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Article de méthode

Imagerie au calcium In vivo réussie avec un microscope miniaturisé head-mount dans l’Amygdale de la souris qui se comporte librement

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⸱

DOI :

10.3791/61659

⸱

26 août 2020

 , 
1Department of Biological Sciences, Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST), 2KAIST Institute for BioCentury (KIB), Korea Advanced Institute of Science and Technology (KAIST)

Dans cet article

Résumé

L’imagerie microendoscopique in vivo de calcium est un outil inestimable qui permet la surveillance en temps réel des activités neuronales chez les animaux qui se comportent librement. Cependant, l’application de cette technique à l’amygdale a été difficile. Ce protocole vise à fournir une ligne directrice utile pour cibler avec succès les cellules d’amygdale avec un microscope miniaturisé chez la souris.

Résumé

La surveillance en temps réel in vivo des activités neuronales chez les animaux en mouvement libre est l’une des approches clés pour relier l’activité neuronale au comportement. À cette fin, une technique d’imagerie in vivo qui détecte les transitoires de calcium dans les neurones à l’aide d’indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), d’un microscope à fluorescence miniaturisé et d’une lentille de l’indice réfractif de gradient (GRIN) a été développée et appliquée avec succès à de nombreuses structurescérébrales 1,2,3,4,5,6. Cette technique d’imagerie est particulièrement puissante parce qu’elle permet l’imagerie simultanée chronique des populations cellulaires génétiquement définies pendant une période à long terme jusqu’à plusieurs semaines. Bien qu’utile, cette technique d’imagerie n’a pas été facilement appliquée aux structures cérébrales qui se situent profondément dans le cerveau comme l’amygdale, une structure cérébrale essentielle pour le traitement émotionnel et la mémoire de peur associative7. Il existe plusieurs facteurs qui rendent difficile l’application de la technique d’imagerie à l’amygdale. Par exemple, les artefacts de mouvement se produisent habituellement plus fréquemment pendant l’imagerie menée dans les régions cérébrales plus profondes parce qu’un microscope de tête-montage implanté profondément dans le cerveau est relativement instable. Un autre problème est que le ventricule latéral est positionné près de la lentille GRIN implantée et son mouvement pendant la respiration peut causer des artefacts de mouvement très irréguliers qui ne peuvent pas être facilement corrigés, ce qui rend difficile de former une vue d’imagerie stable. En outre, parce que les cellules dans l’amygdale sont habituellement calmes à un état de repos ou anesthésié, il est difficile de trouver et de concentrer les cellules cibles exprimant GECI dans l’amygdale pendant la procédure de baseplating pour la formation image ultérieure. Ce protocole fournit une ligne directrice utile pour la façon de cibler efficacement les cellules exprimant GECI dans l’amygdale avec le microscope miniaturisé tête-montage pour la formation image in vivo réussie de calcium dans une telle région plus profonde de cerveau. Il est à noter que ce protocole est basé sur un système particulier (par exemple, Inscopix) mais ne s’y limite pas.

Introduction

Le calcium est un deuxième messager omniprésent, jouant un rôle crucial dans presque toutes les fonctions cellulaires8. Dans les neurones, le tir potentiel d’action et l’entrée synaptique provoquent un changement rapide de libre intracellulaire [Ca2+]9,10. Par conséquent, le suivi des transitoires de calcium fournit une occasion de surveiller l’activité neuronale. Les GECI sont des outils puissants qui permettent de surveiller [Ca2+] dans les populations cellulaires définies et les compartiments intracellulaires11,12. Parmi de nombreux types différents d’indicateur de calcium à base de protéines, GCaMP, une sonde Ca2+ basée sur une seule molécule GFP13, est la plus optimisée et donc largement utilisée GECI. Grâce à plusieurs cycles d’ingénierie, un certain nombre de variantes de GCaMP a étédéveloppé 12,14,15,16. Nous utilisons l’un des GCaMPs récemment développés, GCaMP7b, dans ce protocole16. Les capteurs GCaMP ont grandement contribué à l’étude des fonctions du circuit neuronal dans un certain nombre d’organismes modèles tels que l’imagerie des transitoires Ca2+ au cours dudéveloppement 17,l’imagerie in vivo dans une couche corticalespécifique 18,la mesure de la dynamique du circuit dans l’apprentissage destâches motrices 19 et l’imagerie de l’activité de l’ensemble cellulaire liée à la mémoire de peur associative dans l’hippocampe et l’amygdale20,21.

L’imagerie optique des GECI présente plusieurs avantages22. L’encodage génétique permet d’exprimer de façon durable les IGE pendant une longue période dans un sous-ensemble spécifique de cellules définies par le profil génétique ou des modèles spécifiques de connectivité anatomique. L’imagerie optique permet une surveillance simultanée chronique in vivo de centaines à des milliers de neurones chez les animaux vivants. Quelques systèmes optiques d’imagerie ont été développés pour l’imagerie in vivo et l’analyse des GECI dans le cerveau des souris se comportant librement avec des microscopes miniaturisés de fluorescence detête-montage 21,23,24,25. En dépit de la technique d’imagerie optique in vivo basée sur les GECI, lentille GRIN, et un microscope miniature tête-montage étant un outil puissant pour étudier le lien entre l’activité et le comportement du circuit neuronal, l’application de cette technologie à l’amygdale a été difficile en raison de plusieurs problèmes techniques liés au ciblage de la lentille GRIN aux cellules exprimant gecis dans l’amygdale sans causer d’artefacts de mouvement qui réduisent gravement la qualité de l’acquisition d’images et de trouver des cellules exprimant GECI. Ce protocole vise à fournir une ligne directrice utile pour les procédures chirurgicales de fixation de plaque de base et l’implantation de lentilles GRIN qui sont des étapes critiques pour la formation image optique réussie du calcium in vivo dans l’amygdale. Bien que ce protocole cible l’amygdale, la plupart des procédures décrites ici sont généralement applicables à d’autres régions cérébrales plus profondes. Bien que ce protocole soit basé sur un système particulier (par exemple, Inscopix), le même objectif peut être facilement atteint avec d’autres systèmes alternatifs.

