Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Megan E. Meuti; Robert Harrell

doi:10.3791/61651

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Article de méthode

Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

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DOI :

10.3791/61651

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10 septembre 2020

Megan E. Meuti¹ , Robert Harrell²

¹Department of Entomology, The Ohio State University, ²Insect Transformation Facility, Institute for Bioscience and Biotechnology Research, University of Maryland

Dans cet article

Résumé

CRISPR/Cas9 est de plus en plus utilisé pour caractériser la fonction des gènes dans les organismes non modèles. Ce protocole décrit comment générer des lignées knock-out de Culex pipiens,de la préparation de mélanges d’injection à l’obtention et à l’injection d’embryons de moustiques, ainsi que la façon d’élever, de croiser et de dépister les moustiques injectés et leur progéniture pour les mutations souhaitées.

Résumé

Les moustiques Culex sont les principaux vecteurs de plusieurs maladies qui ont un impact négatif sur la santé humaine et animale, y compris le virus du Nil occidental et les maladies causées par des nématodes filaires tels que le ver du cœur canin et l’éléphantasis. Récemment, l’édition du génome CRISPR / Cas9 a été utilisée pour induire des mutations dirigées par le site en injectant une protéine Cas9 qui a été complexée avec un ARN guide (aRNg) dans des embryons fraîchement pondus de plusieurs espèces d’insectes, y compris des moustiques appartenant aux genres Anopheles et Aedes. Manipuler et injecter des moustiques Culex est légèrement plus difficile car ces moustiques pondent leurs œufs debout dans des radeaux plutôt que individuellement comme d’autres espèces de moustiques. Nous décrivons ici comment concevoir des ARNg, les complexer avec la protéine Cas9, induire des moustiques femelles de Culex pipiens à pondre des œufs, et comment préparer et injecter des embryons nouvellement pondus pour la microinjection avec Cas9 / ARNg. Nous décrivons également comment élever et dépister les moustiques injectés pour la mutation souhaitée. Les résultats représentatifs démontrent que cette technique peut être utilisée pour induire des mutations dirigées vers le site dans le génome des moustiques Culex et, avec de légères modifications, peut également être utilisée pour générer des mutants nuls chez d’autres espèces de moustiques.

Introduction

Les moustiques Culex sont répartis dans toutes les régions tempérées et tropicales du monde et transmettent plusieurs virus mortels dont le virus du Nil occidental^1,l’encéphalite de Saint-Louis^{2 ainsi} que les nématodes filaires qui causent le ver du cœur canin³ et l’éléphantiasis^4. Les membres du complexe Culex pipiens, qui comprend Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens et Cx. pipiens molestus, présentent des variations frappantes dans de nombreux aspects de leur biologie. Par exemple, alors que Cx. quinquefascia....