Génération de bibliothèques d’insertion transposon dans les bactéries gramnégatives pour le séquençage à haut débit

Résumé

Nous décrivons une méthode pour générer des bibliothèques mutantes transposons saturantes chez les bactéries gramnégatives et la préparation subséquente des bibliothèques d’amiplicons d’ADN pour le séquençage à haut débit. À titre d’exemple, nous nous concentrons sur l’agent pathogène ESKAPE, Acinetobacter baumannii, mais ce protocole est accessible à un large éventail d’organismes gramnégatifs.

Résumé

Le séquençage de transposon (Tn-seq) est une méthode puissante qui combine la mutagenèse transposon et le séquençage parallèle massif pour identifier les gènes et les voies qui contribuent à la condition physique bactérienne dans un large éventail de conditions environnementales. Les applications Tn-seq sont étendues et ont non seulement permis l’examen des relations génotype-phénotype au niveau de l’organisme, mais aussi au niveau de la population, de la communauté et des systèmes. Les bactéries gramnégatives sont fortement associées aux phénotypes de résistance aux antimicrobiens, ce qui a augmenté les incidents d’échec du traitement antibiotique. La résistance aux antimicrobiens est définie comme une croissance bactérienne en présence d’antibiotiques autrement mortels. La colistine antimicrobienne de « dernière ligne » est utilisée pour traiter les infections bactériennes gramnégatives. Cependant, plusieurs agents pathogènes gramnégatifs, dont Acinetobacter baumannii, peuvent développer une résistance à la colistine par le biais d’une gamme de mécanismes moléculaires, dont certains ont été caractérisés à l’aide de Tn-seq. En outre, les voies de transduction de signal qui régulent la résistance à la colistine varient au sein des bactéries gram-négatives. Nous proposons ici une méthode efficace de transpsine mutagenesis dans A. baumannii qui simplifie la génération d’une bibliothèque d’insertion de transposon saturé et la construction de bibliothèque d’amplicon en éliminant la nécessité d’enzymes de restriction, de ligature d’adaptateur et de purification de gel. Les méthodes décrites dans le présent mécanisme permettront une analyse approfondie des déterminants moléculaires qui contribuent à la condition physique de A. baumannii lorsqu’elles sont confrontées à la colistine. Le protocole s’applique également à d’autres agents pathogènes Gram-négatifs de l’ESKAPE, qui sont principalement associés à des infections nosocomiales résistantes auxmédicaments.

Introduction

La découverte d’antibiotiques est sans aucun doute l’un des événements les plus importants liés à la santé du^XXe siècle. Non seulement les antibiotiques résolvent rapidement les infections bactériennes graves, mais ils jouent également un rôle central dans la médecine moderne. Les chirurgies majeures, les transplantations et les progrès de la médecine néonatale et de la chimiothérapie laissent les patients vulnérables aux infections potentiellement mortelles et ces thérapies ne seraient pas possibles sans antibiotiques^1,2. Cependant, le développement rapide et la propagation de la résistance aux ant....

Protocole

1. Préparation de la souche bactérienne

1. Streak de la souche « onair » (E. coli MFD DAP^-/pJNW684, Table of Materials) pour les colonies isolées sur luria-Bertani agar complétée par 600 μM d’acide diaminopimélique (DAP), 100 mg/L d’ampicilline et 25 mg/L de kanamycine. Incuber toute la nuit à 37 °C. À l’aide d’une seule colonie isolée, inoculer 50 ml de bouillon de Luria (LB) complétés par 600 μM DAP, 100 mg/L d’ampicilline et 25 mg/L de kanamycine dans une fiole Erlenmeyer de 250 mL et l’étiqueter comme « on donateur ».
2. Streak la souche « e destinataire » (A. baumannii souche ATCC 17978, Table d....

Résultats

Les méthodes décrites décrivent la génération d’une bibliothèque transposon à haute densité dans la souche A. baumannii ATCC 17978 par conjugaison bactérienne à l’aide de E. coli MFD DAP^-, qui reproduit le plasmid pJNW684 (Figure 4B). Le protocole détaillé utilise la conjugaison bactérienne biparentale pour le transfert de pJNW684 de la souche E. coli λpir+ donneur à la souche receveur A. baumannii. Il s’agit d’une méthode efficace et.......

