Article de méthode

Exploration de la structure des tissus adipeux par compensation du méthylsalicylate et imagerie 3D

DOI :

10.3791/61640

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19 août 2020

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1Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity", Nice, France, 2Integrated Cardio Metabolic Center, Department of Medicine, Karolinska Institutet, Stockholm, Sweden, 3Université Côte d'Azur, Inserm UMR1065, C3M, Team "Haematometabolism in Diseases", Nice, France, 4Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale (IPBS), Université de Toulouse, CNRS, UPS, Toulouse, France

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons une méthode simple, peu coûteuse et rapide de compensation pour résoudre la structure 3D de la souris et du tissu adipeux blanc humain en utilisant une combinaison de marqueurs pour visualiser la vascularisation, les noyaux, les cellules immunitaires, les neurones, et les protéines de couche de lipide-goutte par imagerie fluorescente.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’obésité est un problème majeur de santé publique dans le monde entier qui augmente le risque de développer des maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2 et des maladies du foie. L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse de tissu adipeux (AT) due à l’hyperplasie d’adipocyte et/ou à l’hypertrophie, menant au remodelage profond de sa structure tridimensionnelle. En effet, la capacité maximale d’AT à se développer pendant l’obésité est essentielle au développement des pathologies associées à l’obésité. Cette expansion AT est un mécanisme homéostatique important pour permettre l’adaptation à un excès d’apport énergétique et pour éviter les retombées délétères lipidiques à d’autres organes métaboliques, tels que les muscles et le foie. Par conséquent, la compréhension du remodelage structurel qui conduit à l’échec de l’expansion AT est une question fondamentale avec une applicabilité clinique élevée. Dans cet article, nous décrivons une méthode de compensation simple et rapide qui est couramment utilisée dans notre laboratoire pour explorer la morphologie de la souris et du tissu adipeux blanc humain par imagerie fluorescente. Cette méthode de compensation AT optimisée est facilement réalisée dans n’importe quel laboratoire standard équipé d’une hotte chimique, d’un shaker orbital à température contrôlée et d’un microscope fluorescent. De plus, les composés chimiques utilisés sont facilement disponibles. Fait important, cette méthode permet de résoudre la structure 3D AT en tachant divers marqueurs pour visualiser spécifiquement les adipocytes, les réseaux neuronaux et vasculaires, et la distribution innée et adaptative des cellules immunitaires.

Introduction

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L’obésité se caractérise par une augmentation de la masse tissulaire adipeuse et est devenue un problème majeur de santé publique dans le monde entier, étant donné que les personnes souffrant d’obésité ont un risque accru de développer des maladies cardiovasculaires, le diabète de type 2, les maladies du foie et certains cancers.

Une fonction physiologique fondamentale du tissu adipeux est de moduler l’homéostasie du glucose entier du corps et des lipides1,2. Pendant la période d’alimentation, les adipocytes (c.-à-d. les principales cellules du tissu adipeux) stockent l’excès de glucose et de lipides fournis par un repas dans les triglycérides. Pendant le jeûne, les adipocytes décomposent les triglycérides en acides gras non estérifiés et en glycérol pour soutenir la demande énergétique du corps. Pendant le développement de l’obésité, les tissus adipeux se développent en augmentant la taille (hypertrophie) et/ou le nombre (hyperplasie) des adipocytes1,pour augmenter leur capacité de stockage. Lorsque l’expansion du tissu adipeux atteint sa limite, une constante très variable chez les patients, les lipides restants s’accumulent dans d’autres organes métaboliques, y compris les muscles et le foie3,4, conduisant à leur échec fonctionnel et l’initiation de l’obésité liées complications cardio-métaboliques1,5. Par conséquent, l’identification des mécanismes qui régissent l’expansion des tissus adipeux est un défi clinique clé.

