Ce protocole présente l’essai choroïde de germination, un modèle ex vivo de prolifération microvasculaire. Cet essai peut être utilisé pour évaluer les voies impliquées dans la prolifération des micro-vaisseaux choroïdiens et évaluer les traitements médicamenteux à l’aide de tissus de souris sauvages et génétiquement modifiés.
Un abonnement JoVE est requis pour visualiser ce contenu. Connectez-vous ou commencez votre période d'essai gratuite.
Article de méthode
Un ex Vivo Choroid Sprouting Assay de l’angiogenèse microvasculaire oculaire
Dans cet article
Résumé
Résumé
L’angiogenèse choroïde pathologique, une caractéristique saillante de la dégénérescence maculaire relative à l’âge, mène à l’affaiblissement de vision et à la cécité. Les tests de prolifération des cellules endothéliales (EC) utilisant des cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMECs) ou des EC rétiniennes primaires isolées sont largement utilisés dans des modèles in vitro pour étudier l’angiogenèse rétinienne. Cependant, isoler les cellules endothéliales rétiniennes murines pures est techniquement difficile et les CE rétiniens peuvent avoir des réponses de prolifération différentes que les cellules endothéliales choroïdes et les différentes interactions cellule/cellule. Un essai choroïdien choroïde fortement reproductible de germination comme modèle de prolifération microvasculaire choroïde a été développé. Ce modèle inclut l’interaction entre la vascularisation choroïde (EC, macrophages, péricytes) et l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Les explants rpe/choroïdes/scléraux de souris sont isolés et incubés dans l’extrait basal de membrane croissance-facteur-réduit (BME) (jour 0). Le milieu est changé tous les deux jours et la germination choroïde est quantifiée au jour 6. Les images de l’explantation choroïde individuelle sont prises avec un microscope de phase inversée et la zone de germination est quantifiée à l’aide d’un plug-in macro semi-automatisé au logiciel ImageJ développé dans ce laboratoire. Cet essai reproductible de germination choroïde ex vivo peut être employé pour évaluer des composés pour le traitement potentiel et pour la recherche microvasculaire de maladie pour évaluer des voies impliquées dans la prolifération choroïde de micro navire utilisant le type sauvage et le tissu génétiquement modifié de souris.
Introduction
La dysrégulation choroïde d’angiogenèse est associée à la dégénérescence maculaire relative à l’âge néoovasculaire (DME)1. Le choroïde est un lit microvasculaire présent sous l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR). Il a été démontré que la réduction du flux sanguin dans le choroïde est associée à la progression de la D AMD2. La relation complexe entre l’endothélium vasculaire, l’EPR, les macrophages, les péricytes et d’autres cellules est responsable de l’homéostasiedu tissu 3,4,5. Par conséquent, un microenvironnement choroïdien reproductible de modélisation d’essai est critique pour l’étude de la DMO néovasculaire.
Les analyses d’angiogenèse ex vivo et les cultures cellulaires endothéliales in vitro peuvent compléter les études sur le comportement microvasculaire in vivo, pour tester de nouveaux médicaments et pour des études sur la pathogénie. Les cellules endothéliales telles que les cellules endothéliales microvasculaires rétiniennes humaines (HRMECs), les cellules endothéliales des veines ombilicales humaines (HUVEC), le cerveau animal primaire isolé ou les CE rétiniens sont souvent utilisées dans des études in vitro pour la recherche sur l’angiogenèseoculaire 6,7,8. Les HRMEC en particulier ont été largement utilisés comme modèle de néovascularisation choroïdienne in vitro (CNV)9 en évaluant la prolifération endothéliale, la migration, la formation tubulaire et les fuites vasculaires pour évaluer les interventions6,10. Cependant, les CE en culture sont limités comme modèle de CNV en raison du manque d’interactions avec d’autres types de cellules trouvés dans le choroïde et parce que la plupart des EC utilisés dans ces analyses ne proviennent pas de choroïdes. Les CE choroïdes de souris sont difficiles à isoler et à maintenir dans la culture.
L’essai aortique d’anneau est employé couramment comme modèle de prolifération vasculaire macro. Les pousses vasculaires provenant d’explants aortiques comprennent les CE, les péricytes et les macrophages11. L’essai d’anneau aortique modèle le grand angiogenèse denavire bien 12,13,14. Cependant, il a des limitations comme modèle de néovascularisation choroïdienne car les anneaux aortiques sont un tissu macrovasculaire dépourvu de l’environnement microvasculaire choroïde caractéristique, et les germes des grands vaisseaux peuvent différer des germes des réseaux capillaires impliqués dans la pathologie microvasculaire. Récemment, un groupe a publié un essai rétinien ex vivo15,16. Bien qu’il soit approprié pour la maladie néovasculaire rétinienne, il n’est pas aussi approprié pour la néovascularisation choroïde comme vu dans AMD.