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Protocole

Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique animale du Korea Advanced Institute of Science and Technology. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux.

REMARQUE : Ce protocole se compose de six étapes majeures : chirurgie d’injection de virus, chirurgie d’implant d’objectif de GRIN, validation de l’implantation de lentille de GRIN, attachement de plaque de base, enregistrement optique du signal de GCaMP pendant un essai de comportement, et traitement de données (figure 1A). À l’exception de la chirurgie, le logiciel commercial (Inscopix) est utilisé.

1. Chirurgie stéréotaxique – Injection de virus AAV

REMARQUE : La souche de souris utilisée dans cette intervention chirurgicale est C57BL6/J. Le corps de l’animal est recouvert d’un drapé stérile pendant la chirurgie et toutes les étapes du protocole sont effectuées avec le port de gants stériles. Les chirurgies multiples ne sont généralement pas effectuées dans la même journée. Cependant, si plusieurs souris doivent avoir la même chirurgie dans la même journée, utilisez un ensemble distinct d’outils chirurgicaux autoclavés pour chaque souris et 70% d’éthanol pour désinfecter les instruments chirurgicaux entre les souris. Pour garder la souris au chaud pendant l’intervention chirurgicale, la souris est recouverte d’une couverture chirurgicale sur mesure après avoir été fixée au cadre stéréotaxique.

  1. Désinfectez tous les outils chirurgicaux nécessaires avec 70 % d’éthanol et préparez une seringue Hamilton et une pipette en verre. Remplir la pipette en verre d’eau distillée.
    REMARQUE : Tous les outils chirurgicaux utilisés dans le protocole sont autoclavés. Étant donné que la lentille GRIN et les vis du crâne ne peuvent pas être autoclavées pour la stérilisation, 70 % d’éthanol est utilisé comme désinfectant pour prévenir l’inflammation. Bien qu’elles ne soient pas essayées, d’autres formes de stérilisation peuvent être utilisées, par exemple le gaz ou la stérilisation chimique.
  2. Anesthésier la souris avec pentobarbital (83 mg◊kg-1 de poids corporel) par injection intraperitoneal. Après que la souris soit inconsciente, rasez la fourrure sur le crâne.
  3. Nettoyez la peau au-dessus du crâne avec 70% d’éthanol et fixez la souris au cadre stéréotaxique. Retirez soigneusement la peau et essuyez la surface du crâne à l’aide d’une solution de peroxyde d’hydrogène à 35 % à l’aide d’un applicateur à pointe de coton. Appliquer l’onguent lubrifiant pour les yeux pour prévenir le séchage cornéen pendant la chirurgie.
    REMARQUE : Bien qu’il n’y ait habituellement aucun problème avec l’utilisation de 70% d’éthanol seulement pour la préparation aseptique de peau, il est recommandé utilisant 3 tours alternatifs de désinfectant par exemple iodophors ou solution de chlorhexidine, et 70% éthanol.  Une concentration plus élevée de peroxyde d’hydrogène est utilisée dans ce protocole pour s’assurer que le tissu conjonctif sur le crâne de la souris est enlevé aussi complètement que possible, ce qui est essentiel pour réduire l’artefact de mouvement lors de l’imagerie ultérieure parce que le tissu conjonctif sur le crâne interfère avec un attachement ferme de la plaque de base au crâne. Il convient de noter que 35% de peroxyde d’hydrogène est beaucoup plus élevé que ce qui est normalement utilisé (3%).
  4. Fixez la goupille avec un support de sonde stéréotaxique. Aligner la hauteur du bregma et du lambda avec la goupille.
  5. Trouvez l’emplacement spécifique sur le crâne de la souris pour la craniotomie.
    REMARQUE : Les coordonnées de l’amygdale latérale (LA) pour l’injection de virus sont (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,5 mm, -4,3 mm) de bregma dans ce protocole (AP; Antérieur-Postérieur, ML; Médial-latéral, DV; Dorsal-Ventral, chaque abréviation indique une distance axiale relative du bregma)26. Les coordonnées doivent être optimisées pour chaque condition expérimentale.
  6. Percer la surface du crâne (Figure 1B). Laver les fractions du crâne avec de la solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirez le reste de la couche à l’aide de forceps ou d’une aiguille de 27 G.
    1. Lors du forage du crâne, essayez de ne pas toucher la dernière couche de dura pour éviter les dommages à la surface du tissu cérébral. Une surface cérébrale endommagée provoque une inflammation autour de la lentille, ce qui induit des artefacts de mouvement sévère et une autofluorescence élevée pendant l’enregistrement. La taille de la craniotomie est de 1,6 mm. La vitesse de perceuse est de 18 000 r/min, et la taille du bit est de 0,6 mm.
  7. Pour abaisser la lentille GRIN de la surface du tissu cérébral du site foré au site cible d’amygdale, calculez la distance nommée « Valeur A » en soustrayant la différence de DV entre la bregma et la surface du cerveau exposée de la coordonnée DV de l’implantation de la lentille, qui est définie en fonction de la brème (4,2 mm dans ce cas, figure 1C).
  8. Chargez 3 μL d’huile minérale et 0,7 μL de la solution de virus AAV dans la pipette en verre.
    REMARQUE : L’huile minérale aide à séparer la solution virale et l’eau. 0,7 μL est un volume optimisé pour l’injection de virus LA qui peut couvrir entièrement le LA.
  9. Retirez la goupille du porte-sonde stéréotaxique et fixez-lui la pipette en verre.
  10. Localisez la pipette en verre au site d’injection mentionné à l’étape 1.5. Insérez la pipette en verre dans le tissu cérébral après que le saignement soit complètement arrêté.
  11. Livrer le virus à l’aide d’une pipette en verre à l’aide d’une pompe d’injection.
    REMARQUE: Le titer du virus doit être supérieur à 1 x 1013 vg/mL pour obtenir un nombre suffisant de cellules exprimant le GCaMP. La vitesse d’injection est de 0,1 μL/min et diffuse pendant 10 min. S’il y a des saignements, lavez la surface du cerveau avec du PBS. Gardez la surface du cerveau humide dans cette étape.
  12. Après avoir terminé l’injection, retirer lentement la pipette en verre.

