}. Cependant, il y a également des inconvénients significatifs associés aux modèles de culture cellulaire dans le contexte des études morphologiques, telles que le verre bidimensionnel ou les surfaces en plastique produisant des effets confusionnels sur la morphologie cellulaire et sa^{régulation 3,4,5}. Ces effets peuvent fournir des données fausses ou trompeuses en ce qui concerne l’étude des processus biologiques régissant la morphologie cellulaire.

Bien que l’alternative ait été d’étudier la morphologie cellulaire dans le contexte d’un organisme intact⁶, peu d’organismes intacts appropriés facilitent l’imagerie quantitative de cellules vivantes à haut débit en raison des difficultés à maintenir des organismes entiers vivants par l’imagerie, et des défis liés à l’imagerie à l’intérieur d’un grand organisme multicellulaire. Par conséquent, les études biologiques cellulaires chez les organismes intacts se sont généralement concentrées sur l’observation d’un seul organisme au fil du temps, ce qui limite considérablement la taille de l’échantillon. De plus, cette limitation d’un animal à la fois rend l’imagerie en direct difficile et coûteuse à utiliser sous la forme d’un écran et limite la capacité d’appliquer des outils d’analyse quantitative puisque le nombre d’échantillons est généralement trop faible. Ainsi, se pose la nécessité d’un organisme modèle multicellulaire qui peut être utilisé pour les approches quantitatives basées sur le contenu élevé.

Ce protocole adapte l’embryon de Drosophile à l’imagerie à haute teneur à base de plaques pour générer des tailles expérimentales d’échantillons suffisamment grandes pour une analyse quantitative. Drosophila melanogaster est communément connu comme le premier organisme modèle. La recherche utilisant Drosophila a mené à des percées dans la biologie cellulaire et moléculaire, y compris la transmission de l’information génétique, l’identification des voies de signalisation cellulaire, et les exigences génétiques du développement embryonnaire^7,8,9. En outre, l’embryon de Drosophila a été utilisé pour explorer la dynamique in vivo microtubule au cours de la division^{cellulaire 10,11,12}. L’utilisation de la microinjection pour livrer de petites molécules et des sondes moléculaires fournit le contrôle temporel qui rend le développement embryonnaire de Drosophila particulièrement puissant pour sonder des processus cellulaires in vivo^13,14. Cependant, générer un nombre important de répétitions expérimentales avec une approche d’imagerie traditionnelle est extrêmement laborieux et a une utilisation limitée dans les écrans d’imagerie à haut débit et l’analyse quantitative. Notre approche utilise un analyseur à contenu élevé généralement réservé à l’analyse cellulaire unique et adapte l’analyse d’imagerie in vivo dans le syncytium du début de Drosophila embryo.

Ce protocole a été employé pour recueillir, étape, et embryons de Drosophila de microinject pour explorer les mécanismes qui conduisent des changements morphologiques dans le reticulum endoplasmique (ER) pendant la mitose^15. Bien que de nombreuses études aient décrit la nature dynamique de l’ER au cours du cycle^{cellulaire 16,17,18,19}, il a été difficile de comparer les effets de perturbations multiples à travers le temps sur la morphologie des ER. Pour identifier les composants qui conduisent des changements dans la morphologie d’urgence à travers la division cellulaire, les méthodes énumérées dans ce protocole ont été employées pour sonder le rôle des microtubules et d’autres facteurs cytosquelettiques sur la réorganisation mitotic d’urgence utilisant la division syncytiale corticale dans l’embryon tôt de Drosophila. Dans l’ensemble, la disponibilité de perturbations génétiques au sein de la communauté de Drosophila, la capacité de microinjecter des médicaments et des sondes moléculaires à des moments précis pendant le développement, et le coût peu coûteux de travailler avec Drosophila rend cette approche très agréable au criblage basé sur l’image à haut débit. Les méthodes décrites ici sont applicables pour l’étude d’une grande variété de processus cellulaires et développementaux in vivo utilisant l’embryon de Drosophila ²⁰. Plus précisément, ce protocole est bien adapté pour étudier les événements biologiques qui se produisent sur une longue période et dans les 100 microns du cortex embryonnaire de Drosophila.

Protocole

REMARQUE : Consultez le tableau 1 pour trouver des recettes de médias et de solutions.