L’essai choroïde de germination utilisant le RPE de souris, le choroïde, et le tissu explanté sclérical a été développé pour mieux modéliser CNV. Le tissu peut facilement être isolé des yeux de souris (ou d’autres espèces)17. Cet essai permet l’évaluation reproductible du potentiel pro- et anti-angiogenic des composés pharmacologiques et l’évaluation du rôle des voies spécifiques dans la néovascularisation choroïde utilisant le tissu des souris génétiquement modifiées et contrôle18. Cet essai choroïde de germination a été référencé dans beaucoup de publicationssuivantes 9,10,18,19,20. Ici, la méthode impliquée dans l’utilisation de cet essai sont démontrées.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Protocole
Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux du Boston Children’s Hospital (numéro de protocole ARCH 19-04-3913R).
1. Préparation
- Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (10000 U/mL) et 5 mL et 10 mL de suppléments disponibles dans le commerce à 500 mL de milieu classique complet avec sérum. Aliquot 50 mL du milieu initialement.
REMARQUE : Ne retournez aucun milieu au stock pour éviter la contamination. - Mettez un aliquot de milieu classique complet sur la glace.
- Utilisez 70 % d’éthanol pour nettoyer le microscope, les forceps et les ciseaux disséquants.
- Préparer deux plats de culture cellulaire (10 cm), l’un au microscope à dissection, l’autre sur glace; mettre 10 mL de milieu classique complet dans chaque plat.
2. Étapes expérimentales (Figure 1)
- Sacrifier les souris C57BL/6J autour de la kétamine postnatale (P) 20 à l’aide de kétamine de 75 à 100 mg/kg et de 7,5 à 10 mg/kg de xylazine injectée intraperitoneally. Gardez les yeux dans le milieu classique complet sur la glace avant la dissection.
- Enlever le tissu conjonctif (muscle et tissu adipeux) et le nerf optique sur l’œil.
- Utilisez un micro-ciseaux pour couper circonférentiellement 0,5 mm postérieur au limbus cornéen. Retirer le complexe cornée/iris, vitreux et la lentille.
- Faire une incision de 1 mm perpendiculairement au bord de coupe vers le nerf optique et couper une bande circonférentielle de 1 mm de largeur. Séparez les régions centrales et périphériques du complexe. Utilisez des forceps pour décoller la rétine du complexe RPE/choroid/sclera.
- Gardez la bande choroïde périphérique dans un milieu classique complet sur la glace; isoler l’autre œil et répéter le processus pour couper une deuxième bande.
- Couper la bande circulaire en 6 ~morceaux carrés égaux (~1 mm x 1 mm).
REMARQUE : Ne touchez jamais à aucun bord. - Décongeler l’extrait de membrane basale (BME) par instruction de fabrication. Ajouter 30 μL/puits de BME au centre de chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Assurez-vous que la gouttelette de BME forme un dôme convexe au bas de la plaque sans toucher les bords.
REMARQUE : Décongeler le BME toute la nuit au réfrigérateur. Le BME doit être sur la glace à tout moment après le dégel. - Placez le tissu au milieu du BME.
REMARQUE : N’aplatissez pas l’explantation choroïde; généralement, laissez le tissu se développer dans le BME. L’orientation du tissu (côté sclérical vers le haut ou vers le bas) n’a pas d’impact sur les résultats expérimentaux. - Incuber la plaque à 37 °C pendant 10 min pour laisser le gel se solidifier.
- Ajouter 500 μL du milieu/puits classique complet.
- Changez le médium classique tous les deux jours (500 μL). La germination choroïde peut être observée après 3 jours au microscope.
REMARQUE : Pour le traitement des facteurs de croissance, affamer le tissu pendant 4 h. Diluer un composé d’essai dans un milieu à facteur de croissance réduit (1:200 boost au lieu de 1:50).
3.SWIFT-Choroid méthode informatisée de quantification17 (Figure 2)
REMARQUE : Une méthode informatisée pour mesurer la superficie couverte par les navires en croissance a été utilisée. Un plugin macro au logiciel ImageJ est nécessaire avant la quantification (voir informations complémentaires pour plus de détails).