2. Chirurgie stéréotaxique – implantation de lentilles GRIN

REMARQUE : La chirurgie d’implant de lentille de GRIN est l’étape la plus critique dans ce protocole. Puisqu’une vitesse lente cohérente du mouvement de lentille de GRIN est critique pour l’implantation réussie de lentille de GRIN, un bras motorisé de chirurgie peut être utile. Le bras de chirurgie motorisé est un manipulateur stéréotaxique qui est contrôlé par un logiciel. Bien que le bras motorisé soit utilisé dans ce protocole, d’autres moyens peuvent également être utilisés tant que la lentille se déplace de façon cohérente et lente pendant l’implantation. Des informations détaillées sur l’appareil se trouve dans le Tableau des matériaux.

  1. Percer le crâne pour implanter deux vis du crâne. Laver toutes les fractions du crâne avec du PBS.
    REMARQUE : Pour réduire les artefacts de mouvement dans l’imagerie optique ultérieure, au moins deux vis sont nécessaires. Les deux vis crâniques et la position de l’implant de la lentille GRIN forment un triangle équilatéral(figure 1B). La taille de la craniotomie doit s’adapter étroitement au diamètre de la vis. S’il y a des saignements, lavez la surface de saignement avec PBS. La vitesse de perceuse est de 18 000 r/min, et la taille du bit est de 0,6 mm.
  2. Désinfecter les vis avec 70% d’éthanol pour prévenir l’inflammation. Implanter les vis aussi profondément que possible.
    REMARQUE : Les vis doivent être bien fixées sans adhérence supplémentaire comme le ciment.
  3. Installez un bras de chirurgie motorisé sur le cadre stéréotaxique. Connectez le matériel requis à l’ordinateur portable dans lequel le logiciel de contrôle est installé( Tableau des matériaux).
  4. Avant d’abaisser l’objectif GRIN, préparez-vous à faire une piste d’aiguille avec une aiguille de 26 G.
    REMARQUE : La piste de l’aiguille est une sorte de piste de guidage qui aide à implanter la lentille GRIN relativement épaisse dans les régions cérébrales profondes telles que l’amygdale sans causer une distorsion grave de la structure du cerveau le long du chemin d’injection. Cette piste de guidage est appelée voie d’aiguille parce qu’elle est faite par une procédure d’abaissement et d’élévation de l’aiguille relativement mince de 26 G.
  5. Attachez le support de canule pour tenir l’aiguille sur le cadre stéréotaxique.
  6. Saisir l’aiguille de 26 G avec le support de la canule et calculer les coordonnées du site d’insertion de l’aiguille.
    REMARQUE : Dans ce protocole, les coordonnées du site d’insertion de l’aiguille sont latérales de 50 μm provenant du site d’injection du virus (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -3,7 mm).
  7. Accédez au logiciel de contrôle et préparation complète pour manipuler la position de l’aiguille.
    1. Exécutez le logiciel de contrôle et sélectionnez le nouveau bouton Démarrer le projet pour commencer à contrôler la session.
      REMARQUE : Dans la session de contrôle, il y a plusieurs cases blanches et boutons de menu. Les boîtes vierges sont de l’espace d’entrée pour les coordonnées. Après avoir entré les coordonnées dans les boîtes blanches, le bras stéréotaxique motorisé se déplace en cliquant sur le bouton Go To. Le bouton Go To se transforme en bouton STOP lorsque le bras stéréotaxique se déplace. Parmi plusieurs boutons de menu, seul le bouton Outil est requis dans ce protocole.
    2. Cliquez sur le bouton Outil. Calibrez le logiciel de contrôle en cliquant sur le bouton Calibrate du menu du cadre. L’étalonnage est le processus par lequel la position réelle du manipulateur est définie comme des valeurs sur le logiciel Stereodrive.
  8. Localisez la pointe de l’aiguille à la surface du cerveau exposé à la surface du crâne à l’aide d’un manipulateur stéréotaxique.
    REMARQUE : La vitesse de l’aiguille est réglée à l’aide du menu vitesse Microdrive dans le menu Outil. La vitesse par défaut est de 3,0 mm/s. Toutefois, une vitesse de 0,5 mm/s est recommandée dans cette étape. Le mouvement de l’aiguille est contrôlé par les touches fléchées.
  9. Ajouter 2-3 gouttes de PBS pour garder la surface du cerveau humide. Remplissez la boîte vide sur l’écran de l’ordinateur avec les coordonnées DV appropriées de la LA. Si la surface du cerveau est sèche, elle entrave la pénétration de l’aiguille dans le tissu cérébral.
  10. Abaissez l’aiguille de 26 G en cliquant sur le bouton Go To. Il s’arrête automatiquement lorsque l’aiguille atteint le site cible défini par les coordonnées DV. La vitesse de l’aiguille est de 100 μm/min. S’il y a des saignements, arrêtez l’aiguille en cliquant sur le bouton STOP et lavez la surface du cerveau avec PBS. Gardez la surface du cerveau humide dans cette étape. Après l’arrêt des saignements, recommencez à baisser.
  11. Après que l’aiguille cesse complètement de bouger, entrez 45,00 mm dans la boîte blanche sur l’écran de l’ordinateur.
    REMARQUE : 45,00 mm est une valeur de coordonnée DV qui fait revenir l’aiguille à la position de départ.
  12. Elevez l’aiguille en cliquant sur le bouton Aller pour. La vitesse du mouvement de l’aiguille est de 100-200 μm/min.
