Préparation et injection d’embryons de moustiques Culex pour générer des mutations nulles à l’aide de CRISPR/Cas9

Les moustiques Culex sont répartis dans toutes les régions tempérées et tropicales du monde et transmettent plusieurs virus mortels dont le virus du Nil occidental^1,l’encéphalite de Saint-Louis^{2 ainsi} que les nématodes filaires qui causent le ver du cœur canin³ et l’éléphantiasis^4. Les membres du complexe Culex pipiens, qui comprend Cx. quinquefasciatus, Cx. pipiens pipiens et Cx. pipiens molestus, présentent des variations frappantes dans de nombreux aspects de leur biologie. Par exemple, alors que Cx. quinquefasciatus et Cx. pipiens molestus sont incapables d’entrer dans une dormance hivernante^5,6, Cx. pipiens pipiens affichent des réponses saisonnières robustes et entrent en diapause en réponse à des jours courts^7,8. De plus, Cx. pipiens molestus a tendance à être plus anthropophile tandis que Cx. pipiens et Cx. quinquefasciatus sont plus zoophiles⁶. Cependant, aux États-Unis et dans de nombreux autres endroits du monde, ces espèces se croisent, ce qui a de fortes implications pour la transmission de maladies en tant qu’hybrides du Cx. pipiens pipiens et du Cx. pipiens molestus sont des mangeoires opportunistes et mordront à la fois les oiseaux et les humains⁹, servant ainsi de vecteurs de pont pour le virus du Nil occidental. L’étude de ces aspects et d’autres aspects fascinants de la biologie des moustiques Culex a été entravée, en partie parce que les moustiques Culex sont légèrement plus difficiles à élever en laboratoire que les moustiques Aedes, qui produisent des œufs quiescents et résistants à la dessiccation¹⁰ et parce que les outils moléculaires fonctionnels ne sont pas aussi bien développés pour les espèces Culex.

L’édition du génome CRISPR/ Cas9 est une technologie puissante qui a été utilisée pour évaluer la biologie de plusieurs espèces importantes de moustiques^11,12,13, y compris le moustique domestique du Sud, Culex quinquefasciatus^14,15,16. Cette technologie, développée par Jennifer Doudna et Emmanuelle Charpentier, exploite une défense bactérienne naturelle contre les virus par des endonucléases bactériennes associées à CRISPR (protéines Cas; voir revue par Van der Oost et al.^17). Lorsqu’elles sont injectées dans des embryons animaux, les protéines Cas9 en combinaison avec un ARN guide approprié peuvent produire des cassures double brin dans le génome. Ceci est le plus souvent fait en utilisant la protéine Cas9 qui est complexée avec des ARN guides, qui dirige l’activité de l’endonucléase vers une région spécifique du génome. Une fois que la protéine Cas9 a créé une rupture double brin spécifique au site, la machinerie cellulaire tente de réparer la rupture en utilisant l’un des deux mécanismes. La première consiste à ligaturer les deux extrémités ensemble par jointure d’extrémité non homologue (NHEJ), qui est sujette aux erreurs et produit souvent des insertions et des délétions hors cadre dans le génome qui peuvent entraîner des protéines non fonctionnelles, générant ainsi une mutation knock-out. Alternativement, la machinerie cellulaire peut utiliser la réparation dirigée par homologie (HDR) en trouvant des séquences similaires pour réparer correctement la rupture. La séquence similaire peut être fournie par le deuxième chromosome dans l’organisme (voir revue¹⁸). Cependant, si la séquence réparée correspond exactement à la séquence originale, la protéine Cas9 sera capable de couper à nouveau l’ADN. Alternativement, les chercheurs peuvent également inclure un plasmide donneur qui contient des séquences homologues de chaque côté du site coupé de la séquence cible avec une séquence de réparation alternative – souvent une protéine marqueur fluorescente, une version modifiée du gène original ou une autre modification – qui peut être copiée et insérée dans le génome, ou « knocked-in ».

Le timing est essentiel lors de l’injection d’embryons, et c’est particulièrement le cas lors de l’utilisation de l’édition du génome CRISPR / Cas9 pour créer des mutations chez les insectes. En effet, la protéine Cas9 et les aRNg n’ont la plus grande capacité à générer des mutations que lorsque l’embryon est dans son état syncytial, avant que les membranes cellulaires ne se soient formées et lorsque plusieurs noyaux sont accessibles à l’intérieur de l’embryon. Pour les moustiques, les noyaux atteignent la périphérie ~ 2-4 heures après la ponte, en fonction de la température¹⁹, et donc une micro-injection réussie doit se produire avant cette heure. De plus, la protéine Cas9 coupera tout ADN nucléaire auquel elle peut accéder, de sorte que l’individu résultant de l’injection contiendra une mosaïque de cellules, certaines ayant la mutation souhaitée et d’autres non. Pour que ces mutations soient héritées avec succès, la protéine Cas9 doit couper l’ADN qui réside dans la lignée germinale qui donnera naissance aux futurs ovules et spermatozoïdes. Pour s’assurer que des mutations sont générées dans la lignée germinale, il est préférable d’injecter tous les matériaux proches de l’emplacement des cellules polaires dans l’embryon, qui sont les progéniteurs de la lignée germinale de l’insecte. Les cellules polaires sont situées près de l’extrémité postérieure des embryons de Culex ²⁰. En plus d’injecter des embryons, il est impératif d’élaborer un plan minutieux pour le croisement et le dépistage de la progéniture afin de détecter la mutation souhaitée.

Ce protocole décrit comment générer des ARNg et les complexer avec la protéine Cas9 pour préparer des mélanges d’injection, ainsi que comment inciter les moustiques femelles de Culex pipiens à pondre des œufs et comment préparer et injecter ces œufs pour l’édition du génome médiée par CRISPR / Cas9. De plus, nous décrivons comment élever, croiser et dépister les embryons injectés et leur descendance pour confirmer que la mutation souhaitée a été obtenue. En utilisant ce protocole, nous avons généré des mutations nulles pour un gène d’intérêt, cycle,dans la souche Buckeye de Culex pipiens. Cette souche a été établie à l’origine en 2013 à partir de moustiques collectés sur le terrain à Columbus, Ohio et est maintenue par le laboratoire Meuti. Ce protocole peut être utilisé pour des études supplémentaires qui nécessitent l’édition du génome CRISPR / Cas9 chez les moustiques Culex, ainsi que d’autres espèces de moustiques, et, plus généralement, est pertinent pour l’utilisation de l’édition du génome CRISPR / Cas9 à toute espèce d’insecte.