- Ouvrez l’image de germination choroïde avec ImageJ et vérifiez "Image | Le type| 8-bit" à l’échelle grise.
- Aller à "Image | Ajuster | Luminosité/Contraste (Ctrl/shift/C)" et optimiser le contraste.
- Utilisez la fonction baguette magique pour décrire et enlever de l’image le tissu choroïde qui sont présents au centre des germes (en utilisant la clé raccourcie "F1« ) (Figure 2A,B).
REMARQUE : Réglez le taux de tolérance de la baguette magique à 20-30%. - Supprimez l’arrière-plan de l’image avec les outils de sélectiongratuits ( Figure 2C). Aller à "Image | Ajuster | Seuil (Ctrl/shift/T)« . Utilisez la fonction seuil pour définir les germes microvasculaires en arrière-plan et en périphérie (Figure 2D).
- Cliquez sur" F2" et un résumé apparaîtra. Enregistrez une image de la zone sélectionnée en cliquant sur "Enregistrer« . Enregistrer dans le même dossier que l’image d’origine pour la référence future.
- Une fois qu’un groupe d’échantillons est mesuré, copiez l’enregistrement pour analyse de données.
REMARQUE : Il est également possible de mesurer la zone (μm²) par «Analyser | Set Scale" à l’aide d’images avec barres d’échelle.
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Résultats
Comparaison de la croissance de la germination choroïde par jour
Nous avons disséqué le choroïde avec de la sclérienne, incrusté dans le BME et les avons cultivés pendant 6 jours( Figure 1). La germination choroïde chez les souris C57BL/6J du jour 3 au jour 6 a été examinée au microscope et quantifiée avec SWIFT-Choroid une méthode de quantification semi-automatisée dans ImageJ. Dans un cas représentatif, la zone choroïde de germination (les vaiss...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Discussion
L’analyse choroïdienne de germination aide la recherche dans amd néovasculaire9,10,18,19,20. Les explantations choroïdes peuvent être isolées de souris ainsi que de rats etd’humains 17,21. L’explant choroïde comprend les CE, les macrophages et les péricytes17. Dans cet essai l’i...
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont pas de divulgation financière. La méthode informatisée est disponible gratuitement aux établissements d’enseignement par l’intermédiaire des auteurs.
Remerciements
Les travaux ont été soutenus par des subventions de la Manpei Suzuki Diabetic Foundation (YT), du Boston Children’s Hospital OFD/BTREC/CTREC Faculty Career Development Grant, de la Boston Children’s Hospital Ophthalmology Foundation, du BCH Pilot Award, de la BCH Manton Center Fellowship et de la Little Giraffe Foundation (ZF), de la German Research Foundation (DFG; à BC [CA1940/1-1]), NIH R24EY024868, EY017017, R01EY01717-13S1, EY030904-01, BCH CRDI (1U54HD090255), Massachusetts Lions Eye Foundation (LEHS).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| AnaSed (Xylazine) | AKORN | 59339-110-20 | |
| Extrait de membrane basale (BME) Matrigel | BD Biosciences | 354230 | |
| Boîte de culture cellulaire | NEST | 704001 | 10cm |
| Milieu classique complet avec sérum et systèmes cellulaires CultureBoost | 4Z0-500 | ||
| Alcool éthylique 200 Proof | Pharmco | 111000200 | utilisation pour 70 % |
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666 | |
| Microscope | ZEISS | Axio Observer Z1 | |
| Pénicilline/Streptomycine | GIBCO | 15140 | 10000 U/mL |
| Plaque de culture tissulaire (24 puits) | Olympus | 25-107 | |
| VetaKet CIII (Kétamine) | AKORN | 59399-114-10 |
Références
- Zarbin, M. A. Current concepts in the pathogenesis of age-related macular degeneration. Arch Ophthalmol. 122 (4), 598-614 (2004).
- Pemp, B., Schmetterer, L. Ocular blood flow in diabetes and age-related macular degeneration. Canadian Journal of Ophthalmology. 43 (3), 295-301 (2008).
- Murakami, Y., Ishikawa, K., Nakao, S., Sonoda, K. H. Innate immune response in retinal homeostasis and inflammatory disorders. Progress in Retinal and Eye Research. 74, 100778(2020).
- Fu, Z., et al. Dyslipidemia in retinal metabolic disorders. EMBO Molecular Medicine. 11 (10), 10473(2019).
