Visualisation de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de fibrose kystique

Résumé

Ce protocole fournit des méthodes de visualisation des cellules bactériennes et du polysaccharide du locus de synthèse des polysaccharides (Psl) dans les expectorations des patients atteints de fibrose kystique.

Résumé

La détection précoce et l’éradication de Pseudomonas aeruginosa dans les poumons des patients atteints de fibrose kystique peuvent réduire le risque de développer une infection chronique. Le développement d’infections chroniques à P. aeruginosa est associé à un déclin de la fonction pulmonaire et à une augmentation de la morbidité. Par conséquent, il y a un grand intérêt à élucider les raisons de l’échec de l’éradication de P. aeruginosa par l’antibiothérapie qui se produit chez environ 10 à 40% des patients pédiatriques. L’un des nombreux facteurs qui peuvent influer sur la clairance de l’hôte de P. aeruginosa et la sensibilité aux antibiotiques est les variations de l’organisation spatiale (comme l’agrégation ou la formation de biofilm) et la production de polysaccharides. Par conséquent, nous nous sommes intéressés à visualiser les caractéristiques in situ de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Une technique d’élimination des tissus a été appliquée aux échantillons d’expectorations après avoir intégré les échantillons dans une matrice d’hydrogel afin de conserver les structures 3D relatives aux cellules hôtes. Après le nettoyage des tissus, des étiquettes fluorescentes et des colorants ont été ajoutés pour permettre la visualisation. L’hybridation in situ par fluorescence a été réalisée pour la visualisation des cellules bactériennes, la liaison d’anticorps anti-Psl marqués par fluorescence pour la visualisation de l’exopolysaccharide et la coloration DAPI à la coloration des cellules hôtes afin d’obtenir des informations structurelles. Ces méthodes ont permis d’obtenir une imagerie à haute résolution de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose par microscopie confocale à balayage laser.

Introduction

Dans cette étude, des expériences ont été conçues pour visualiser la structure in vivo de Pseudomonas aeruginosa dans les expectorations de patients pédiatriques atteints de fibrose kystique (FK). Les infections à P. aeruginosa deviennent chroniques chez 30 à 40 % de la population pédiatrique atteinte de mucoviscidose ; Une fois que les infections chroniques se sont établies, il est presque impossible de les éliminer¹. Les isolats de P. aeruginosa provenant de patients atteints d’une infection précoce sont généralement plus sensibles aux antimicrobiens, par conséquent, ceux-ci sont traités avec des antibiotiques anti-....

Protocole

L’approbation du Comité d’éthique de la recherche (CÉR) est requise pour prélever et conserver des échantillons d’expectorations prélevés sur des sujets humains. Les études présentées ici ont été approuvées par le CER#1000058579 de l’Hôpital pour enfants malades.

1. Collecte des expectorations

1. Conservez les expectorations dans un gobelet de collecte stérile et conservez-les immédiatement à 4 °C pendant un maximum de 24 h avant la fixation.
   REMARQUE : Laisser les expectorations trop longtemps à 4 °C sans fixation peut entraîner une dégradation cellulaire, en particulier la dégradation des globules blancs. La fixation le plus tôt....

Résultats

La conception globale de l’expérience est résumée à la figure 1 et à la figure 2. La figure 1 résume les protocoles de traitement et d’élimination des expectorations. Le traitement et l’élimination des expectorations peuvent prendre jusqu’à 17 jours. Cependant, le protocole peut être arrêté et les échantillons peuvent être stockés après la fixation avec la PFA (jour 2) ou après le nettoyage des tissus (jours 5 à 17 selon le temps de.......

Discussion

L’objectif de ce protocole est de permettre d’avoir un aperçu de l’organisation in situ des cellules de P. aeruginosa dans les expectorations de patients atteints de mucoviscidose. Les échantillons d’expectorations doivent être conservés à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités s’ils ne peuvent pas être fixés immédiatement. Il a été démontré que le nombre de cellules de P. aeruginosa dans les expectorations ne change pas de manière significative s’il est traité à 1 h, 24 h ou 48 h, lorsqu’il est stocké à.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
29:1 acrylamide bisacrylamide, solution à 30 %	BioRad	161-0146
Verre de protection à 8 chambres Nunc Lab-Tek	ThermoFischer Scientific	155411
Anaerogen2.5L	Oxid Inc.	35108
Chambres de perfusion Coverwell	Microscopry Sciences	70326 -12/-14
HistoDenz	Sigma	D2158
Protect RNA Rnase Inhibitor	Sigma	R7387
PseaerA - GGTAACCGTCCCCCTTGC	Eurofins		Détails de la commande : Produit : Oligo d’ADN modifié ; Nom : PseaerA ; Séquence : [Alexa488]GGTAACCGTCCCCCTTGC ; Synthèse : 50 nmol ; Purification : HPLC ; État du navire : Rendement complet (sec)
Psl0096-Texas Red	Medimmune		Les anticorps Psl0096-Texas red étaient un cadeau aimablement offert par Medimmune et la société doit être contactée pour toute demande de commande.
VA-044 Durcisseur	Wako	27776-21-21