  13. Après que l’aiguille cesse de bouger, retirez le PBS sur la surface du cerveau. Désinstaller l’aiguille et le support de canule à partir du cadre stéréotaxique. L’expérimentateur peut arrêter manuellement l’aiguille en cliquant sur le bouton STOP si nécessaire.
  14. Équipez la tige stéréotaxique du support de l’objectif. Installez l’objectif GRIN sur le support de l’objectif.
    REMARQUE : L’objectif GRIN optimisé pour cibler le LA (0,6 mm de diamètre, 7,3 mm de longueur) est utilisé dans ce protocole. Si le support de l’objectif n’est pas préparé, une autre façon est d’utiliser un clip bulldog pour saisir l’objectif GRIN.
  15. Désinfectez l’objectif avec 70% d’éthanol et fixez la tige stéréotaxique aux cadres stéréotaxiques.
  16. Localiser la pointe de la lentille GRIN à l’emplacement désigné à la surface du crâne (même méthode décrite à l’étape 2.8).
    REMARQUE : La coordonnée de l’objectif GRIN est (AP, ML, DV) = (-1,6 mm, -3,55 mm, -4,2 mm) (figure 1C). La lentille ne doit pas toucher le crâne pour éviter les dommages sur sa pointe.
  17. Calculez la coordonnée DV en soustrayant la valeur absolue de la « valeur A » de la coordonnée DV de l’implantation de la lentille décrite à l’étape 2.16.
  18. Déposez 2-3 gouttes de PBS à la surface du cerveau. Entrez 1000 μm pour abaisser et 300 μm pour soulever l’objectif dans la boîte blanche sur l’écran de l’ordinateur.
  19. Répétez l’abaissement (1000 μm vers le bas) et l’élévation (300 μm vers le haut) de la lentille GRIN jusqu’à ce qu’elle atteigne le site cible. Cette procédure de haut en bas est utilisée pour aider à libérer la pression générée à l’intérieur du tissu cérébral en raison de la procédure d’abaissement de la lentille qui, autrement, peut causer une distorsion des structures cérébrales le long du chemin d’implantation.
    REMARQUE : La vitesse du mouvement de l’objectif GRIN est de 100 μm/min. Même s’il y a des saignements, n’arrêtez pas de déplacer l’objectif GRIN et lavez la surface du cerveau avec PBS. Gardez la surface du cerveau humide dans cette étape. Si la surface du cerveau est sèche, le tissu cérébral colle à la surface de la lentille GRIN et il provoque une distorsion de la structure du cerveau.
  20. Si l’objectif GRIN atteint le site cible, retirez PBS et appliquez soigneusement le ciment dentaire en résine autour de l’objectif GRIN, des vis et de leur paroi latérale (Figure 1D).
    REMARQUE : L’application du ciment en résine sur tout le crâne peut réduire les artefacts de mouvement. Au contraire, si le ciment en résine recouvre accidentellement les muscles attachés au crâne, il augmente les artefacts de mouvement.
  21. Après que le ciment dentaire en résine durcit, démonter la lentille GRIN du support de la lentille et appliquer du ciment acrylique sur tout le crâne (Figure 1D).
  22. Pour fixer la plaque de tête, démonter le support de la lentille de la tige stéréotaxique et fixer la plaque de tête sur le bout de la tige à l’aide de bandes. Confirmez si la plaque de tête est horizontale.
    REMARQUE : Une plaque de tête inclinée provoque une vue inclinée. Une plaque frontale est nécessaire pour fixer la tête de souris dans le système de cage de maison mobile (dans la section de fixation de plaque de base). Si l’expérimentateur n’utilise pas le système, sautez cette étape (étape 2.22) et l’étape suivante 2.23.
  23. Abaissez lentement la tige jusqu’à ce que la plaque de tête se trouve au sommet de la manchette de la lentille. Abaissez la plaque de tête 1000 μm de plus. Déplacez la plaque frontale de la lentille GRIN implantée pour la localiser au bord droit de l’anneau interne de la plaque frontale.
    REMARQUE : La plaque de tête doit être placée plus bas que la surface implantée de la lentille GRIN; sinon, le microendoscope ne peut pas s’approcher assez près de la lentille GRIN implantée pour ajuster le plan focal en raison du ciment acryl.
  24. Appliquer du ciment acrylique pour fixer la plaque de tête aux couches de ciment(figure 1D).
  25. Fixez le film de paraffine sur la surface implantée de la lentille GRIN pour protéger la surface de la lentille de la poussière. Appliquez ensuite un lien époxy amovible sur le film de paraffine pour garder le film de paraffine sur la surface de l’objectif.
  26. Injectez du carprofène, un analgésique (0,5 mg/mL dans pbs), et de la dexaméthasone, un médicament anti-inflammatoire (0,02 mg/mL dans PBS) solution, dans la cavité péritonéale de la souris.
    REMARQUE : La dose du médicament dépend du poids corporel : Carprofène (5 mg-kg-1 de poids corporel) et Dexaméthasone (0,2 mg-kg-1 de poids corporel). Le carprofène et la dexaméthasone sont administrés après la chirurgie et une fois par jour pendant 7 jours après la chirurgie.
  27. Mélanger 0,3 mg/mL d’amoxicilline, un antibiotique, dans l’eau de la cage à la maison pour administrer le médicament pendant 1 semaine.
  28. Retournez la souris dans la cage d’origine et prévoyez de 5 à 8 semaines pour la récupération et la transduction du virus.
    REMARQUE : La souris est récupérée dans une cage préchauffée sur une couverture électrique jusqu’à ce que la souris se réveille de l’anesthésique.