1. Mise en place et entretien d’une cage de collecte d’embryons pour analyse en^{direct 21}

1. Peupler une cage de collecte d’embryons frais avec des mouches fraîches.
   REMARQUE : Bien que des cages de collecte disponibles dans le commerce soient recommandées, les cages de collecte peuvent être facilement construites à partir de bouteilles à^{mouches vides 21}.
   1. Jeter ou transférer les mouches adultes des bouteilles lorsque de nombreuses nymphes commencent à s’assombrir au stade p14; à 20 °C, cela se produit environ 14 jours après que les œufs ont été pondus²².
   2. Laisser les pupes éclore et peupler les bouteilles de 12 à 24 h.
   3. Transférer les mouches fraîches dans une petite cage de collecte à l’aide d’un petit entonnoir au-dessus de l’ouverture de la cage de collecte pour empêcher les mouches de s’échapper. Combinez jusqu’à 3 bouteilles pour produire une cage densément peuplée contenant de 200 à 500 mouches.
   4. Transférer les mouches dans la cage de collecte en tapant une bouteille de mouche contre une surface dure à plusieurs reprises (pour étourdir les mouches). Puis ouvrez et inversez la bouteille de mouche au-dessus de l’entonnoir de cage de collecte. Appuyez sur la bouteille ouverte sur la cage de collecte à quelques reprises pour déposer les mouches dans la cage de collecte.
   5. Fermez la bouteille à mouche ouverte en la mettant rapidement sur sa fiche. Tout en transférant la bouteille à mouche ouverte de l’entonnoir à sa fiche, assurez-vous que les points d’ouverture de la bouteille vers le bas à mesure que les mouches ont tendance à ramper loin de la source du taraudage.
   6. Appuyez sur l’entonnoir contre l’ouverture de la cage à mouches et appuyez sur la cage à plusieurs reprises sur une surface dure pour étourdir les mouches à l’intérieur. Retirez immédiatement l’entonnoir et fixez une assiette de raisin frais à l’ouverture de la cage à mouches. Utilisez du ruban adhésif pour fixer l’assiette de raisin. Répétez ce processus pour combiner jusqu’à 3 bouteilles pour produire une cage de collecte densément peuplée.
      REMARQUE : Alternativement, les mouches peuvent être anesthésiantes à l’aide de CO_{2 ou d’autres} agents dormants à mouches; toutefois, cela augmentera la période d’acclimation dans l’étape 1.2.
2. Acclimatez la nouvelle cage de collecte pour 24-48 h. Si du CO₂ ou tout autre agent dormant a été utilisé, acclimatez la cage de collecte pendant au moins 48 h.
   1. Remplacer l’assiette de raisin dans la cage de collecte par une assiette fraîche contenant de la pâte de levure deux fois par jour, de 8 à 10 h l’une de l’autre.
3. Installez une cage de collecte fraîche tous les 5 jours.

2. Collecte et préparation d’embryons pour l’imagerie

1. Obtention d’embryons avec développement synchronisé
   1. Échangez l’assiette de raisin sur la cage de collecte avec une fraîche contenant une touche de pâte de levure au centre. Laisser les mouches ponder des embryons pendant 1 h. Jes l’ancienne assiette de raisin.
      REMARQUE : Les mouches peuvent féconder les embryons avant de les pondre. La première plaque de collecte contiendra bon nombre de ces embryons prédéveloppementés. Permettre aux mouches de jeter d’abord de vieux embryons améliorera la synchronisation développementale entre les embryons.
   2. Échanger l’assiette de raisin contre une assiette fraîche contenant une touche de pâte de levure au centre et laisser les mouches pondre des embryons pendant 10 min. Jes l’ancienne assiette de raisin.
      REMARQUE : Pour éviter de ralentir le développement embryonnaire dans les assiettes froides, réchauffer l’assiette de raisin et la pâte de levure à température ambiante avant de l’utiliser.
   3. Échanger l’assiette de raisin avec une assiette fraîche (sans pâte de levure) et sauver l’ancienne plaque de raisin, il a les embryons pour l’imagerie. Si nécessaire, continuer à recueillir des embryons de cette cage en répétant les étapes 2.1.2 et 2.1.3.
2. Âge recueillir des embryons pendant 30-45 min à l’image des divisions syncytiales²³.
   REMARQUE : Pour imager le stade syncytial de blastoderm dans le développement embryonnaire, les embryons doivent être montés et sur le microscope dans les 90 minutes de la collecte. Lors de la tentative de ce protocole pour la première fois, embryons âge 10-20 min dans l’étape 2.2 pour fournir du temps supplémentaire pour mettre en place entre les étapes.
3. Dechorionate embryons avec 50% d’eau de Javel dans l’eau DI.
   1. Transférer les embryons âgés de l’étape 2.2 dans un tamis de 140 nm en remplissant l’assiette de raisin avec de l’eau DI, en délogeant doucement les embryons avec un pinceau, et en versant l’eau avec des embryons dans le tamis de 140 nm (figure 1A).
      REMARQUE : Cela peut se faire au-dessus d’un évier ou d’un bécher de 1 000 mL.
   2. Rincer vigoureusement les embryons à l’aide d’une eau DI à l’aide d’une bouteille de gicler. Sécher les embryons en buvant le tamis sur une serviette en papier sec. Éponger le tamis jusqu’à ce qu’il cesse de laisser des marques d’eau sur la serviette en papier( Figure 1B).
      REMARQUE : Retirez toute pâte de levure des embryons car elle peut rendre le traitement à l’eau de Javel inefficace à l’étape suivante.
   3. Remplir une assiette vide de 10 cm d’eau de Javel fraîchement préparée à 50 % diluée avec de l’eau DI (1:1 eau de Javel : eau DI). Tremper le tamis dans 50% d’eau de Javel pendant 2 min 45 s. Démarrez un chronomètre dès que le tamis touche l’eau de Javel à 50 %. Éponger le tamis dans et hors de l’eau de Javel 50% 3-4x dans les 15 premiers s pour briser les touffes d’embryons (Figure 1C).
   4. Rincer vigoureusement les embryons à l’aide d’eau DI à l’aide d’une bouteille de gicler. Séchez les embryons en buvant le tamis sur une serviette en papier sec. Répétez le rinçage vigoureux et le processus de séchage des taches pendant 5x( Figure 1D).
      REMARQUE : Il s’agit de l’étape la plus importante pour enlever les restes de chorion. Utilisez une bouteille complète de gicler DI et utilisez la moitié de la bouteille dans cette étape.
   5. Transférer les embryons séchés de tache du tamis dans une assiette de raisin de 10 cm à l’aide d’un pinceau²¹ (Figure 1E)
      REMARQUE : La dichlorination manuelle peut être employée comme alternative à la décorination d’eau de^{Javel 24.}