Dans la plupart des établissements de recherche, un protocole de biosécurité approuvé doit être en place avant que les insectes transgéniques ne soient générés ou entretenus pour s’assurer que les organismes génétiquement modifiés ne s’échapperont pas ou ne seront pas retirés de l’installation de laboratoire. D’autres réglementations gouvernementales pourraient également s’appliquer. Avant de commencer un projet de cette nature, vérifiez toutes les politiques et procédures institutionnelles pour déterminer quels documents et approbations sont requis.

1. Conception d’ARNg et préparation de mélanges injectables

1. Concevez 2 à 5 aRNg pour chaque gène cible, car certains ARNg fonctionnent mieux que d’autres. Les ARNg qui ciblent un gène d’intérêt peuvent être conçus manuellement ou des programmes libres, tels que Chop-Chop, peuvent être utilisés.
2. Concevez et commandez des amorces qui amplifieront des fragments de 100 à 200 pb autour de chaque ARNg. Idéalement, le site de coupe devrait être situé approximativement dans le tiers moyen à la moitié du produit PCR. Notez combien de bp sur chaque site de la coupe seront produits.
3. Obtenir des ARNg.
   1. Achetez des ARNg auprès de sociétés commerciales telles que Integrated DNA Technologies, Fisher Scientific, Genescript et autres. C’est l’option la plus simple.
   2. Vous pouvez également créer des ARNg en laboratoire en utilisant l’amplification par PCR pour générer les modèles pour la synthèse isotherme ultérieure. Voir le protocole décrit par Port et al.²¹ et Kistler et al.²².
   3. Fournir des ARNg via un plasmide injecté dans les embryons. Dans ce cas, l’ARNg doit être piloté par le promoteur U6 (voir ^23,24 pour plus de détails).
4. Obtenez la protéine Cas9.
   1. Commandez Cas9 commercialement auprès de plusieurs sociétés, dont Fisher Scientific. C’est l’option la plus simple.
   2. Fabriquer la protéine Cas9 et purifier en laboratoire selon Basu et al.²⁵ et Kistler et al.²².
   3. Injectez l’ARNm Cas9 dans les embryons, où il sera ensuite traduit en protéine Cas9 active. L’ARNm Cas9 peut être synthétisé en laboratoire à l’aide de la transcription in vitro²² ou acheté auprès de fournisseurs tels que Sigma.
      REMARQUE: La protéine Cas9 traduite doit contenir un signal de localisation nucléaire (NLS) sur la terminaison C, et donc la NLS doit également être présente dans l’ARNm Cas9 injecté.
   4. Exprimer la protéine Cas9 in vivo par l’expression à base de plasmides. Dans ce cas, il est préférable d’avoir l’expression de Cas9 sur le plasmide entraînée par un promoteur embryonnaire qui a été bien caractérisé chez l’espèce cible.
      REMARQUE: À ce jour, les promoteurs embryonnaires n’ont pas été bien caractérisés chez les moustiques Culex, et il est donc recommandé d’injecter des protéines purifiées ou de l’ARNm Cas9.
5. Complexer les ARNg avec la protéine Cas9, adaptée de Kistler et al.²².
   1. Si vous injectez la protéine Cas9 avec l’ARNg ensemble (recommandé), assurez-vous que les concentrations finales de la protéine Cas9 sont de 300 ng/μL et que la concentration finale d’un seul ARNg est de 80 μg/μL. Mélangez la protéine et un ARNg individuel dans un tube PCR de 0,2 mL.
   2. Incuber pendant 20 min sur glace.
6. Tester les ARNg à l’aune d’un test in vitro (p. ex., kit de dépistage de l’ARNng Guide-it).
   1. Amplifiez les fragments autour du site de coupe pour chaque ARNg à l’aide de la PCR.
   2. Exécutez les produits PCR sur un gel pour vous assurer qu’ils ont la bonne taille. Ensuite, purifiez les produits pcr et séquencez-les pour vous assurer qu’ils ciblent la bonne région génétique.
   3. Mélanger 200 ng des restes de produit PCR purifié avec 1 μL de tampon de réaction Cas9, 1 μL de BSA, 1,5 μL de Cas9:gRNA complexé et porter le volume total de réaction à 15 μL. Incuber pendant 5 min à 37°C.
   4. Exécutez à nouveau le produit sur un gel. Si la protéine Cas9 réussit à couper le produit PCR, la bande primaire devrait sembler plus faible et des bandes plus petites supplémentaires devraient être présentes. Notez la réduction de la taille du produit PCR d’origine et, si vous le souhaitez, calculez la réduction de l’intensité de la bande pour approximer l’efficacité de coupe.
7. Préparation du mélange d’injection final
   1. Pour chaque ARNg qui a réussi à couper son produit pcR ciblé, mélanger les volumes de chaque Cas9 et de chaque ARNg dans un tube de 0,5 mL de sorte que le volume final reste 300 ng/μL de protéine Cas9 et 80 ng/μL de chaque ARNg.
   2. Conservez le Cas9 complexé et les ARNg à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient nécessaires à l’injection.

2. Tirer et biseautage des aiguilles

REMARQUE: Les injections réussies et la survie des embryons nécessitent des aiguilles pointues (Figure 1).