3. Validation de l’implantation de l’objectif GRIN

REMARQUE : La validation de l’implantation de la lentille GRIN fournit des informations sur la question de savoir si la lentille GRIN implantée est sur la cible des cellules exprimant le GCaMP. Sur la base de ces informations, l’expérimentateur économise son temps grâce à des processus chronophages tels que le test de comportement et le traitement des données en excluant les animaux ayant une implantation ciblée de lentilles GRIN. Pendant la procédure de validation, les cellules avec expression GCaMP doivent être concentrées dans le champ de vision d’enregistrement. Une cage de mobil-home est utilisée dans cette étape. Une cage de maison mobile est un appareil spécialisé en forme de rond qui permet aux souris fixées à la tête de bouger librement leurs jambes lors de la validation de l’implantation de la lentille GRIN et de l’attachement à la plaque de base. Une table de transport aérien dans cet appareil sur lequel les pattes des souris fixes de tête sont placées permet une telle libre circulation des jambes bien que la tête soit fixée. Les cellules du noyau latéral de l’amygdale sont généralement silencieuses dans un état de repos ou d’anesthésie, de sorte que les signaux de fluorescence GCaMP sont rarement détectés dans ces conditions, ce qui rend très difficile, parfois impossible, de trouver des cellules exprimant GCaMP lors de la validation de l’implantation de la lentille GRIN et de l’attachement à la plaque de base. Cependant, le mouvement des jambes produit souvent des signaux de fluorescence GCaMP dans les cellules du noyau latéral de l’amygdale et peut ainsi aider à localiser le microscope. Ainsi, la cage de maison mobile est utilisée dans ce protocole.

  1. Assemblez le manipulateur stéréotaxique au système de cage de maison mobile.
  2. Anesthésier la souris avec 1,5% de gaz isoflurane. Après que la souris est complètement inconsciente, placez la souris sur la barre de tête du système de cage de maison mobile.
  3. Placez la cage en carbone sous la souris. Fermez la cage en carbone et allumez le flux d’air pour que la cage se déplace librement sans frottement. Attendez quelques minutes jusqu’à ce que la souris devienne active.
    REMARQUE : La vitesse du flux d’air doit être optimisée pour chaque condition expérimentale (ici, 100 L/min).
  4. Enlever le film de paraffine et le lien époxy à la surface de la lentille GRIN implantée et essuyer la surface de la lentille avec 70% d’éthanol à l’aide de papier de lentille.
  5. Préparer le logiciel d’acquisition de données (DAQ) (p. ex., Inscopix). Définissez les conditions d’imagerie.
    REMARQUE : Le logiciel DAQ est utilisé pour contrôler le microscope (puissance LED, mise au point de l’objectif,etc.)et le stockage des données.
    1. Allumez la boîte DAQ et branchez-y un microscope. Ensuite, connectez-le à un ordinateur portable soit directement à l’aide d’un câble ou via internet sans fil.
      REMARQUE : Le logiciel DAQ est installé dans le matériel supplémentaire appelé boîte DAQ (p. ex., Inscopix). En connectant la boîte DAQ à l’ordinateur portable, le logiciel DAQ devient accessible dans un ordinateur portable.
    2. Accédez au logiciel DAQ via un navigateur Internet (Firefox est recommandé).
    3. Définissez tous les détails nécessaires (Date, ID de souris,etc.)dans la session définie. Cliquez ensuite Enregistrer et continuer. Après avoir sauvé, accédez à la session Run.
    4. Dans la session run , définissezles conditions d’imagerie telles que le temps d’exposition, le gain, la mise au point électronique et la puissance d’exposition-LED.
      REMARQUE : Le gain et la puissance de LED d’exposition sont variables selon les conditions de laboratoire. La valeur recommandée pour la mise au point électrique est de 500 et le temps d’exposition est de 50 ms. Il n’y a aucune restriction pour changer la puissance et le gain de LED. Cependant, une intensité plus élevée de la lumière peut causer plus de blanchiment. Le temps d’exposition de l’enregistrement détermine un taux d’image de l’enregistrement vidéo. Des taux d’images plus élevés réduiront l’intensité du signal. Les taux d’image doivent être optimisés pour les GECI utilisés pour l’imagerie.
  6. Pour tenir le microscope sur un manipulateur stéréotaxique, fixez la tige stéréotaxique avec la pince de microscope au manipulateur stéréotaxique.
    REMARQUE : La pince est un petit accessoire qui peut être attaché à l’appareil stéréotaxique pour tenir un corps de microscope pour le placer à l’emplacement cible de cerveau.
  7. Saisir le microscope avec la pince à microscope. Allumez la lumière LED reliée au microscope et alignez le microscope verticalement. Abaissez le microscope tout en observant l’image jusqu’à ce que la surface de la lentille GRIN implantée apparaît.
  8. Alignez le centre de l’objectif GRIN implanté avec le centre de la vue.
    REMARQUE : La validation de l’implantation de la lentille GRIN peut être effectuée à cette étape (mentionnée dans la section résultat, figure 2B, figure 2D, figure 2F).
  9. Capturez l’image de la surface implantée de l’objectif GRIN (Cliquez sur le bouton Prt Sc sur le clavier). L’image de la surface implantée de la lentille GRIN est nécessaire pour désélectionner les composants non neuronaux lors du traitement ultérieur des données (étape 6.8).
  10. Trouvez la position appropriée du microscope. Élever lentement la lentille objective du microscope tout en observant l’image à la recherche de cellules avec l’expression GCaMP7b.
    REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster le gain de l’acquisition d’image ou la puissance d’exposition-LED. La validation de l’implantation de la lentille GRIN peut être effectuée à cette étape (mentionnée dans la section résultat, figure 2A, figure 2C, figure 2E).