Figure 1 : Déchorionation embryonnaire. (A) Des embryons ont été recueillis à l’aide d’une bouteille de gicler DI H20, d’un pinceau et d’un tamis de 140 nm. (B) Les embryons ont été rincés vigoureusement à l’aide d’une bouteille de gicler DI H20 et de sécher sur une serviette en papier. ( C )Ladéchorionation des embryons a été effectuée dans 50% d’eau de Javel pendant 2 min et 45 s. (D) Les embryons ont été rincés vigoureusement à l’aide d’une bouteille de gicler DI H20 et éponger à sec sur une serviette en papier. Ceci a été répété 4 fois pour enlever l’excès de chorion. ( E )Lesembryons ont ensuite été transférés dans une plaque de raisin de 10 cm à l’aide d’un pinceau. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

3. Montage d’embryons à coverslips

1. Sous un stéréomicroscope équipé d’un éclairage aérien au cou d’oie, organisez deux rangées de 15 à 20 embryons sur une section propre de plaque de raisin à l’aide d’un outil de cueilleur d’œufs. Aligner les embryons sur leur côté ventral dans la même orientation par rapport aux extrémités antérieures et postérieures. Pour faire plier les cueilleurs d’œufs à pointe fine, les pinces en acier inoxydable à angle de 45°. Pour examiner l’orientation des embryons D/V, voir Campos-Ortega et coll.²⁰.
   REMARQUE : Il est important que la surface ventrale s’assoit sur l’assiette du raisin, car les embryons seront pressés sur un glissement de couvercle à l’étape 3.5, exposant la surface dorsale pour l’imagerie. Comme la surface dorsale est beaucoup plus plate que la surface ventrale, l’imagerie de la surface latérale dorsale augmente le nombre de noyaux présents dans un seul plan Z.
2. Préparer 75 mm x 25 mm de couverture d’espaceur en silicone.
   REMARQUE : Cela peut être préparé à l’avance. Préparez plusieurs coverslips et rangez-les dans une boîte à diapositives pour les garder propres.
   1. Tracez le contour d’un coverslip de 75 mm x 25 mm sur une feuille d’espaceur en silicone de 1,6 mm d’épaisseur et découpez l’espaceur en silicone à l’aide de ciseaux (figure 2A).
   2. À l’aide d’une lame de rasoir, découpez un encart de 40 mm x 15 mm de l’espaceur (figure 2A).
   3. Adhérez l’espaceur sur le coverslip et strie 10 μL de colle d’heptane vers le bas de l’encart en verre coverslip exposé (Figure 2A).
      REMARQUE : La mise bas et même la strie assureront l’imagerie des embryons sur le même plan z.
3. Tandis que la colle d’heptane de l’étape 3.2.3 sèche, découpez une section rectangulaire de plaque de raisin contenant les embryons de l’étape 3.1.
   1. Utilisez une lame de rasoir pour couper un rectangle (plus petit que 40 mm x 15 mm) autour des deux rangées d’embryons. Ne retirez pas encore le rectangle.
   2. Découpez un deuxième rectangle à côté du premier. Retirer le deuxième rectangle à l’aide du côté droit d’une spatule en acier inoxydable.
   3. Faites glisser délicatement le bord droit d’une spatule en acier inoxydable sous le premier rectangle et retirez-le (Figure 2B).
4. Placer la découpe de l’assiette de raisin avec des embryons sur le côté externe d’un plat de 3,5 cm (figure 2C).
5. Sous un stéréomicroscope, abaissez un coverslip préparé sur les embryons et appuyez doucement sur les deux rangées d’embryons sur la colle (Figure 2D).
6. Si vous microinjectez des embryons, passez à l’étape 4.1. Si ce n’est pas microinjecting continuer à l’étape 3.7.
7. Couvrir les embryons en remplissant l’espaceur en silicone (à mi-chemin vers le haut) avec 1:1 - huile d’halocarbone 700: huile d’halocarbone 27.
8. Tapisser les bords inférieurs d’un adaptateur de plaque à 4 diapositives d’un ruban adhésif à double face pour empêcher le glissement du couvercle de bouger, mais assurez-vous de ne pas placer le ruban sur le chemin de l’objectif. Cette cassette est critique. Si le coverslip n’est assis que sur l’adaptateur, il se déplacera tout au long de l’acquisition. Montez le bordereau de couverture sur l’adaptateur de plaque de 4 glissières.