Les modifications morphologiques documentées dans les tissus adipeux pendant l’obésité sont liées à son dysfonctionnement pathologique. Plusieurs procédures de coloration ont été utilisées pour décrire l’organisation tissulaire du tissu adipeux, y compris l’actine6, les marqueurs vasculaires7, les marqueurs de gouttelettes de lipides8, et les marqueurs spécifiques de cellules immunitaires9,10. Cependant, en raison de l’énorme diamètre des adipocytes (50 à 200 μm)11, il est essentiel d’analyser une grande partie du tissu entier en trois dimensions afin d’analyser avec précision les changements structurels dramatiques AT observés pendant l’obésité. Cependant, comme la lumière ne pénètre pas dans un tissu opaque, l’imagerie en 3D à l’intérieur d’un grand échantillon de tissus utilisant la microscopie par fluorescence n’est pas possible. Des méthodes de compensation des tissus pour les rendre transparentes ont été rapportées dans la littérature (pour un examen, voir12)permettant de dégager des tissus et d’effectuer en profondeur, la microscopie de fluorescence de tissu entier. Ces méthodes offrent des occasions sans précédent d’évaluer l’organisation cellulaire 3D dans les tissus sains et malades. Chacune des méthodes décrites présente des avantages et des inconvénients et doit donc être soigneusement sélectionnée en fonction du tissu étudié (pour un examen, voir13). En effet, certaines approches nécessitent une longue période d’incubation et/ou l’utilisation de matériaux ou de composés coûteux, toxiques ou difficiles à obtenir14,,15,16,17,18,19. Profitant de l’un des premiers composés utilisés il y a un siècle par Werner Spalteholz pour dégager les tissus20,nous avons mis en place un protocole convivial et peu coûteux qui est très bien adapté pour le nettoyage de tous les dépôts de tissus adipeux souris et humains dans n’importe quel laboratoire avec un équipement typique, y compris une hotte chimique, un shaker à température contrôlée et un microscope confocal.

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Protocole

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Ce protocole a été testé et est validé pour tous les dépôts de tissus adipeux blancs et de souris. Les tissus adipeux humains et murins ont été recueillis en conséquence aux lois européennes et approuvés par les comités d’éthique Français et suédois.

1. Fixation de la souris et du tissu adipeux blanc humain

  1. Immerger la souris récoltée ou les tissus adipeux blancs humains dans au moins 10 ml de PBS contenant 4% de paraformaldéhyde (PFA) dans un tube en plastique de 15 mL.
  2. Agiter le tube en plastique à température ambiante sur une plaque de roulement pendant 1 h.
  3. Laisser le tube en plastique à 4 °C sur une plaque de roulement pendant la nuit, pour compléter la fixation.
    REMARQUE : Ce protocole est adapté pour les grands échantillons de tissus adipeux, tels que les graisses épididymiques entières obtenues à partir de souris nourries d’un régime alimentaire normal (≈250 mg - ≈0,6 cm3). Pour les échantillons plus grands comme les tampons épididymiques obtenus à partir de souris nourries à un régime riche en graisses (≈1,5 g - ≈4 cm3) ou des échantillons de tissus adipeux humains, bien que le protocole de compensation devrait parfaitement fonctionner pour l’ensemble de l’échantillon (en augmentant le PFA et les mélanges d’anticorps), en général, nous coupons des morceaux de tissu autour de 1 g (≈2,5 cm3) pour réserver les échantillons restants soit pour des taches supplémentaires ou des applications. Pour la PFA (étape 1.1.) nous recommandons d’utiliser environ 10 fois le volume du tissu. Pour les mélanges d’anticorps (étapes 3.1. et 3.4.), augmenter le volume pour immerger complètement le tissu, et utiliser un tube en plastique de 15 ml (voir tableau des matériaux)si le tissu est trop grand pour un microtube en plastique de 1,5 mL (voir tableau des matériaux).

2. Permeabilisation et saturation de la souris et du tissu adipeux blanc humain

  1. Rincer le tissu adipeux blanc fixe dans 10 mL de PBS pendant 5 min à température ambiante pour enlever toutes les traces de PFA.
  2. Immerger le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml de PBS complété par 0,3% de glycine (voir tableau des matériaux)et secouer le tube à température ambiante dans un shaker orbital pendant 1 h à 100 tours par minute (tr/min) pour étancher les groupes d’aldéhyde libre restants.
  3. Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% de Triton X-100 (voir tableau des matériaux)et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée pendant 2 h à 100 tr/min.
  4. Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100 et 20% DMSO (voir Tableau des matériaux)et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant la nuit.
  5. Immerger le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml de PBS complété par 0,1% Tween-20 (voir tableau des matériaux),0,1% Triton X-100, 0,1 % de désoxycholate (voir tableau des matériaux)et 20 % de DMSO et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant au moins 24 h.
  6. Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100 et secouer le tube à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant 1 h.
  7. Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO et 3% BSA (voir Tableau des matériaux)et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant 12 h, pour saturer tous les sites qui pourraient non spécifiquement lier les anticorps.
    REMARQUE : À l’étape 2.7, le BSA peut être remplacé par le sérum sanguin des espèces de l’anticorps secondaire utilisé.