4. Fixation de plaque de base

REMARQUE : L’étape de fixation de la plaque de base suit la validation de l’implantation de l’objectif GRIN. La plaque de base est une plate-forme pour monter le microscope à la tête des souris. Comme mentionné dans la section précédente, une cage de mobil-home est utilisée dans ce protocole.

  1. Après validation de l’implantation de la lentille GRIN, démonter un microscope miniature de la pince à microscope.
  2. Fixez la plaque de base au microscope. Serrez la vis à l’aide d’une clé hex pour une fixation stable de la plaque de base au microscope.
  3. Saisir le microscope avec la pince à microscope. Allumez la lumière LED reliée au microscope et alignez le microscope verticalement. Abaissez le microscope jusqu’à ce que la surface de la lentille GRIN implantée soit observée. Alignez le centre de l’objectif GRIN implanté avec le centre de la vue.
  4. Trouvez la position appropriée du microscope. Élever lentement la lentille objective du microscope jusqu’à trouver un plan focal qui donne les meilleures images des cellules avec l’expression GCaMP7b (Figure 2A).
    REMARQUE : Il peut être nécessaire d’ajuster le gain d’acquisition d’image ou la puissance d’exposition-LED pendant cette étape.
  5. Appliquez du ciment acrylique pour fixer solidement la plaque de base à la plaque de tête (figure 2G). Construire les parois latérales avec du ciment acrylique entre la plaque de base et la plaque de tête.
    REMARQUE : Le ciment acrylique rétrécit lorsqu’il durcit. Pour cette raison, n’enlevez pas le microscope jusqu’à ce que le ciment durcisse complètement (cette étape prend au moins 30 min). Le cimentage doit être fait très soigneusement pour éviter le cimentage non désiré du microscope et de sa lentille objective avec du ciment acrylique.
  6. Après ciment acrylique durcit complètement, desserrer la vis et élever le corps microscope lentement.
  7. S’il y a une lacune sur le parois latérale, refaire des ciments supplémentaires pour protéger l’objectif GRIN implanté de la poussière.
  8. Couvrez la plaque de base pour protéger la lentille GRIN implantée de la poussière et serrer la vis de la plaque de base.
  9. Relâchez la plaque de tête de la barre de tête. Retournez la souris dans la cage d’accueil jusqu’à l’imagerie optique future.

5. Enregistrement optique du signal GCaMP lors d’un test de comportement

REMARQUE : La procédure d’enregistrement du signal GCaMP pendant le comportement peut être très différente selon les systèmes utilisés pour l’imagerie optique, la conception expérimentale et l’environnement de laboratoire. Par conséquent, il est décrit d’une manière simple dans cette section.