Figure 2 : Préparation et montage de coverslip. (A) Un contour de 75 mm x 25 mm coverslip a été tracé sur une feuille de silicone de 1,6 mm d’épaisseur. Utilisez des ciseaux pour découper le contour. 40 mm x 15 mm d’encart ont été découpés dans l’espaceur en silicone, puis montés sur le coverslip. Strié 15 μL au centre de l’encart. (B) Deux rangées de 15-20 embryons ont été organisées sur une plaque de raisin dans une zone inférieure à 40 mm x 15 mm, puis cette zone a été découpée à l’aide d’un rasoir et d’une spatule en acier inoxydable. (C) Assiette de raisin découpée ont été placés sur le dessus d’un plat vide de 3,5 cm. (D) Sous un stéréomicroscope, le coverslip de (A) a été abaissé et les embryons ont été collés sur la strie de colle. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

4. Desiccating et microinjection d’embryons

1. Placez le coverslip avec des embryons sur une diapositive pour empêcher le fond de la couverture de se salir pendant la dessiccation et la microinjection.
   REMARQUE : Le bordereau de couverture sera photographié sans une diapositive attachée à elle. Par conséquent, un microscope inversé est nécessaire pour l’imagerie.
2. Desiccate embryons pendant 5-10 min, selon la température de la pièce. Les embryons utilisés pour l’imagerie dans les résultats représentatifs ont été dessiccated pendant 7 min à 20 °C dans une chambre contenant une couche 1:1 de perles de gel de silice sur un agent de séchage (Figure 3A).
3. Immédiatement après la dessication, couvrir les embryons de 1:1 - huile d’halocarbone 700: huile d’halocarbone 27. Remplissez l’espaceur en silicone à mi-chemin vers le haut.
   REMARQUE : Il est important de mélanger une huile d’halocarbure à haute viscosité avec une huile d’halocarbure à faible viscosité. L’huile d’halocarbone pure 700 (viscosité élevée) ralentit la progression des cycles cellulaires 30 min après application. Un mélange 1:1 d’huile d’halocarbone 700 et d’huile d’halocarbone 27 a fixé cet artefact.
4. Chargez les aiguilles de microinjection avec l’injecteur, puis montez-en une sur le microinjecteur et coupez-les sous pression.
   REMARQUE : Pratiquez l’étape 4.4 à quelques reprises avant d’effectuer l’analyse complète avec les réhésifs précieux. Il s’agit de l’étape la plus difficile du processus de microinjection.
   1. Chargez les aiguilles de microinjection avec 2 μL d’injecteur à l’aide d’une pointe de chargement prolongée. Une seule aiguille de microinjection est nécessaire, mais il est bon d’avoir des aiguilles chargées de rechange à proximité afin de préparer 2 ou 3 aiguilles.
      REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux pour obtenir des spécifications sur les conseils de chargement prolongés. Les aiguilles de microinjection ne peuvent pas être chargées sans des pointes de chargement prolongées en raison de la nature unique de notre technique de microinjection, qui repose sur le renforcement de la pression d’air à l’intérieur d’une aiguille scellée et chargée avant d’ouvrir sa pointe.
   2. Monter une aiguille sur le microinjecteur et déprimer le piston à mi-hauteur de la pointe. L’objectif est d’augmenter la pression d’air à l’intérieur du capillaire en verre( Figure 4A).
      REMARQUE : Utilisez un microinjecteur à base d’huile minérale de piston sans huile minérale. Au lieu de construire la pression avec l’huile minérale, utilisez le piston pour construire la pression d’air.
   3. Abaissez l’aiguille en verre sur une glissière en verre et coupez le bout de l’aiguille à l’aide d’un nouveau #9 de rasoir. Couper l’aiguille à un angle de 45° pour produire une pointe ouverte nette. L’injecteur doit descendre au fond de la pointe sans sortir de l’aiguille. Ajouter délicatement 20 μL d’huile d’halocarbone sur le bout de l’aiguille et la couper à nouveau à 45°. L’injecteur doit commencer à circuler rapidement.
   4. Abaissez immédiatement la pression de l’air en rétractant le piston, mais assurez-vous de maintenir un débit continu pour empêcher l’aiguille de s’obstruer avec la membrane embryonnaire entre les injections. (Figure 4B).
      REMARQUE : Si l’injecteur est clair, consultez le débit de l’injecteur en soulevant l’aiguille de microinjection dans et hors de l’huile d’halocarbure et en observant le taux de formation des gouttelettes injectables sous un stéréomicroscope. Réglez la pression de l’air en déprimant le piston quelques clics à la fois, puis trempez la pointe de microinjection dans et hors de l’huile d’halocarbone pour afficher le taux de formation de nouvelles gouttelettes après ajustement.
   5. Utilisez le micromanipulateur pour positionner l’aiguille au centre du champ de vision, puis soulevez l’aiguille à l’aide du micromanipulateur et retirez la glissière de verre de dessous. L’aiguille est maintenant calibrée pour injection.