1. Utilisez des microcapillaires en borosilicate ou en verre de quartz de 1 mm de diamètre extérieur. Siliconiser les microcapillaires dans une hotte chimique avant d’être tirés.
   1. En bref, placez 3 mL de Sigmacote dans un bécher en verre et aspirez sous vide dans un deuxième bécher contenant les microcapillaires en verre pendant au moins 4 h, ce qui permet à la solution de silicium de se vaporiser et de se déposer sur toutes les surfaces des microcapillaires.
   2. Ensuite, laissez lentement la chambre à vide s’égaliser à la pression ambiante en ouvrant progressivement la vanne du robinet d’arrêt et en permettant à l’air de revenir dans la chambre. Les aiguilles sont alors prêtes à être tirées.
   3. Lisez toujours le manuel d’instructions des arracheurs d’aiguilles avant utilisation.
      REMARQUE: Les instructions ci-dessous détaillent comment utiliser un arracheur d’aiguilles laser P-2000 pour tirer des aiguilles en verre. Il est important de noter que tous les arracheurs d’aiguilles, même de la même marque, ne sont pas calibrés pour tirer exactement la même aiguille sur différentes unités. La clé pour obtenir de bonnes aiguilles est de commencer à un ensemble donné de paramètres, puis de tirer les aiguilles en utilisant des paramètres supérieurs et inférieurs à ces valeurs. Testez les aiguilles à chacun de ces paramètres en évaluant dans quelle mesure l’aiguille perce les embryons et dans quelle mesure le mélange d’injection s’écoule de l’aiguille. Affinez les paramètres jusqu’à l’obtention d’une aiguille facile à ouvrir ou à biseautée, qui perce les embryons en douceur et qui délivre facilement le mélange d’injection.
2. Tirer des aiguilles à l’aide de l’arracheur d’aiguilles laser P-2000
   1. Allumez l’arracheur d’aiguilles laser et laissez le laser se réchauffer pendant 15 minutes avant la première traction.
   2. Programmez la machine pour le type de tube microcapillaire en verre (Rappelez-vous que les paramètres de l’arracheur d’aiguilles sont un point de départ puisque les arracheurs d’aiguilles ne sont pas étalonnés pour produire la même aiguille sur tous les arracheurs):
      Quartz: Chaleur = 730; Fil = 4; Vel = 40; Del = 122; Pul = 156
   3. Après avoir programmé l’arracheur d’aiguilles, chargez un microcapillaire et serrez-le en place, en prenant soin de ne toucher que l’extrémité du tube microcapillaire et non la zone qui sera chauffée par le laser.
   4. Après avoir serré le microcapillaire, placez le pouce et l’index sur les barres de doigts, puis relâchez les barres de traction en appuyant sur les libérations de ressort une à la fois.
   5. Pressez le pouce et l’index pour tirer les barres complètement ensemble.
   6. Placez l’autre côté du tube microcapillaire dans sa pince de telle sorte qu’une petite partie du tube s’étend des deux côtés. Serrez les pinces en vous assurant que les deux pinces sont serrées aux doigts et qu’elles maintiennent les « barres de traction » fermement en place.
   7. Fermez le carénage de protection sur le tire-tout.
   8. Appuyez sur le bouton Pull et le laser commencera à chauffer le verre, indiqué par la lumière rouge « laser on » située sous le carénage. La traction est terminée lorsque les barres de traction sont complètement séparées, accompagnées d’un bruit métallique.
   9. Assurez-vous que la lumière « laser allumée » n’est pas allumée avant de soulever le carénage.
   10. Tenez la petite extrémité du tube microcapillaire qui s’étend au-delà de la pince avec le pouce et l’index et desserrez la pince. Ensuite, soulevez le tube microcapillaire hors de la pince.
   11. Utilisez des pinces pour placer soigneusement le tube microcapillaire dans une boîte de Petri carrée recouverte de ruban adhésif double face. Assurez-vous, lorsque vous placez l’aiguille dans la boîte de maintien, que l’extrémité arrière de l’aiguille touche en premier et que l’aiguille est doucement abaissée en place afin que la pointe pointue ne soit pas endommagée.
3. Tirer des aiguilles à l’aide d’un arracheur d’aiguilles PC-10/PC-100
   1. Configurez l’arracheur PC-10 à l’aide de 4 poids et réglez la température à 50,4 °C pour une traction en une seule étape.
   2. Placez un microcapillaire en verre borosilicate dans la pince supérieure. Ensuite, soulevez la pince inférieure lestée en position et serrez la partie inférieure du microcapillaire, en vous assurant que le capillaire est en position de tirer deux bonnes aiguilles. C’est un cycle de traction assez long, mais il produit de bonnes aiguilles pour le biseautage.
4. Aiguilles biseautantes.
   REMARQUE: Cette méthode de biseautage humide donne un retour en temps réel sur la taille d’ouverture relative de l’aiguille.
   1. Assemblez la plaque abrasive et l’anneau de retenue du biseau à aiguilles. Assurez-vous que le côté gris de la plaque abrasive est orienté vers le haut entre la bague de retenue supérieure et inférieure. Serrez les vis sur la bague de retenue, en alternant d’une vis à l’autre pour vous assurer que chaque vis est serrée uniformément. La plaque abrasive et les anneaux de retenue seront ci-après dénommés l’ensemble de meulage.
   2. Placez 13 gouttes (~ 520 μL) d’huile sur pied sur la surface plane optique, puis placez l’ensemble de meulage sur le dessus de la plaque. Placez l’assemblage sous un microscope à dissection, puis allumez le biseau. Un peu d’huile supplémentaire par rapport à la recommandation de Sutter est utilisée, car cela permet à la plaque abrasive de tourner plus longtemps lorsqu’elle est utilisée conjointement avec cette méthode de biseautage humide.
   3. Ajouter 1% de solution Photo-Flo à la surface de meulage et déplacer la mèche en position afin qu’elle soit immergée dans la solution Photo-Flo.
   4. Allumez l’air à la source principale. Placez ensuite une aiguille de borosilicate tirée dans le support et serrez l’anneau de retenue. Allumez l’air au niveau du régulateur et augmentez jusqu’à ce que la pression ait atteint 26 PSI.
   5. En regardant de côté, abaissez l’aiguille à l’aide du bouton de réglage grossier jusqu’à ce qu’elle touche presque la surface liquide Photo-Flo.
   6. Ajustez le microscope pour localiser l’aiguille dans le champ de vision. Commencez au grossissement le plus bas et augmentez le grossissement. Ajustez soigneusement la position de l’aiguille à l’aide du bouton de réglage grossier jusqu’à ce qu’elle touche simplement la surface du liquide Photo-Flo.
   7. À l’aide du bouton de réglage grossier et en continuant à regarder sous le microscope, abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle soit proche de la surface abrasive mais sans la toucher.
   8. À l’aide du bouton de réglage fin, abaissez soigneusement et lentement l’aiguille, en portant une attention particulière à l’aiguille et à l’ombre qu’elle laisse sur la surface abrasive du biseau. Lorsque l’aiguille et son ombre semblent sur le point de toucher la surface abrasive, continuez à abaisser l’aiguille encore plus lentement et soigneusement.
   9. Alternez entre laisser l’aiguille « biseau » en l’abaissant sur la surface abrasive, puis en la soulevant. Avant de soulever l’aiguille, notez rapidement le réglage sur le micromètre du bouton de réglage fin afin que l’aiguille puisse être abaissée à la même position ou, si nécessaire, à une position légèrement inférieure. N’oubliez pas de garder l’aiguille sous la couche de liquide Photo-Flo. Une fois que l’aiguille a été soulevée au-dessus de la surface abrasive, arrêtez et redémarrez rapidement la rotation du biseau pour vérifier la recherche de bulles. Si l’aiguille a été correctement biseautée, des bulles d’air doivent s’écouler de l’aiguille et dans le Photo-Flo. Si la plaque n’est pas arrêtée, les bulles ne deviendront probablement pas visibles jusqu’à ce que l’ouverture de l’aiguille soit trop grande.
   10. Si aucune bulle n’apparaît lorsque l’aiguille est soulevée au-dessus de la surface abrasive et que le biseau s’est arrêté, répétez la procédure de biseautage, en abaissant l’aiguille à une position légèrement inférieure sur le micromètre situé sur le bouton de réglage fin, en soulevant l’aiguille, en arrêtant la plaque de biseau et en vérifiant la présence de bulles d’air. Répétez l’opération jusqu’à ce qu’un flux de bulles petit mais régulier apparaisse.
   11. Une fois que des bulles d’air sont présentes, vérifiez la taille relative de l’ouverture en arrêtant la plaque abrasive et en abaissant la pression de l’air, en notant le PSI auquel la formation de bulles s’arrête, car il s’agit d’une indication relative de la taille de l’ouverture des aiguilles biseautées. Plus la pression à laquelle l’air cesse de s’échapper de la pointe de l’aiguille est faible, plus l’ouverture de l’aiguille est grande. Les aiguilles biseautées au point où les bulles cessent de s’échapper de l’aiguille à 18-20 PSI indiquent que l’aiguille a une ouverture relativement petite et devrait causer un minimum de dommages à un embryon lorsqu’elle est utilisée pour des micro-injections.
   12. Après avoir vérifié l’ouverture de l’aiguille, augmentez la pression de l’air à 26 PSI pour empêcher le liquide de pénétrer dans l’aiguille. Soulevez ensuite l’aiguille vers le haut et hors de la couche Photo-Flo à l’aide du bouton de réglage grossier. Il est important de noter que tant que l’air sort de l’aiguille, le Photo-Flo ne pénètre pas dans l’aiguille et que, par conséquent, l’intérieur de l’aiguille est protégé de la contamination.
   13. Une fois que l’aiguille est sortie du Photo-Flo, éteignez l’air et retirez l’aiguille du porte-aiguille.
   14. À l’aide de pinces, placez l’aiguille nouvellement biseautée dans une boîte de Petri qui contient du ruban adhésif double face ou de la pâte à modeler pour la maintenir en place. Répétez le processus jusqu’à ce que 10 à 20 aiguilles biseautées aient été produites.