  1. Effectuer plusieurs jours de manipulation avant le test de comportement.
  2. Préparez l’appareil de comportement (p. ex., chambre de conditionnement de la peur, logiciel de comportement et instrument Coulbourn) et l’ordinateur portable.
  3. Branchez le microscope dans la boîte DAQ et allumez la boîte DAQ.
  4. Connectez la boîte DAQ à l’ordinateur portable via une connexion Internet sans fil.
  5. Démarrez le logiciel DAQ (le navigateur Firefox est recommandé) sur l’ordinateur portable. Cliquez sur le bouton Gestionnaire de fichiers et vérifiez la capacité de stockage restante de la case DAQ pour enregistrer les données enregistrées.
    REMARQUE : La taille des données est d’environ 80 Go pour l’enregistrement de 30 min.
  6. Entrez les informations nécessaires (Date, ID de souris,etc.)dans la session Définie et entrez dans la session Run.
  7. Saisir délicatement la souris et retirer le couvercle de la plaque de base sur sa tête. Placer le microscope sur la plate-forme de base.
  8. Serrez la vis de plaque de base et placez l’animal avec un microendoscope tête-montage dans la chambre de comportement.
    REMARQUE : La souris tente de s’échapper dans cette étape si la manipulation ne suffit pas.
  9. Connectez la carte NI au port TRIG de la boîte DAQ à l’aide d’un câble BNC. Ni board reçoit des signaux TTL provenant d’un logiciel de comportement (par exemple, FreezeFrame) et coordonne la procédure d’enregistrement simultanée du signal GCaMP et du comportement de l’animal.
  10. Ajustez le plan focal.
    REMARQUE : Le plan focal est déterminé par la distance entre la lentille objective du microscope et la lentille GRIN implantée dans le cerveau. Pour ajuster le plan focal, la position objective de la lentille est manipulée lors de l’observation des images. La distance entre ces deux lentilles qui montre une morphologie claire des cellules et des vaisseaux sanguins est définie comme le plan focal pour l’imagerie. Dans ce protocole, le logiciel DAQ est utilisé pour contrôler le mouvement de l’objectif lors de l’ajustement.
  11. Réglez le temps d’exposition optimisé, le gain, la puissance LED dans la session Run.
    REMARQUE : En général, 50 ms est utilisé pour le temps d’exposition. Gain et puissance LED sont réglés en fonction des histogrammes d’image. Les histogrammes indiquent la distribution de l’intensité de fluorescence des pixels. Basé sur l’inspection visuelle, le bord droit de l’histogramme devrait avoir une valeur comprise entre 40% et 60% dans le cas de GCaMP7b. Il change en fonction des IGE utilisés pour l’imagerie.
  12. Modifier l’option d’enregistrement à l’enregistrement déclenché. Cliquez sur Enregistrer et démarrer le comportement.
    REMARQUE : L’option d’enregistrement déclenchée fournit une chronologie appariée de la session d’enregistrement et de la session de comportement. Si le signal TTL est reçu, un feu rouge au-dessus du port TRIG s’allume.
  13. Après avoir terminé le test de comportement, détachez le microscope et fixez le couvercle de la plaque de base.
  14. Retournez la souris dans la cage d’accueil. Ensuite, sélectionnez Gestionnaire de fichiers et données d’exportation à partir de la case DAQ.
  15. Après le test de comportement, sacrifiez la souris pour la vérification histologique post mortem.

6. Traitement des données

REMARQUE : La procédure de traitement des données est très différente selon le logiciel de traitement des données et les IGE utilisés pour l’expérience d’imagerie. Par conséquent, il est décrit d’une manière simple dans cette section. Ce protocole utilise un logiciel commercial de traitement des données (voir tableau des matériaux). Alternativement, d’autres logiciels open source mentionnés dans la section discussion peuvent également être utilisés sans problème. Les variables utilisées dans ce protocole sont énumérées dans le tableau 1.

  1. Importez le fichier de données vidéo d’enregistrement (1280 pixels x 800 pixels) de la boîte DAQ dans l’ordinateur de bureau pour le traitement des données. Lancez le logiciel de traitement des données.
    REMARQUE : Les logiciels de traitement de données sont différents des logiciels DAQ dans les étapes précédentes. Dans les logiciels de traitement des données, il y a 6 étapes : échantillonnage vers le bas, recadrage, filtre spatial, correction de mouvement, calcul ΔF/F, détection d’événements qui sont nécessaires pour extraire des données transitoires de calcium à cellule unique à partir de vidéos enregistrées.
  2. Downsample et recadrer la vidéo.
    REMARQUE : L’amortissement et la culture sont nécessaires pour augmenter la vitesse de traitement des données. Recadrer la zone à l’exception de la région d’intérêt où le signal GCaMP est observé.
  3. Appliquer un filtre spatial. Après l’application du filtre spatial, créez une image de projection d’intensité moyenne.
    REMARQUE : Le filtre spatial distingue chaque pixel de l’image vidéo enregistrée et fournit une image à contraste élevé. Il existe deux types de filtre de coupure, filtre de coupure bas et élevé. La valeur plus élevée des filtres à faible coupure augmente le contraste d’image, mais au même bruit gris global augmente également. La valeur inférieure du filtre de coupure élevé rend l’image floue.
  4. Appliquer la correction de mouvement. Utilisez l’image de projection d’intensité moyenne comme image de référence pour la correction de mouvement.
  5. Appliquez à nouveau la correction de mouvement en utilisant l’image du premier cadre comme image de référence.
    REMARQUE : Deux étapes de correction de mouvement diminuent considérablement l’artefact de mouvement.
  6. Appliquez le calcul ΔF/F pour visualiser les pixels qui montrent un changement de luminosité.
    REMARQUE : Le changement de luminosité des pixels est causé par le changement d’intensité de fluorescence du GCaMP, et il indique des transitoires de calcium.
  7. Appliquez l’algorithme PCA/ICA pour visualiser la courbe transitoire du calcium de chaque cellule.
    REMARQUE : PCA/ICA est un algorithme de tri d’un groupe de données en un ensemble de données à composant unique. Les variables doivent être optimisées pour chaque condition de laboratoire. Dans ce protocole, toutes les variables sont par défaut à l’exception du poids temporel de l’ICA (0,4 est utilisé dans ce protocole)27.
  8. Désélectionner manuellement les composants non neuronaux parmi les composants identifiés en fonction des critères décrits dans la note suivante.
    REMARQUE : Deux critères majeurs sont utilisés à cette fin. Tout d’abord, le signal GCaMP provient d’un neurone ressemble à une forme sphérique claire. Ainsi, seul le signal avec une forme sphérique claire est sélectionné comme neurone. Deuxièmement, étant donné le diamètre du corps cellulaire de la cellule pyramidale amygdale est connu pour être d’environ 20 μm28,29,30, seul le signal correspond approximativement à cette taille est sélectionné comme un neurone. Pour déterminer la taille du signal GCaMP, la taille réelle d’un seul pixel est calculée en fonction de l’image capturée de la surface de la lentille (étape 3.9) et la largeur maximale de la forme sphérique unique est calculée. Par exemple, dans ce protocole, le diamètre de la lentille GRIN implantée est de 600 μm. Par conséquent, si le diamètre de l’objectif est de 800 pixels, la taille réelle du pixel unique est de 1,5 μm (20 μm est d’environ 7 pixels).
  9. Appliquer la fonction de détection d’événements pour détecter une augmentation significative du calcium transitoire (événement calcium).
    REMARQUE : Dans cette étape, la variable appelée événement le plus petit temps de décomposition (τ) est nécessaire. Dans ce protocole, 1.18s est utilisé comme une variable optimisée pour GCaMP7b. Le temps moyen de décomposition (t1/2=0,82 s) est calculé en fonction de la courbe ΔF/F pendant l’activité spontanée des cellules. Depuis GCaMP suit la décomposition exponentielle, τ = figure-protocol-1 .