Discussion

A. baumannii est une menace émergente pour la santé publique mondiale en raison de l’acquisition rapide d’AMR contre les thérapeutiques de « dernière ligne », telles que la colistine^{10,11,12,23,24,30,31}. Au cours des dernières décennies, Tn-seq a joué un rôle crucial dans l’élucidat.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10 mM ddCTP, 2',3'-Didéoxycytidine-5'-Triphosphate	Affymetrix	77112
100 mM dCTP 2'-Deoxycytidine-5'-Triphosphate	Invitrogen	10217-016
Échelle d’ADN 100bp Marqueur de poids moléculaire	Promega	PR-G2101
100mm x 15mm Boîtes de Pétri	Corning	351029
Boîtes de Pétri 150mm x 15mm	Corning	351058
1X B& W	N/A	N/A	Dilué 2X B& W par la moitié pour obtenir 1X N&B.
l’acide 2,6-diaminopimélique	Alfa Aesar	B2239103	utilisé à 600 & micro ; M
2X B& W	N/A	N/A	Ajouter 2 M de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EDTA (pH 7,5) dans l’eau. Utilisé avec des billes de streptavidine. Les solutions se conservent à température ambiante.
Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de 50 ml	Fisher Scientific	12-565-271
9,5 mM dCTP/0,5 mM ddCTP	N/A	N/A	9,5 ml 100 mM dCTP ; 5 ml 10 mM ddCTP ; 85,5 ml d’eau. Conserver à -20° ;C.
AccuPrimeTM Pfx ADN polymérase	Invitrogen	12344
Acinetobacter baumannii ATCC 17978	ATCC	N/A	AmpS, KanS
Ampicilline (100 mg/L)	Fisher Scientific	BP1760	utilisé à 100 mg/L
Système de purification par PCR AMPure XP	BECKMAN COULTER	A63881
BioAnalyzer	Agilent	G2939B
Bioanalyseur Haute Sensibilité Analyse de l’ADN	Agilent	5067-4626
Mélange de solutions désoxynucléotidiques (dNTP)	New England Biolabs (NEB)	N0447L
DynaMag-2 Rack magnétique	Invitrogen	12321D
E.coli MFD Dap-N	/A	N/A	DAP Auxotroph, nécessite 600 mM de DAP ajouté exogène pour se développer. Contient la machinerie RP4 pour le transfert de plasmides. Support pour JNW68 (36).
Éthanol	Fisher Scientific	A4094
Flacons cryogéniques à filetage externe Corning		09-761-71
Perles de verre	Corning	72684
Glycérol	Fisher Scientific	G33
Boucles d’inoculation	Fisher Scientific	22-363-602	Outil de raclage
Kanamycin	Fisher Scientific	BP906	utilisé à 25 mg/L
LB d’agar, Miller	Fisher Scientific	BP1425
LB bouillon, Miller	Fisher Scientific	BP1426
LoTE	N/A	N/A	Ajouter 3 mM de Tris-HCl, 0,2 mM d’EDTA (pH 7,5) dans l’eau. Utilisé avec des billes de streptavidine. Les solutions se conservent à température ambiante.
Tampon de lyse	N/A	N/A	9,34 mL de tampon TE ; 600 ml de SDS à 10 % ; 60 ml de protéinase K (20 mg/mL)
Phénol/Chloroforme/Alcool isoamylique (Mélange 25:24:1, pH 6,7/8,0, Liq.)	Fisher Scientific	BP1752I
Saline tamponnée au phosphate, solution 10X	Fisher Scientific	BP39920	diluée à 1X
Qubit 4 Fluorimètre	Thermo Fisher	Q33238
Tubes de dosage Qubit	Thermo Fisher	Q32856
Qubit dsDNA HS	Thermo Fisher	Q32851
Sonicateur avec réfrigéré bain-marie	Qsonica Sonicators	Q2000FCE
Streptavidin Magnetic Beads	New England Biolabs (NEB)	S1420S
TE buffer	N/A	/A	10 mM Tris-HCl (pH 8.0) ; 1 mM EDTA (pH 8.0)
Terminal Deoxynucleotidyl Transferase (rTdt)	Promega	PR-M1875

Kit de dosage N