3. Nourrir par le sang la génération parentale de moustiques

1. Larves arrière de moustiques Cx. pipiens dans des conditions de longue journée sans ambiguïté (>13 h de lumière/jour) à 25-27 °C pour s’assurer que les moustiques n’entrent pas dans leur dormance hivernale ou leur diapause.
2. Sept à dix jours après le pic d’émergence adulte, préparez le système d’alimentation à membrane Hemotek en branchant les unités de chauffage à l’alimentation électrique. Réglez la température de chaque unité à 37 °C (température interne du corps humain) ou à 41 °C (température interne du corps du poulet) à l’aide de la vis de réglage sur le dessus de l’appareil. Assurez-vous que la température correcte a été atteinte à l’aide d’un thermomètre électrique.
3. Préparez le réservoir de farine de sang pour l’alimentation.
   1. Coupez un carré de parafilm pour chaque cylindre d’alimentation en sang et frottez le parafilm contre les pieds nus. Cela fournit des parfums attrayants pour les moustiques.
   2. Étirez le parafilm aussi finement que possible et enroulez fermement les bords autour du réservoir de repas. Si vous le souhaitez, fixez-le en place avec un joint torique en caoutchouc.
   3. Ajouter environ 200 μL de solution d’ATP de 0,1 M à 15 mL de sang de poulet entier frais ou décongelé traité au citrate de sodium. L’ATP aide à stimuler l’alimentation sanguine et le citrate de sodium empêche le sang de coaguler.
   4. Tenez le réservoir de manière à ce que le côté parafilm soit orienté vers le bas et utilisez soigneusement une pipette jetable pour remplir le réservoir. Chaque réservoir contient environ 3 mL de sang. Scellez les orifices de remplissage avec des bouchons en plastique.
   5. Vissez les réservoirs de repas dans les unités de chauffage et placez-les sur le dessus de la cage à moustiques de manière à ce que le côté parafilm soit tourné vers le bas et que les moustiques puissent se nourrir à travers le maillage.
4. Couvrez les cages avec des sacs poubelles noirs pour simuler le crépuscule et soufflez vigoureusement dans chaque cage car l’augmentation de la concentration de CO₂ stimule l’alimentation sanguine.
5. Gardez la mangeoire sur la cage pendant 2 à 8 h pour maximiser l’alimentation en sang. Vérifiez périodiquement et notez la proportion de femelles qui ont pris un repas de sang (évidente par leur abdomen rouge et distendu).