3. Procédure de coloration pour la souris et le tissu adipeux blanc humain

  1. Transférer le tissu dans un microtube en plastique de 1,5 mL contenant 300 μL de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA et les anticorps primaires (10x plus concentrés que pour la coloration cryosection mais concentration optimale d’anticorps devrait être évalué pour chaque anticorps). Protégez le tube de la lumière en couvrant avec du papier d’aluminium et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant au moins deux jours (voir la note à l’étape 1.1 et à l’étape 3.7.1).
  2. Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO et 3% BSA et secouer le tube protégé de la lumière à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant 5 h. Effectuez cette étape deux fois.
  3. Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO et 3% BSA et secouer le tube, protégé de la lumière, à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant une nuit à deux jours.
  4. Transférer le tissu à un microtube en plastique de 1,5 mL contenant 300 μL de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, 3% BSA et les anticorps secondaires (10x plus concentrés que pour la coloration cryosection). Protégez le tube de la lumière en couvrant avec du papier d’aluminium et secouez le tube à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant au moins deux jours (voir la note à l’étape 1.1 et à l’étape 3.7.1).
  5. Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% triton X-100, 10% DMSO, et 3% BSA et secouer le tube, protégé de la lumière, à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant 5 h. Effectuez cette étape deux fois.
  6. Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 mL contenant 10 ml de PBS complété par 0,2% Triton X-100, 10% DMSO, et 3% BSA et secouer le tube, protégé de la lumière, à 37 °C dans un shaker à température contrôlée orbitale à 100 tr/min pendant une nuit à deux jours.
  7. Rincer le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml de PBS et secouer le tube, protégé de la lumière, à 37 °C dans un shaker orbital à température contrôlée à 100 tr/min pendant 2 h.
    REMARQUE : Pour l’étiquetage de structures spécifiques telles que les noyaux ou l’actine, ajouter 4′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI ou équivalent) et/ou la phalloïdine fluorescente étiquetée à l’étape 3.1. lorsque seuls les anticorps primaires étiquetés fluorescents sont utilisés, ou à l’étape 3.4. lorsque des anticorps secondaires sont utilisés.
    NOTE: Pour la procédure de coloration, les anticorps primaires déjà conjugués avec les fluorochromes (comme ceux utilisés pour la cytométrie de flux) peuvent être utilisés et nous le recommandons pour le gain de temps et de spécificité. En effet, même si les anticorps primaires de souris peuvent être utilisés suivis d’anticorps anti-souris secondaires, comme nous l’avons démontré ici, nous avons souvent observé des taches non spécifiques des vaisseaux sanguins en raison de la circulation de l’immunoglobuline. Par conséquent, pour éviter ce problème, les anticorps primaires qui sont déjà étiquetés sont fortement recommandés et ici nous fournissons la preuve que les anticorps utilisés dans la cytométrie de flux sont compatibles avec notre procédure. Toutefois, dans le cas spécifique d’un antigène qui est exprimé à de faibles niveaux, une étape d’amplification du signal par l’intermédiaire d’anticorps secondaires est obligatoire; lorsque le seul anticorps primaire disponible est fabriqué chez la souris, une perfusion cardiaque des souris avec PBS pendant au moins 5 min au sacrifice peut enlever une grande proportion de l’immunoglobuline circulante et donc la coloration non spécifique.

4. Procédure de compensation pour la souris et le tissu adipeux blanc humain

  1. Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml d’éthanol à 50 % et secouez le tube, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant 2 h.
  2. Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml d’éthanol à 70 % et secouez le tube, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant 2 h.
  3. Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml d’éthanol à 95 % et secouez le tube, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant 2 h.
  4. Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml d’éthanol à 100 % et secouez le tube, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant 2 h.
  5. Plongez le tissu dans un tube en plastique de 15 ml contenant 10 ml d’éthanol à 100 % et secouez le tube, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant la nuit.
  6. Plonger le tissu dans une bouteille en verre de 20 ml avec un bouchon en plastique (voir tableau des matériaux) contenant 5 ml de salicylate de méthyle (voir tableau des matériaux)sous une hotte chimique et secouer le récipient en verre, protégé de la lumière, à température ambiante dans un shaker orbital à 100 tr/min pendant au moins 2 h.
    REMARQUE : La procédure de compensation pourrait être considérablement accélérée (si nécessaire) en évitant les étapes 4.3. et 4.5., bien que la qualité finale de compensation serait légèrement réduite.