Figure 3 : Diagramme de chambre de desiccation. (A) Il s’agit d’un diagramme d’une chambre de dessiccation. La chambre se compose d’une couche 1:1 de perles de gel de silice sur une couche de séchrierite. Pour effectuer la dessiccation, des embryons ont été placés sur le dessus d’un couvercle de plaque de puits simple. La chambre de desiccation a été fermée 7 min. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

5. Embryons microinjects
   1. Placez les embryons sur le stade stéréomicroscope sous l’aiguille de microinjection, mais ne baissez pas l’aiguille.
   2. Concentrez-vous sur les embryons au grossissement 50x.
   3. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle entre dans le même plan de mise au point que les embryons. Déplacer la diapositive d’une main et faire fonctionner le microinjecteur de l’autre, injecter une rangée d’embryons.
   4. Soulevez l’aiguille et faites pivoter la glissière à 180° pour exposer la deuxième rangée d’embryons à l’aiguille de microinjection. Abaissez l’aiguille et injectez la deuxième rangée d’embryons.
      REMARQUE: Essayez de le faire en moins de 10 min. Laissez certains embryons non injectés être utilisés comme témoins.

Figure 4 : Préparation de l’aiguille de microinjection. (A) Dans cetteillustration, l’intensité du magenta dans l’aiguille est représentative de la pression atmosphérique. Une aiguille chargée a été montée sur le microinjecteur et le piston a été prolongé de 50 % pour augmenter la pression d’air à l’intérieur de l’aiguille. Assurez-vous que le piston est rentré au maximum avant le montage. (B) La pointe de l’aiguille a été coupée sous pression et le piston a été rétracté pour diminuer la pression d’air et la vitesse d’écoulement. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

5. Imagerie sur un analyseur à contenu élevé

1. Avant d’exécuter ce test créer une carte de plaque pour un adaptateur de diapositives. Utilisez l’éditeur de porte-plaques trouvé dans le menu Plate Map Manager pour entrer dans la dimension d’un adaptateur de plaque personnalisé.
   REMARQUE : Une carte de plaque personnalisée a été faite pour l’adaptateur de plaque disponible dans le commerce (voir table des matériaux). La carte des plaques contient les paramètres suivants; Épaisseur de la glissière: 1000 μm, Hauteur inférieure: 1.607 mm, variabilité de la hauteur inférieure: 100 μm, substrat: verre, épaisseur du coverslip : 150 μm, position du coverslip : bas – rangées : 1 – espacement : 56.987 mm, colonnes: 4 – espacement 28.391, taille et forme: rectangle, largeur 23.00 mm, hauteur: 73.00 mm, décalé à A1 21.29 mm - 42.74 mm)
2. Chargez l’adaptateur de diapositives sur le microscope et utilisez la fonction Preview pour carreler une image 10x du coverslip.
3. Sélectionnez un embryon en haut ou en bas d’une rangée, puis sélectionnez Objectif et passez à 60x (NA 0,95). Déterminer une exposition appropriée pour le canal de fluorescence désiré.
   REMARQUE : Maintenir l’intensité du laser sous 25 % pour l’imagerie cellulaire vivante.
4. Sur le tableau de bord principal, utilisez la fonction Preview pour carreler une image fluorescente 60x contenant les deux rangées d’embryons.
5. Sur le tableau de bord principal, sélectionnez le menu binning drop down et réglez le binning à 1 x 1 pour une résolution optimale.
6. Utilisez l’onglet configuration z Stack pour définir les paramètres des piles z.
   1. Dans l’onglet configuration z Stack, utilisez les flèches Haut et Bas pour définir ensuite les limites de la pile z supérieure et inférieure. Une fois que les limites supérieure et inférieure sont définies, sélectionnez l’icône crayon vert pour enregistrer la position de la pile z. Notez la position de la pile z car elle sera utilisée à l’étape 5.6.5.
   2. Dans l’onglet configuration z Stack, utilisez la boîte d’entrée z Step définir l’espacement entre les tranches z.
      REMARQUE : Le nombre total de tranches est déterminé en modulant l’étape 5.6.1 et 5.6.2.
   3. Sur le tableau de bord principal, cliquez à droite sur le canal fluorescent et utilisez le menu drop down mode image pour définir le mode imagerie en 3D.
   4. Sur le tableau de bord principal, sélectionnez la boîte Laser Autofocus pour désactiver l’autofocus.
   5. Sur le tableau de bord principal, définissez la mise au point initiale avec la position z-stack à partir de l’étape 5.6.1, puis sélectionnez la boîte de mise au point initiale pour désactiver la fonction «Recentrageà chaque point de temps ».
7. Dans l’onglet Champs, utilisez le menu de drop down de placement field pour activer les points personnalisés,puis utilisez les Flèches pour sélectionner des points pour l’imagerie.
   REMARQUE : L’intervalle de temps entre les acquisitions (étape 5.8) déterminera combien de points personnalisés peuvent être imaged simultanément.
8. Dans l’onglet Série time, sélectionnez la case Acquire Time Series pour activer la fonction série time, puis définissez le nombre total de points de temps.
   REMARQUE : 6 points personnalisés x 5 tranches z x 80 piles = 2 400 images, 2 400 images x 8,2 Mo par image = 19,68 Go d’espace disque.
9. Sur le tableau de bord principal, utilisez la boîte d’entrée de nom pour nommer les paramètres d’acquisition, puis sélectionnez Fichier et Enregistrer pour enregistrer les paramètres d’acquisition.
10. Sur le tableau de bord principal, sélectionnez le bouton Scan pour exécuter l’acquisition.