4. Induire la ponte chez les moustiques adultes

1. Quatre à cinq jours après l’alimentation sanguine, préparez une sonde conique de 50 mL pour la ponte des moustiques.
   1. Créez un trou d’environ 20 mm près du fond du tube conique.
   2. Couvrez le trou avec deux carrés (35 mm²⁾de caoutchouc de barrage dentaire, l’un avec une fente horizontale et l’autre avec une fente verticale. Utilisez du ruban adhésif pour fixer les carrés de la digue dentaire au tube conique.
   3. Placez un morceau de papier filtre de 4,25 cm sur une boîte de Petri de 35 mm x 10 mm et mouillez le papier filtre avec 750 μL d’eau distillée.
   4. Inversez le tube conique sur le papier filtre et tournez d’avant en arrière plusieurs fois pour vous assurer qu’il est sécurisé.
2. Utilisez un aspirateur buccal pour retirer soigneusement ~ 10 femelles de Cx. pipiens de leur cage et les transférer dans le tube conique préparé.
3. Placez un cylindre opaque sur le tube conique pour fournir de l’obscurité aux moustiques car cela stimule la ponte, et attendez 20-25 minutes.

5. Micro-manipulation des œufs Culex fraîchement pondus

1. Préparez la lame pour attacher les embryons de moustiques pour la micro-injection.
   1. Fixez un morceau de ruban adhésif double face à la largeur d’un verre de couverture.
   2. Fixez une fine bande de pansement médical transparent (p. ex., Tegaderm, de 2 à 3 mm de large) au ruban adhésif double face de sorte qu’il soit parallèle à l’extrémité courte du verre de couverture et positionné à environ 5 mm de l’extrémité du verre de couverture.
   3. Retirez l’excès de ruban adhésif double face à l’aide d’une lame de rasoir tranchante et retirez 2 à 3 mm de pansement médical et de ruban adhésif double face de chaque extrémité du verre de couverture. Cela permet à une couche d’huile de rester sur la glissière après que les œufs ont été montés sur le verre de couverture.
   4. À l’aide d’un crayon de cire, dessinez une forme en « D » autour du ruban adhésif double face et de la bande de pansement médical. Cela agira comme une barrière pour retenir l’eau autour des œufs après l’injection.
2. Une fois que la lame a été préparée et que 20 à 25 minutes se sont écoulées, retirez le tube opaque et déterminez si les moustiques ont pondu ou non des œufs.
   1. Sinon, couvrez-les pendant encore 5 à 10 minutes.
   2. Si les moustiques ont pondu des œufs, soulevez soigneusement mais rapidement le tube conique et couvrez-le d’un capuchon. Placez les moustiques dans une cage séparée et notez l’heure à laquelle les œufs ont été collectés sur une feuille de calcul. Ajoutez ensuite 50 à 100 μL d’eau DI au papier filtre contenant les radeaux d’œufs.
3. Sous un microscope à dissection, alignez les œufs.
   1. Placez un morceau de papier filtre (rectangles de 10 mm x 30 mm découpés dans du papier filtre grossier avec un débit rapide) sous un verre de couverture de 24 mm x 40 mm de sorte que le verre de couverture couvre 50 à 60% du côté gauche du papier filtre.
   2. Mouiller le papier filtre avec 50 μL d’eau DI. L’eau se répandra lentement sous le verre de couverture, créant un réservoir pour garder le papier filtre et les œufs humides pendant la micromanipulation. Un ménisque se forme entre le verre de couverture et le papier filtre lorsque la bonne quantité d’eau est appliquée.
   3. Séparez les œufs de leurs radeaux d’œufs à l’aide d’un pinceau fin et positionnez-les de manière à ce que l’extrémité étroite postérieure de l’embryon touche le verre de couverture (à gauche) et que l’extrémité antérieure plus large soit à droite.
   4. Alignez les œufs pendant 20 minutes, en observant attentivement le changement de leur couleur d’un blanc laiteux à un gris très clair. Inspectez régulièrement le film d’eau sous le verre de couverture pour vous assurer qu’il y a une quantité adéquate d’eau. Si les œufs semblent se dessécher, ajoutez une petite quantité d’eau DI (20-30 μL) au papier filtre.
   5. Après 20 min, jeter tous les œufs restants.
4. Transférer les œufs sur la lame de micro-injection.
   1. Utilisez un petit morceau (10 mm x 30 mm) de papier filtre grossier pour évacuer l’eau du côté du papier filtre saturé et retirez le papier filtre à mèche à l’avec une pince. Répétez 2-3 fois pour vous assurer que le papier filtre avec les œufs est aussi sec que possible.
   2. Posez un rectangle frais et sec de papier filtre et maintenez-le en place avec une pince. Retirez soigneusement le verre de couverture vers la gauche, loin des œufs alignés.
   3. Séchez l’excès d’eau sur la scène sans déranger le petit papier filtre qui contient les œufs alignés. Continuez à sécher le papier filtre humide avec les œufs plusieurs fois de plus, en appuyant sur les petits rectangles de papier filtre avec des pouces et / ou des pinces, pour vous assurer que les œufs sont aussi secs que possible avant de les transférer sur la lame d’injection.
   4. À l’aide d’une pince, retirez le papier qui s’appuie sur la bande de pansement médical de la glissière de montage.
   5. Tenez la glissière de montage avec un pouce et un majeur et le pansement médical exposé vers le bas, et abaissez-la à un angle de 45° sur la ligne d’œufs alignés. Positionnez la glissière de manière à ce que l’extrémité antérieure plus large des œufs (à gauche) soit légèrement suspendue à l’extrémité du pansement médical, car cela améliore la capacité des larves de Culex à éclore avec succès des œufs montés.
   6. Appuyez l’index sur la face inférieure du verre de couverture, tout en continuant à tenir le verre de couverture entre le pouce et le majeur, pour vous assurer que tous les œufs alignés sont fermement attachés au pansement médical.
   7. Inversez immédiatement le verre de couverture pour que les œufs soient tournés vers le haut et appliquez une fine couche d’huile d’halocarbure (2-3 gouttes; ~ 20 μL) sur les œufs. Cela empêche les œufs de se desséquer pendant la microinjection. Retirez tous les œufs qui ne sont pas attachés au pansement médical ou qui ne sont pas recouverts par l’huile.
   8. Placez le couvercle en verre avec les œufs montés face vers le haut à l’intérieur d’une boîte de Petri carrée avec un grand carré de papier filtre humide pour le transport pour la microinjection.