- Daruich, A., et al. Mechanisms of macular edema: Beyond the surface. Progress in Retinal and Eye Research. 63, 20-68 (2018).
- Tomita, Y., et al. Long-Acting FGF21 Inhibits Retinal Vascular Leakage in In Vivo and In Vitro Models. International Journal of Molecular Sciences. 21 (4), 21041188(2020).
- Maisto, R., et al. ARPE-19-derived VEGF-containing exosomes promote neovascularization in HUVEC: the role of the melanocortin receptor 5. Cell Cycle. 18 (4), 413-424 (2019).
- Mazzoni, J., et al. The Wnt Inhibitor Apcdd1 Coordinates Vascular Remodeling and Barrier Maturation of Retinal Blood Vessels. Neuron. 96 (5), 1055-1069 (2017).
- Fu, Z., et al. Adiponectin Mediates Dietary Omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acid Protection Against Choroidal Neovascularization in Mice. Investigative Ophthalmology and Visual Sciences. 58 (10), 3862-3870 (2017).
- Gong, Y., et al. Cytochrome P450 Oxidase 2C Inhibition Adds to omega-3 Long-Chain Polyunsaturated Fatty Acids Protection Against Retinal and Choroidal Neovascularization. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 36 (9), 1919-1927 (2016).
- Nicosia, R. F., Zorzi, P., Ligresti, G., Morishita, A., Aplin, A. C. Paracrine regulation of angiogenesis by different cell types in the aorta ring model. International Journal of Developmental Biology. 55 (4-5), 447-453 (2011).
- Bellacen, K., Lewis, E. C. Aortic ring assay. Journal of Visulaized Experiments. (33), e1564(2009).
- Masson, V. V., et al. Mouse Aortic Ring Assay: A New Approach of the Molecular Genetics of Angiogenesis. Biological Procedures Online. 4, 24-31 (2002).
- Katakia, Y. T., et al. Ex vivo model for studying endothelial tip cells: Revisiting the classical aortic-ring assay. Microvascular Research. 128, 103939(2020).
- Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
- Rezzola, S., et al. A novel ex vivo murine retina angiogenesis (EMRA) assay. Experimental Eye Research. 112, 51-56 (2013).
- Shao, Z., et al. Choroid sprouting assay: an ex vivo model of microvascular angiogenesis. PLoS One. 8 (7), 69552(2013).
- Tomita, Y., et al. Free fatty acid receptor 4 activation protects against choroidal neovascularization in mice. Angiogenesis. 23, 385-394 (2020).
- Li, J., et al. Endothelial TWIST1 promotes pathological ocular angiogenesis. Investigative Ophthalmology and Vision Science. 55 (12), 8267-8277 (2014).
- Liu, C. H., et al. Endothelial microRNA-150 is an intrinsic suppressor of pathologic ocular neovascularization. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 112 (39), 12163-12168 (2015).
- Zhou, Q., et al. LncEGFL7OS regulates human angiogenesis by interacting with MAX at the EGFL7/miR-126 locus. Elife. 8, 40470(2019).
- Kobayashi, S., Fukuta, M., Kontani, H., Yanagita, S., Kimura, I. A quantitative assay for angiogenesis of cultured choroidal tissues in streptozotocin-diabetic Wistar and spontaneously diabetic GK rats. Japanese Journal of Pharmacology. 78 (4), 471-478 (1998).
- Kobayashi, S., et al. Inhibitory effects of tetrandrine and related synthetic compounds on angiogenesis in streptozotocin-diabetic rodents. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 22 (4), 360-365 (1999).
- Kobayashi, S., Shinohara, H., Tsuneki, H., Nagai, R., Horiuchi, S. N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine proliferated CD34(+) cells from rat choroidal explant in culture. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (9), 1382-1387 (2004).
- Kobayashi, S., et al. Overproduction of N(epsilon)-(carboxymethyl)lysine-induced neovascularization in cultured choroidal explant of streptozotocin-diabetic rat. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 27 (10), 1565-1571 (2004).
- Bergers, G., Song, S. The role of pericytes in blood-vessel formation and maintenance. Neuro-Oncology. 7 (4), 452-464 (2005).
- Browning, A. C., Stewart, E. A., Amoaku, W. M. Reply to: Phenotypic plasticity of human umbilical vein endothelial cells. British Journal of Ophthalmology. 96 (9), 1275-1276 (2012).
Accès restreint. Veuillez vous connecter ou commencer un essai pour afficher ce contenu.
Réimpressions et autorisations