Imagerie .3D confocale du tissu adipeux blanc dégagé

  1. Transférer le tissu dans une chambre d’imagerie métallique équipée d’un fond de verre (voir tableau des matériaux)sous une hotte chimique et remplir la chambre de salicylate de méthyle frais.
    REMARQUE : Pour fixer le tissu en place, et ainsi pour l’empêcher de flotter ou de se déplacer latéralement dans la chambre, appliquez plusieurs couvercles de verre ronds de 18 mm (voir tableau des matériaux)sur le dessus du tissu lors du montage dans la chambre.
  2. Placez la chambre d’imagerie sur un microscope confocal inversé.
  3. Imager le tissu à l’aide d’un objectif de grossissement faible (p. ex., objectif 4x) pour générer quelques cm3 cartes 3D de l’ensemble du tissu adipeux ou de l’échantillon de tissu humain.
  4. Sélectionnez plusieurs zones pour l’échantillonnage des tissus à un grossissement plus élevé. En règle générale, utilisez un objectif d’air longue distance 20x qui fournit un bon rapport entre la résolution et la profondeur. Nous acquérons de grandes images de mosaïque avec des piles z entre 600 et 2000 μm de profondeur.
    REMARQUE : Utilisez un objectif à longue distance pour l’image plus profondément dans le tissu.

6. Extraction des résultats quantitatifs des images de tissus adipeux 3D

REMARQUE : La segmentation des différentes structures et l’extraction ultérieure des informations quantitatives à partir de la pile d’images 3D générées au point 5 peuvent être effectuées à l’aide de l’une des nombreuses options logicielles d’analyse d’images existantes, commerciales ou freeware. Dans les points suivants, nous décrivons une stratégie qui est couramment utilisée dans notre laboratoire pour extraire des informations quantitatives à partir d’images de tissus adipeux 3D à l’aide de logiciels commerciaux (voir tableau des matériaux).

  1. Convertissez les piles 3D sur le format logiciel en espace mémoire libre.
  2. Segmenter les cellules.
    1. Ouvrez le module Cellule du logiciel.
    2. Modifiez le paramètre de détection cellulaire en coloration de membrane plasmatique.
    3. Choisissez le canal fluorescent du marqueur utilisé pour délimiter la périphérie cellulaire (phalloïdine qui étiquette l’actine corticale ou les marqueurs de membrane plasmatique tels que F4/80 pour le macrophage, le TCR-β pour les lymphocytes T, ou un faisceau de protéines CD de différenciation spécifiques aux sous-types de cellules immunitaires).
    4. Définissez les seuils et fournissez une plage de la taille prévue des cellules (c.-à-d. 1 à 200 μm pour la détection cellulaire).
    5. Exécutez la segmentation. Un volume correspondant à la pile z sera généré avec les cellules segmentées codées par couleur avec une couleur différente pour chacune des cellules voisines.
    6. Appliquer des filtres statistiques (taille, rondeur, circularité, etc.) dans l’onglet statistique pour exclure les artefacts de segmentation et/ou pour affiner les cellules segmentées à la cellule d’intérêt en fonction de leur taille (c.-à-d. 20-200 μm pour les adipocytes; 5-25 μm pour les macrophages; 1-3 μm pour les lymphocytes).
    7. Extraire les mesures et les données quantitatives (volume, nombre, taille, diamètre, etc.) de l’onglet statistiques.
  3. Segmenter les composants cellulaires (noyaux, vésicules, etc.) ou les vaisseaux en tant que structure.
    REMARQUE : Bien que la segmentation des filaments soit très utile pour étudier la connectivité des navires, nous utilisons la segmentation du module de surface pour extraire des données sur la taille, le volume et le diamètre des navires. En effet, la quantification des tailles des vaisseaux est perdue lors de l’utilisation du module filaments.
    1. Ouvrez le module Surface du logiciel.
    2. Sélectionnez le canal fluorescent du marqueur utilisé pour étiqueter spécifiquement le composant subcellulaire pour le reconstruire en 3D.
    3. Établir les seuils et fournir une plage de la taille prévue du diamètre de la structure (c.-à-d. 0,5 à 5 μm pour les noyaux; 0-100 μm pour les navires; etc.).
    4. Exécutez la segmentation. Un volume avec la structure cellulaire segmentée sera généré. Les mesures et les données quantitatives (volume, nombre, taille, diamètre, etc.) peuvent être extraites de l’onglet statistiques.
  4. Segmenter les vaisseaux comme un continuum tubulaire.
    REMARQUE : Bien que la segmentation des filaments soit très utile pour étudier la connectivité des navires, nous utilisons la segmentation du module de surface pour extraire des données sur la taille, le volume et le diamètre des navires. En effet, la quantification des tailles des vaisseaux est perdue lors de l’utilisation du module filaments.
    1. Ouvrez le module Filaments du logiciel.
    2. Sélectionnez le canal fluorescent correspondant à la coloration du navire.
    3. Définissez les seuils de l’intensité de fluorescence et sélectionnez le nombre approprié de nœuds de connexion attendus.
    4. Exécutez la segmentation. Les filaments représentant le réseau de navires seront générés en 3D. Les mesures peuvent être extraites de l’onglet statistiques, ce qui permet d’obtenir des données quantitatives, y compris la longueur du navire, le nombre de branchements des navires, etc.