6. Injection d’embryons Culex

1. Re-remplissage des aiguilles d’injection avec le mélange d’injection
   1. Choisissez une embout de remplissage d’aiguille ou de gel qui s’insérera facilement dans l’extrémité arrière de l’aiguille d’injection sélectionnée et aura un peu d’espace entre l’extrémité de la charge d’aiguille et l’aiguille d’injection.
   2. Placez soigneusement une seule et petite goutte de mélange d’injection (~ 0,5-1 μL) dans l’aiguille d’injection, en utilisant le remplisseur d’aiguille pour remplir l’aiguille. Placez la goutte du mélange d’injection près de l’endroit où l’aiguille d’injection commence à se rétrécir.
2. Fixez l’aiguille d’injection au micro-injecteur.
3. Placez la lame contenant les embryons sur la scène du microscope.
4. Ouverture de l’aiguille
   REMARQUE: Si vous utilisez des aiguilles biseautées, cela n’est pas nécessaire.
   1. Utilisez une pression d’injection de départ d’environ 30 PSI et ajustez-la si nécessaire pour fournir un volume approprié de mélange d’injection.
   2. Sous un microscope à dissection, placez l’aiguille au-dessus de l’embryon et utilisez soigneusement le micromanipulateur pour abaisser l’aiguille sur l’embryon. Une fois que l’aiguille touche à peine l’embryon, déplacez rapidement l’embryon perpendiculairement au long axe de l’aiguille.
   3. Pour déterminer si l’aiguille a été ouverte avec succès, appuyez sur le déclencheur d’injection et voyez si des bulles / mélange d’injection s’échappent de l’aiguille. Sinon, répétez le déplacement de l’embryon contre l’aiguille jusqu’à ce que l’aiguille soit ouverte et que le mélange d’injection s’échappe lorsque la gâchette est enfoncée.
5. Injection des embryons
   1. Placez le premier embryon en ligne au centre de la vue dans le microscope et assurez-vous qu’il est au point.
   2. Placez l’aiguille sur le premier œuf, également au centre du champ de vision du microscope.
   3. Augmentez progressivement le grossissement sur le microscope, en abaissant soigneusement l’aiguille pour la maintenir juste au-dessus du premier embryon, centrée et mise au point. Continuez jusqu’à ce que le microscope ait atteint son grossissement le plus élevé et que l’embryon et l’aiguille soient au point.
   4. Déplacez soigneusement l’embryon sur la scène légèrement vers la gauche et abaissez légèrement l’aiguille de sorte que l’aiguille et l’embryon soient maintenant dans le même plan de vue.
   5. En utilisant l’étape du microscope pour déplacer l’embryon, touchez soigneusement et doucement l’embryon jusqu’à la pointe de l’aiguille. L’extrémité étroite et postérieure de l’embryon doit légèrement dévier. Ajustez la hauteur de l’aiguille si elle est trop haute ou trop basse.
   6. À l’aide de l’étape du microscope, déplacez l’extrémité postérieure de l’embryon sur l’aiguille et observez l’aiguille pénétrer dans le chorion de l’œuf de moustique. L’aiguille doit simplement pénétrer dans la membrane à l’emplacement approximatif des cellules polaires dans les embryons Culex. Une fois que cela se produit, tirez sur la gâchette d’injection 1 à 3 fois pour injecter le mélange dans l’embryon. Délivrez une petite quantité de mélange d’injection, juste assez pour qu’une petite clairière dans l’embryoplasme puisse être détectée.
   7. En utilisant la scène, déplacez l’embryon vers la droite, loin et hors de la pointe de l’aiguille. Si l’injection s’est bien passée, peu ou pas de liquide devrait s’échapper de l’embryon.
   8. Déplacez la scène vers le bas afin que l’embryon suivant dans la ligne soit positionné devant l’aiguille. Ensuite, déplacez la scène vers la gauche, en positionnant l’embryon sur l’aiguille d’injection et appuyez sur la gâchette d’injection.
   9. Si le mélange d’injection ne semble pas sortir et/ou si une grande quantité de liquide s’échappe de l’embryon après le retrait de l’aiguille, remplacez l’aiguille d’injection et recommencez.
   10. Détruisez tous les œufs non injectés ou endommagés.
6. S’occuper des embryons après l’injection
   1. Une fois que tous les embryons sur la lame ont été injectés, lavez l’huile d’halocarbure en appliquant de l’eau d’osmose inverse avec un flacon de gicleur, de sorte que le flux d’eau soit dirigé sur le dessus de la plaque de couverture en verre au-dessus des embryons injectés et en permettant à l’eau de s’écouler le long de la lame de couverture et sur les embryons pour rincer l’huile. Assurez-vous de ne pas diriger le flux d’eau directement sur les embryons, car cela pourrait les endommager ou les détacher du pansement médical. Ce processus élimine la plupart, mais pas la totalité, de l’huile d’halocarbure.
   2. Couvrez la lame avec 150 μL d’eau DI.
   3. Placez la lame avec les embryons injectés sur du papier filtre humide à l’intérieur d’une boîte de Pétri carrée.
   4. Placer la boîte de Petri contenant les embryons injectés dans une chambre environnementale réglée sur 25-27 °C, 70-80% HR avec une longue photopériode d’une journée (>13 h de lumière/jour).