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Résultats

Validation de l’implantation de l’objectif GRIN
Avant d’attacher chroniquement la plaque de base au cerveau en cimentant, l’implantation de la lentille GRIN doit être validée. Chez les animaux ayant réussi l’implantation de lentilles, les cellules exprimant le GCaMP et les vaisseaux sanguins ont été clairement observées dans une plage de plan focale déterminée par la distance entre la lentille objective du microscope et la lentille GRIN implantée (figure 2

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Discussion

Techniques de chirurgie habiles sont essentiels pour atteindre le succès in vivo imagerie optique de calcium avec microscopie miniature tête-montage dans les régions cérébrales plus profondes telles que l’amygdale comme nous l’avons décrit ici. Par conséquent, bien que ce protocole fournit une ligne directrice pour optimiser les processus chirurgicaux de fixation de la plaque de base et l’implantation de lentilles GRIN, des processus d’optimisation supplémentaires pourraient être nécessaires pour les étapes critiques. Co...

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Déclarations de divulgation

L’auteur n’a rien à divulguer

Remerciements

Ces travaux ont été soutenus par des subventions de la Samsung Science and Technology Foundation (Project Number SSTF-BA1801-10).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Aiguille 26GBD302002Chirurgie
AAV1-Syn-GCaMP7b-WPREAddgene104493-AAV1Chirurgie
AAV2/1-CaMKii&alpha ;-GFPsurmesure
Chirurgie Acrylique-Dentaire Ciment (Ortho-jet Acrylique Rose)Lang1334-pinkChirurgie & Accessoire de plaque de base
Manipulateur de flux d’airNeurotarNTR000253-04Accessoire de plaque de base
AmoxicillineSIGMAA8523-5G
Plaque de basede chirurgie INSCOPIX1050-002192Accessoire de plaque de
base Couvercle de plaque de baseINSCOPIX1050-002193Accessoire de plaque de base
Appareil comportemental (chambre)Coulbourn InstrumentTestcageTest de comportement
Appareil comportemental (logiciel)Coulbourn InstrumentFreeze FrameTest de comportement
Cage en carboneNeurotar180mm x 70mmBaseplate Attachment
CarprofenSIGMAPHR1452-1GSurgery
Logiciel de traitement de donnéesINSCOPIXINSCOPIX Logiciel de traitement de données Attachement & Test de comportement
DexaméthasoneSIGMAD1756-500MGForet chirurgical
Seyangmarathon-4Fraise
chirurgieELAUS1/2, Shank104Aiguille
en verrede chirurgie WPIPG10165-4
Chirurgie Lentille GRIN (Sonde de lentille INSCOPIX Proview)INSCOPIX1050-002208Chirurgie
Hamilton SeringueHamilton84875Chirurgie
Plaque de têteNeurotarModèle 5Chirurgie
Hex-keyINSCOPIX1050-004195Fixation de plaque de base
Ordinateur portableSamsungNT950XBVChirurgie & Fixation de la plaque de base
Porte-objectif, tige stéréotaxique (kit d’implant INSCOPIX proview)INSCOPIX1050-004223Pince
microscopede chirurgie INSCOPIX1050-002199Microscope de fixation de la plaque de base
, logiciel d’acquisition de données, matérielINSCOPIXnVista 3.0Fixation de la plaque de base & Test de comportement
Cage domestique mobileNeurotarMHC V5Plaque de base
Fixation Bras momifié NeurostarChirurgie personnaliséeLogiciel
bras motoriséNeurostarChirurgie personnalisée
Carte NIInstrumentTest de comportement
Liaison époxy amovibleWPIKwik-CastSurgery
Ciment résine (Super-bond)Sun medicalSuper bond C& BChirurgie
Vis crânienneStoelting51457
Chirurgie Porte-électrode stéréotaxiqueASIEH-600Chirurgie
Cadre stéréotaxiqueStoelting51600Chirurgie
Manipulateur stéréotaxiqueStoelting51600Fixation de plaque de base
de de de national

Références

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  30. McDonald, A. J. Neurons of the lateral and basolateral amygdaloid nuclei: a Golgi study in the rat. Journal of Comparative Neurology. 212 (3), 293-312 (1982).

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