6. Post traitement d’image

1. Faites glisser et déposer le fichier xdce aux Fidji pour ouvrir la série d’images comme une hyperstack multidimensionnelle.
2. Enregistrer l’hyperstack comme un fichier tif.
3. Créez des projections d’intensité maximale et enregistrez-les sous forme de fichiers tif.
4. Assembler une bibliothèque de projections d’intensité maximale et construire un pipeline pour l’extraction et l’analyse des données.

Résultats

L’approche présentée dans ce protocole a été employée pour examiner le rôle des microtubules dans la réorganisation endoplasmique de Reticulum (ER) pendant la mitose dans l’embryon de Drosophila ^15. Pendant la mitose, la structure des ER montre une réorganisation spectaculaire, cependant, les forces qui conduisent ces changements sont mal comprises. Récemment, une famille de protéines de formation d’ER ont été montrées pour favoriser la formation du tubule^{d’ER 25,26,27,28,}qui sont connus pour leur proximité avec des microtubules^28. Pour étudier le rôle des microtubules sur la morphologie des urgences, les méthodes fournies dans le protocole ont été utilisées pour générer des données afin de comparer quantitativement les effets de plusieurs traitements médicamenteux microinjectés sur la réorganisation des urgences pendant la mitose. La colchicine, qui empêche une nouvelle polymérisation des microtubules, a considérablement réduit la réorganisation de l’ER pendant la mitose, comme le montrent la figure 5 et la figure 6. En outre, l’approche décrite ici a permis la production de données d’imagerie des tours de temps pour 32 embryons. Des mesures d’intensité moyenne et maximale ont été produites à partir de 12 800 régions d’intérêt à l’aide d’un script MATLAB personnalisé, qui a également généré des statistiques descriptives et inférentielles essentielles pour faire des comparaisons entre les traitements médicamenteux. En raison de la disponibilité des sondes moléculaires et de la facilité des microinjections, les méthodes décrites ici sont facilement adaptables pour étudier une variété de processus biologiques par le biais de la quantification de l’intensité de fluorescence.

Figure 5 : Images représentatives de l’enrichissement de Rtnl1-GFP et reepB-GFP aux poteaux de fuseaux pendant la mitose. (A) champ de vision 60x de ReepB-GFP pendant la mitose dans le cycle cellulaire 10. Le carré bleu représente le champ de vision utilisé pour les panneaux B-E. Le panneau A est traité avec un filtre binaire de seuil. Ce filtre n’a pas été appliqué aux panneaux B-E puisqu’il exclut les données des pixels en dessous du seuil défini. (B,D) ReepB-GFP en contrôle, et en colchicine. (C,E) Rtnl1-GFP en contrôle, et en colchicine. Ce chiffre a été modifié de Diaz et coll.¹⁵. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6 : Quantitation de l’enrichissement de Rtnl1-GFP et reepB-GFP aux poteaux de fuseau pendant la mitose. 20 broches et 20 IRM cytoplasmiques sur 10 images ont été analysées pour 32 embryons dans les conditions suivantes. (A) 10% injections de contrôle DMSO pour rtnl1-GFP. Les embryons de contrôle ont montré une augmentation de 0,1 fois l’enrichissement (p<0,001 pour tous les échantillons à T210) par rapport aux échantillons non injectés (p < 0,001 pour tous les échantillons à T210). (B) Embryons ReepB-GFP injectés avec 10% DMSO pour servir de contrôle. Les embryons de contrôle ont montré une augmentation de 0,1 fois l’enrichissement (p<0,001 pour tous les échantillons à T210) par rapport aux échantillons non injectés(figure 1E; p < 0,001 pour tous les échantillons à T210). (C) Embryons Rtnl1-GFP injectés avec 5 μM Colchicine. Ici, nous avons mesuré une réduction de l’enrichissement rtnl1-GFP aux broches (p < 0,001 pour tous les échantillons à T210) par rapport aux contrôles (A) (p < 0,001 pour tous les échantillons à T210). (D) Embryons ReepB-GFP injectés avec 5 μM Colchicine. Nous avons mesuré une réduction de l’enrichissement reepB-GFP aux broches (p<0,001 pour tous les échantillons à T210) par rapport aux témoins (B) (p<0,001 pour tous les échantillons à T210). Ce chiffre a été modifié de Diaz et coll.¹⁵. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