7. Élevage d’embryons injectés (F₀₎à l’âge adulte et mise en place de croisements

1. Examinez quotidiennement les lames des embryons injectés, en vous attendant à ce que 1^ère larve d’instar émerge 1,5 jour après l’injection.
2. Comptez le nombre de larves de 1^ère et placez 100 à 200 larves dans un récipient Tupperware de la taille d’une boîte à chaussures avec 450 ml d’eau DI et 50 mg de nourriture pour poissons moulus. À ce stade, créez 1 à 5 fois plus de récipients contenant des larves de type sauvage ou non injectées qui seront utilisées pour croiser les moustiques injectés.
3. Nourrissez les larves quotidiennement, en augmentant légèrement la quantité de nourriture qu’elles reçoivent chaque jour jusqu’à atteindre 300-500 mg le^6ème jour de la vie larvaire.
4. Une fois que les nymphes apparaissent, utilisez une pipette de transfert pour placer une nymphe dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL remplis à 50-75% d’eau DI. Répétez l’opération pour toutes les nymphes, à la fois les nymphes qui ont été injectées sous forme d’embryons ainsi que les nymphes de type sauvage non injectées. Appuyez soigneusement sur les couvercles pour qu’ils soient légèrement entrouverts, empêchant les moustiques de s’échapper tout en permettant une petite quantité d’échange de gaz.
5. Une fois que les moustiques adultes émergent à l’intérieur de leurs tubes de microcentrifugation, relâchez les moustiques femelles injectées dans une cage contenant des moustiques mâles vierges de type sauvage, atteignant un ratio d’au moins 1 mâle de type sauvage pour chaque femelle injectée. De même, relâchez des moustiques mâles injectés dans une cage contenant des femelles vierges de type sauvage, ce qui permet d’obtenir un ratio d’environ 5 à 10 femelles vierges de type sauvage pour chaque mâle injecté. Un ratio plus élevé de femelles de type sauvage par rapport aux mâles injectés est recommandé car chaque moustique mâle peut s’accoupler plusieurs fois. Par conséquent, le fait d’avoir un plus grand nombre de femelles de type sauvage qui s’accouplent avec des mâles injectés augmente le nombre de progénitures F1 qui peuvent être produites.

8. Obtenir et élever des moustiques F₁ et les dépister pour les mutations

1. Sept à dix jours après l’émergence de l’âge adulte, offrez un repas de sang aux femelles dans chaque cage comme décrit ci-dessus (étape 3).
2. Quatre jours après l’alimentation sanguine, placez l’eau de ponte dans chaque cage. Chaque radeau d’œufs représente la progéniture d’un seul moustique femelle et doit donc être placé dans son propre récipient d’élevage en plastique de la taille d’une boîte à chaussures peu de temps après la ponte. Étiquetez chaque récipient avec un identificateur unique et indiquez également que les larves appartiennent à la génération F₁ pour le gène d’intérêt, si le parent mâle ou femelle a été injecté, la date à laquelle la casserole a été établie, les conditions d’élevage et les initiales de l’expérimentateur.
3. Surveillez quotidiennement les casseroles de larves. Dès que les larves éclosent dans les casseroles, fournissez 50 mg de nourriture pour poissons moulus. Augmentez la nourriture quotidiennement pendant 6 jours comme décrit ci-dessus (étape 7.3).
4. Transférer les nymphes individuelles dans des tubes de microcentrifugation de 2 mL contenant entre 1 et 1,5 mL d’eau DI, étiqueter chaque tube et fissurer les couvercles.
5. Une fois que les moustiques adultes émergent, ouvrez soigneusement le tube de microcentrifugation de 2 mL, recouvert d’un index, et à l’aide de l’autre main, placez un flacon en verre de 3 dram sur le dessus du tube de microcentrifugation. L’instinct naturel du moustique devrait être de voler vers le haut et dans le flacon en verre. Une fois que cela se produit, faites glisser un doigt sur l’ouverture du flacon en verre et inversez-le rapidement, en plaçant une petite boule de coton légèrement mouillée avec une solution de saccharose à 10% dans le haut du flacon. Cela empêche le moustique de s’échapper et fournit une source de nourriture et d’eau nécessaire.
6. Étiquetez à la fois le tube contenant l’exuvie nymphale et le flacon en verre contenant le moustique adulte pour indiquer la casserole larvaire d’où il provient, le sexe du moustique et l’identificateur unique de cet individu. Ex : II.C.M32, où « II » indique que le parent mâle a été injecté, « C » représente la casserole/le radeau d’œufs d’où provient l’individu, et « M32 » désigne que c’était le 32^e mâle à émerger de ce récipient d’élevage larvaire.
7. Replacez les moustiques adultes dans leurs flacons de verre individuels dans la chambre environnementale et ajoutez quotidiennement une petite quantité (~ 20 μL) de solution de saccharose à 10% à leur coton. Assurez-vous de ne pas suralimenter ou saturer le coton car les moustiques se coinceront dans la solution de saccharose et mourront.
8. Dépistage de la mutation souhaitée chez les moustiques
   1. Extraire l’ADN génomique de 5 à 10 exuvions nymphales de chaque radeau d’œufs / casserole de larves à l’aide du kit de PCR Phire Direct selon les instructions du fabricant, ainsi que de 1 à 2 individus de type sauvage qui serviront de contrôle.
      REMARQUE: Comme la progéniture de chaque radeau est probablement des frères et sœurs à part entière, le dépistage de 5 à 10 larves de chaque casserole déterminera si la mutation a été transmise à la progéniture. Si aucune des larves dépistées d’une casserole n’a la mutation souhaitée, ne dépister pas d’autres adultes. Si certaines des larves ont la mutation, alors chaque individu de cette casserole doit être examiné.
   2. À l’aide des amorces PCR conçues précédemment (étape 1.2), amplifiez le fragment autour de l’emplacement prédit de votre mutation à l’aide du kit de PCR Phire dans la progéniture de type sauvage et F1 et exécutez des fragments de PCR sur un gel d’agarose à 3-4% pour déterminer s’il y a des insertions ou des délétions visibles (indels).
      REMARQUE: Tous les individus qui ont la mutation souhaitée seront hétérozygotes et devraient afficher 2 bandes, un type sauvage et un légèrement plus court ou plus long à la position souhaitée. Pour les distinguer, comparez la position et l’épaisseur des bandes des individus de type sauvage avec celles des bandes de la descendance F1. Idéalement, 2 bandes discrètes seront visibles, mais si l’indel est très petit, la bande peut sembler plus large et / ou plus floue.
   3. Purifier le produit PCR soit en excisant la bande contenant les indels suspectés (recommandé), soit en purifiant le produit PCR restant qui n’a pas été chargé dans le gel. Soumettre la PCR purifiée pour le séquençage afin de déterminer si la mutation souhaitée est présente.