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Résultats

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En utilisant la procédure décrite ici et résumée à la figure 1, nous avons été en mesure de tacher et optiquement clair l’homme et la souris blanc tissu adipeux tel que présenté à la figure 2A et figure 2B, respectivement. Le tissu effacé a été transféré à la chambre d’imagerie métallique pour effectuer l’imagerie confocale (figure 3A). La compensation a considérablement amélioré la profondeur des image...

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Discussion

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Les modifications qui se produisent dans le tissu adipeux au cours de la progression pathologique, comme celle de l’obésité, est fondamentale pour la compréhension des mécanismes derrière la pathologie. Des études pionnières qui ont révélé de tels mécanismes dans les tissus adipeux ont été basées sur des approches globales telles que la protéomique tissulaire adipeuse entière21, cytométrie de flux22,23, et transcriptomics...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont pas de conflits à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par l’INSERM, Université Côte d’Azur, et grâce à des subventions de l’Agence nationale de la recherche Français (ANR) par le biais des Investissements pour le futur Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), le programme UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) via l’Académie 2 « Systèmes Complexes » et l’Académie 4 « Complexité et diversité du vivant », Fondation pour la Recherche Médicale (Équipe FRM DEQ20180839587) et programme des jeunes chercheurs à J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON). Nous remercions également le Centre d’imagerie de C3M financé par le Conseil Départemental des Alpes-Maritimes et la Région PACA, et qui est également soutenu par la Plate-forme de microscopie et d’imagerie IBISA Côte d’Azur (MICA). Nous remercions Marion Dussot pour son aide technique dans la préparation des tissus. Nous remercions Abby Cuttriss, UCA International Scientific Visibility, pour la lecture de la preuve du manuscrit.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microtubes de 1,5 mLTubes Eppendorff - Dutscher33528
Tubes en plastique de 15 mLTubes Falcon - Dutscher352096
18 mm lamelle ronde en verreMariendfeld0117580
Flacon en verre de 20 mLWheaton986546
anticorps conjugué anti-souris alexa647Jackson ImmunoResearch715-605-150Dilution : 1/100
anticorps conjugué anti-rabbit-alexa647Jackson ImmunoResearch711-605-152Dilution : 1/100
BSASigma-aldrichA6003
CD301-PEBiolegendBLE145703Dilution : 1/100
Anticorps CD31AbCamab215912Dilution : 1/50
Logiciel d’analyse 3D commercial - IMARISOxford instrumentavec module
Cell Microscope confocal - Nikon A1RNikon
DapiThermoFisherD1306Stock Concentration : 5 mg/mL ; dilution 1/1000
DéoxycholateSigma-aldrichD6750
DMSOSigma-aldrichD8418
Glut4anticorps Santa Cruzsc-53566Dilution : 1/50
GlycineSigma-AldrichG7126
Lectin-DyLight649Vector LabDL-1178-1Concentration de stock : 2 µ ; g/µ ; L; Injection IV : 50 & micro ; L/souris
Chambre d’imagerie métallique équipée d’un fond en verre - Chambre AttoFluorThermofisherA7816
Salicylate de méthyleSigma-aldrichM6752
Anticorps contre la périlpineProgen651156Dilution : 1/50
Phalloidin-alexa488ThermoFisherA12379Dilution : 1/100
Anticorps TCR-&beta ;-PBBiolegendBLE109225Dilution : 1/100
TH anticorpsAbCamab112Dilution : 1/50
Triton X100Sigma-aldrichX100
Tween-20Sigma-aldrichP416
anticorps

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Clarification du tissu adipeuxImagerie 3DMicroscopie fluorescenceMicroscopie confocaleFixation tissulairePerm abilisation au Triton X 100Marquage par anticorpsImagerie du r seau vasculaireMorphologie des adipocytes

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