1. Pâte de levure21	2. Assiettes de raisin21	3. Colle heptane24
1.1 Ajouter 7 grammes de levure sèche active à un cône de 50 ml. Ajouter 9 millilitres d’eau DI et mélanger jusqu’à la constance à l’aide d’une spatule métallique.	2.1 Faire la solution a: Ajouter 6 grammes d’agar à 140ml d’eau DI dans un flacon de 250ml et l’autoclave.	3.1 Remplissez un flacon de scintillation en verre de 50 pouces de ruban adhésif à double face.
1.1 Ajouter 7 grammes de levure sèche active à un cône de 50 ml. Ajouter 9 millilitres d’eau DI et mélanger jusqu’à la constance à l’aide d’une spatule métallique.	2.2 Faire la solution b : Mélanger 0,1 gramme de parabène méthylique dans 2 ml d’éthanol, puis ajouter cette solution à 60 ml de concentré de jus de pamplemousse.	3.2 Ajouter 20 ml d’heptane et sceller le flacon de scintillation en verre avec le parafilm. Faire pivoter toute la nuit à température ambiante.
	2.3 Immédiatement après la solution d’autoclaving a, mélanger dans la solution b et verser le mélange dans des plats perti de 10 x 35mm. (fait 35 assiettes de raisin)	3.3 Enlever les débris de ruban adhésif en plastique en transférant la colle dans 2 tubes coniques de 15 ml et en les centrifugant à 3 000 rpm pendant 15 minutes.
	2.4 Laisser les assiettes de raisin s’installer à température ambiante pendant la nuit, les couvercles des assiettes éteints. Couvrir les assiettes de couvercles et les conserver à 4°C après qu’elles soient réglées.	3.4 Transférer le supernatant de colle dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml pour le stockage.

Tableau 1 : Recettes de médias et de solutions.

Discussion

Le protocole décrit ici est très polyvalent et facilement adaptable pour étudier les événements biologiques à divers stades du développement embryonnaire de Drosophila. Ce protocole est bien adapté pour étudier les processus biologiques qui se produisent sur de longues périodes de temps. Par exemple, des études sur la cellularisation^29,30 ou la formation de domaines hétérochromatines dans Drosophila³¹,^{32 pourraient}bénéficier de l’utilisation des méthodes décrites dans ce protocole puisque ces processus se produisent sur une longue période de temps. En outre, la taille de l’échantillon peut être augmentée en diminuant le grossissement pour étudier les questions qui nécessitent moins de résolution optique, comme le moment entre les divisions syncytiales³³ ou la durée de la gastrulation³⁴.  De même, un objectif 20x permet d’imager deux embryons dans un même plan d’imagerie. Les méthodes de ce protocole fournissent une plate-forme dynamique pour poser des questions biologiques en utilisant le développement embryonnaire comme un système modèle d’analyse quantitative.

Il y a 3 étapes critiques dans ce protocole. Après la déchorionation dans 50% d’eau de Javel, il est impératif que les embryons soient rincés et séchés vigoureusement 5 fois (2,3,4). Cette étape élimine les restes de petits morceaux de chorion. Les restes de chorion obstruent le champ de vision lors de l’imagerie de l’embryon. Lors du montage des embryons sur le couvercle en verre (3,5), il est important de presser les embryons sur la colle avec une pression uniforme. Cela placera les embryons sur le même plan z. Lorsque vous coupez l’aiguille de microinjection, il est important de rétracter immédiatement le piston pour ajuster le débit de l’aiguille ou vous perdrez tout votre injecteur.

Notre étude a été limitée par deux facteurs. Le premier facteur était de ne pas avoir de processus automatisé de segmentation. Nous avons conçu un script de segmentation manuelle à l’aide de MATLAB, cependant; avec un marqueur de fuseau génétiquement codé, ce processus pourrait être automatisé. À l’avenir, nous aimerions produire CNN-RFP^21,Rtln1-GFP et CNN-RFP; Lignes transgéniques ReepB-GFP pour permettre la segmentation automatisée des fuseaux. Pour de plus amples renseignements sur notre pipeline de scripts et d’analyses MATLAB, consultez les documents supplémentaires de Diaz et coll.¹⁵. Deuxièmement, nous avons également été limités par notre intervalle d’acquisition de 35 s, qui ne nous a permis d’imager 6 embryons simultanément. Un intervalle d’acquisition plus long nous permettrait d’imager plus d’embryons simultanément. Bien que le débit de livraison de médicaments puisse être augmenté en remplaçant la microinjection par une étape de perméation, nous avons constaté que cela n’était pas nécessaire puisque la taille de notre échantillon était déjà limitée par intervalle d’acquisition.

Bien que ce protocole ait été utilisé pour l’image du développement embryonnaire de Drosophila, l’approche globale est adaptable pour étudier le développement embryonnaire dans d’autres systèmes modèles multicellulaires, tels que C. elegans,Oursins et Xenopus. Les embryons sont extrêmement utiles pour l’analyse quantitative puisqu’ils sont facilement synchronisés par collecte ou fécondation. En outre, les embryons ne se déplacent pas ou ne nagent pas loin d’un champ de vision, permettant l’utilisation d’un logiciel simple d’acquisition multipoint capable de produire plusieurs vidéos time lapse pour l’analyse quantitative. Bien que nous avons utilisé un analyseur à contenu élevé dans notre étude, tout système de microscope inversé capable d’acquisition multipoint peut être jumelé avec les méthodes mentionnées ci-après.