9. Obtention et élevage des moustiques F₂ et F₃ et dépistage des mutations

1. Relâchez tous les moustiques adultes F₁ pour lesquels la mutation souhaitée a été trouvée en criblant ses exuvies nymphales de leurs flacons de verre individuels et dans une cage contenant des moustiques de type sauvage non injectés du sexe opposé. Le rétrocroisement pour cette deuxième génération devrait éliminer tous les effets délétères de l’injection et de la consanguinité.
2. Le sang nourrit les cages des moustiques mutants F₁ et de leurs homologues de type sauvage comme décrit précédemment. Quatre à cinq jours plus tard, collectez les radeaux d’œufs F₂ résultants.
3. Étiquetez et élevez les larves F₂ comme décrit ci-dessus, en plaçant chaque radeau d’œufs dans un récipient étiqueté séparé. Lors de la nymphope, séparez à nouveau les nymphes individuelles dans des tubes de microcentrifugation individuels de 2 mL et transférez chaque adulte dans des flacons en verre séparés coiffés de coton imbibé de saccharose à l’émergence. Ensuite, dépistez les exuvions nymphales de chaque individu F₂ la mutation souhaitée comme décrit précédemment (étapes 8.5-8.8).
   REMARQUE: Ici, tous les individus qui ont la mutation souhaitée seront hétérozygotes, et donc le produit PCR devrait idéalement produire 2 bandes distinctes lorsqu’il est exécuté sur un gel d’agarose à 3-4%.
4. Une fois que les larves mutantes F₂ ont été identifiées, placez tous les mâles et femelles porteurs de la mutation dans la même cage pour qu’ils s’accouplent. Alimentation sanguine 7-10 jours après l’émergence adulte, et 4-5 jours plus tard, recueillir les radeaux d’œufs F_3.
5. Placez_chaque radeau d’œufs F 3 dans un récipient d’élevage larvaire séparé, et étiquetez et nourrissez comme décrit ci-dessus.
6. Séparez les nymphes F₃ en tubes de microcentrifugation individuels de 2 mL. Une fois que les adultes émergent, transférez-les dans des flacons en verre individuels recouverts de coton imbibé à 10% de saccharose. Dépister les exuvies nymphales comme décrit précédemment. Cette fois, environ 25% de la progéniture dans chaque casserole devrait être homozygote pour la mutation nulle. Placez ces individus dans une seule cage et utilisez-les pour créer et maintenir la lignée mutante de moustiques nouvellement générée.
   REMARQUE: Si un faible nombre de moustiques homozygotes sont présents, les mâles et les femelles hétérozygotes F₃ peuvent être croisés les uns avec les autres pour générer des moustiques homozygotes-nuls supplémentaires dans la génération F_4.

En utilisant le protocole décrit, nous avons pu injecter avec succès des embryons de Cx. pipiens, et observé un taux de survie élevé parmi les embryons injectés (~55%, Figure 1). Les essais antérieurs avaient un pourcentage de survie plus faible, probablement parce que l’antérieur du follicule de l’œuf était attaché à la bande de pansement médical, empêchant les larves de moustiques de s’échapper du chorion et de nager avec succès dans l’eau. S’assurer que l’extrémité antérieure s’étend au-delà de la bande de pansement médical a considérablement augmenté la survie larvaire et donne une progéniture de haute qualité capable de se développer à l’âge adulte et de se reproduire (Figure 2B).

Les expériences ultérieures et le dépistage indiquent que la mutation nulle pour le cycle du gène de l’horloge circadienne (cyc; KM355981) est entré dans la lignée germinale des embryons injectés (Figure 3). Étant donné que nos amorces ont amplifié une grande partie du gène cyc près des sites de coupe, il était difficile d’observer deux bandes distinctes chez les moustiques hétérozygotes, F1. Cela démontre l’utilité de concevoir des amorces qui amplifieront les fragments qui sont ~ 100-200 bp autour du site de coupe, et aussi l’importance de séquencer tous les moustiques mutants suspectés. Le séquençage a révélé qu’environ 10% des moustiques dépistés présentaient une petite insertion ou délétion près du site de coupe Cas9 du premier ARN guide que nous avions conçu(Figure 3),suggérant qu’il s’agissait d’un ARNg très efficace et que nous avons ciblé avec succès les cellules polaires lors de microinjections. Les individus F1 se sont accouplés avec succès et ont produit une progéniture viable (génération F2), dont certains contenaient également la mutation.

Figure 1 : Exemple d’aiguille en borosilicate biseautée. Cette aiguille a été fabriquée à partir d’un tube microcapillaire en borosilicate siliconé, tirée à l’aide d’un arracheur d’aiguille vertical PC-10, puis biseautée sur un beveller BV-10. L’aiguille est visualée sous un grossissement d’environ 63x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Survie de la génération F0 tout au long de son développement. (A) Image de 1er larve d’instar qui a éclos à partir de 3 lames contenant des embryons injectés. (B) Représentation graphique du nombre d’individus à chaque étape de la vie. Sur les 801 embryons qui ont été injectés, 441 larves du1er stade ont éclos, et de ces 149 individus ont atteint la nymphope, ce qui a donné un total de 121 adultes (73 mâles et 43 femelles). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats représentatifs montrant la transmission de la mutation souhaitée. Les deux premières séquences représentent la séquence du gène du cycle dans Culex quinquefascaitus (Cx.quinq; XP_001865023.1) et chez les femelles de type sauvage de Cx. pipiens (WT. F; KM355981). Les séquences ci-dessous représentent des séquences chez trois descendants mâles F1 (I.DM1; II.JM4; II.K10M). La boîte verte représente la séquence PAM reconnue par la protéine Cas9 (CGG) tandis que la flèche verte représente l’endroit où la protéine Cas9 a clivé l’ADN génomique. Ces résultats montrent que de courtes délétions de 2 ou 4 nucléotides ont été héritées chez les mâles F1. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

RH travaille pour l’Installation de transformation des insectes, qui fournit des services de modification génétique des insectes.