Des résultats similaires peuvent être obtenus à l’aide d’un microscope confocal inversé capable d’acquérir plusieurs points; cependant, les avantages d’un analyseur à contenu élevé émergent à mesure que l’on augmente la taille de l’échantillon pour étudier les questions qui nécessitent moins de résolution dans le temps. Un avantage évident à l’aide d’un analyseur à contenu élevé est la possibilité d’imager 4 diapositives distinctes simultanément par rapport à 1 diapositive sur les systèmes traditionnels. Avec un ensemble complet de 4 diapositives et 40 embryons sur chaque diapositive, 160 embryons peuvent être photographiés sur plusieurs heures, tant que l’intervalle d’acquisition est d’au moins 15 min entre les images. Un autre avantage important à l’aide d’un analyseur à haute teneur est que les échantillons sont complètement scellés à partir de toutes les sources de lumière externes, ce qui est nécessaire pour les mesures basées sur l’intensité de fluorescence. Enfin, l’analyseur à contenu élevé utilisé dans notre étude dispose d’un appareil photo CMOS de 5,5 mégapixels qui offre un champ de vision généreux de 221,87 μm au grossissement 60x. Ce champ de vision plus vaste nous a permis d’imager la moitié d’un embryon par point d’acquisition.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 x 35mm Micro Dish	VWR	Cat # : 10799-192	N/A
100 % concentré de jus de raisin	Welch’s, 100 % concentré Jus de raisin	N/A	Achat à
l’épicerie Erlenmeyer 250ml Flops Erlenmeyer, Bouche étroite	VWR	Cat # : 10536-914	N/A
3" Tamis non métallique n° 140	Gilson Company	SV-165 #140 N	/A
4 Slide Imaging Plateau	Grace Biolabs	SKU : 400104	N/A
ACROS Organics , n-Heptane, 99+ %, pour spectroscopie	Fisher Scientific	Cat # : AC411255000	N/A
Acros Organics, Éthanol, 99.5 %, réactif ACS, absolu, 200 proof	Fisher Scientific	Cat# : AC615095000	N/A
Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99 % . (méthylparabène)	Fisher Scientific	Cat# : AC126961000	N/A
Housse de protection, rectangulaire, 25 x 75 mm, #1 Verre flotté	Fisher Scientific	Cat # : 50-143-782	N/A
Matériau de la feuille de silicone pour puits de culture - 1,6 mm d’épaisseur	Grace Biolabs	SKU : 664273	N/A
DWK Life Sciences Wheaton 20mL Flacons à scintillation liquide PET	Scientific	Cat # : 03-341-71A	N/A
Cage de prélèvement d’embryons-Mini	Genesee Scientific	Chat # : 59-105	N/A
Eppendorf Microloader Pipette Tips	Scientific	Code produit : 10289651	N/A
Falcon 15mL Centrifugeuse conique	Fisher Scientific	Cat # : 05-527-90	N/A
Falcon 50mL Tubes de centrifugation coniques	Fisher Scientific	Cat # : 14-432-22	N/A
Fleischmann’s, Levure sèche active	Fleischmann’s	N/A	Achat à l’épicerie
Assiettes à raisins	RFERIER À LA PRÉPARATION DE LA RECETTE	N/A	N/A
Huile Halocarbure 27	Genesee	Chat scientifique # : 59-133	N/A
Huile d’halocarbure 700	Genesee Chat	scientifique # : 59-131	N/A
Colle à l’heptane	RÉFÉRER À LA PRÉPARATION DE LA RECETTE	N/A	N/A
Lames de rasoir industrielles (acier au carbone chirurgical) à simple tranchant n° 9	VWR	Cat # : 55411-050	N/A
Parafilm M Film d’étanchéité de laboratoire, rouleau de 4 pouces x 250 pieds Fisher	Scientific	Cat # : 50-998-944	N/A
Ruban adhésif double face Scotch avec distributeur, largeur étroite, conçu pour le collage, 1/2" x 7 vg, 3/paquet Caddy	Fisher Scientific	Cat # : NC0879005	N/A
Perles de gel de silice, déshydratant ~ 2 - 5 mm	Millipore Sigma	SKU : 1077351000	N/A
Cuillère/Spatule en acier inoxydable	VWR	Cat # : 470149-044	N/A
W.A. Hammond Drierite Indiquant les absorbants Fisher	Scientific	Cat # : 23-116582	N/A
Pâte de levure	RÉFÉRER À LA PRÉPARATION DE LA RECETTE	N/A	N/A N/A
<>EQUIPMENT
Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge	Beckman Coulter	N/A	Vous aurez besoin d’accéder à des inserts de centrifugeuse coniques de 15 ml.
Autoclave	N/A	N/A N’importe	quel autoclave fera l’affaire.
Micro-injecteur Nanoject II de Drummond.	Drummond Scientific	N/A	Il s’agit d’un système d’injection à base d’huile minérale.
Analyseur de cellules GE Healthcare IN 6000.	GE healthcare	N/A	Un microscope confocal rapide capable d’acquisition multipoint peut être substitué.
Réfrigérateur (4C° ;)	N/A	N/A	Les milieux anti-mouches et la pâte de levure doivent être entreposés à (4C° ;).
Stéréomicroscope Zies Stemi 508 avec base de transillumination 300 et éclairage zénithal en col de cygne.	Microscopie Zeiss	N/A	La base de transillumination et l’éclairage en col de cygne sont nécessaires.