Une méthode efficace pour la production d’adénovirus

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour la production d’adénovirus en utilisant le système pAdEasy. La technologie comprend la recombinaison des plasmides pAdTrack et pAdEasy-1, l’emballage et l’amplification des adénovirus, la purification des particules adénoviraux du lysat cellulaire et du milieu de culture, le titrage viral et le test fonctionnel de l’adénovirus.

Résumé

La transduction adénovirale présente l’avantage d’une induction forte et transitoire de l’expression du gène d’intérêt dans une grande variété de types de cellules et d’organes. Cependant, la technologie adénovirale recombinante est laborieuse, longue et coûteuse. Ici, nous présentons un protocole amélioré utilisant le système pAdEasy pour obtenir des particules adénovirales purifiées qui peuvent induire une forte expression de protéine fluorescente verte (GFP) dans les cellules transduites. Les avantages de cette méthode améliorée sont une préparation plus rapide et une réduction des coûts de production par rapport à la méthode originale développée par Bert Vogelstein. Les principales étapes de la technologie adénovirale sont : (1) la recombinaison de pAdTrack-GFP avec le plasmide pAdEasy-1 dans les bactéries BJ5183 ; 2° l’emballage des particules adénoviraux; (3) l’amplification de l’adénovirus dans les cellules d’AD293 ; 4° la purification des particules adénoviraux du lysat cellulaire et du milieu de culture; et (5) le titrage viral et l’essai fonctionnel de l’adénovirus. Les améliorations apportées à la méthode originale consistent en (i) la recombinaison dans le pAdEasy-1 contenant du BJ5183 par transformation chimique de bactéries; ii) la sélection de clones recombinants par PCR « négative » et « positive »; iii) la transfection de cellules AD293 à l’aide du système de transfection K2 pour l’emballage adénoviral; iv) la précipitation avec du sulfate d’ammonium des particules virales libérées par les cellules AD293 dans le milieu de culture cellulaire; et (v) la purification du virus par ultracentrifugation discontinue en une seule étape du chlorure de césium. Une forte expression du gène d’intérêt (dans ce cas, GFP) a été obtenue dans différents types de cellules transduites (telles que les hépatocytes, les cellules endothéliales) à partir de diverses sources (humaines, bovines, murines). Le transfert de gènes à médiation adénovirale représente l’un des principaux outils de développement de thérapies géniques modernes.

Introduction

Les adénovirus sont des virus non enveloppés contenant une nucléopside et un génome d’ADN linéaire double brin^1,2,3. Les adénovirus peuvent infecter un large éventail de types de cellules et l’infection ne dépend pas de la division cellulaire hôte active. Après l’infection, l’adénovirus introduit son ADN génomique dans le noyau de la cellule hôte, où il reste épichromosomique et est transcrit avec les gènes de l’hôte. Ainsi, un risque potentiel minimal de mutagenèse insertionnelle ou de régulation des oncogènes est atteint 4,5,6. Le génome adénoviral n’est pas répliqué avec le génome de l’hôte et, par conséquent, les gènes adénoviraux sont dilués dans une population cellulaire qui se divise. Parmi les avantages de la transduction adénovirale, il y a : (i) des niveaux élevés d’expression de transgene ; ii) réduction des risques liés à l’intégration de l’ADN viral dans le génome de l’hôte, en raison de l’expression épisomale; iii) la transduction d’une grande variété de types de cellules qui se divisent et qui ne se divisent pas. La plupart des adénovirus utilisés dans la recherche biomédicale sont non réplicatifs, dépourvus de la région E1^7,8,9. Pour leur production, une lignée cellulaire fournissant la séquence E1 (telle que HEK293) est requise. En outre, une région non essentielle pour le cycle de vie viral (E3) a été supprimée pour permettre l’insertion d’un transgène dans le génome viral; d’autres régions (E2 et E4) ont été encore supprimées dans quelques adénovirus, mais dans ces cas, un rendement diminué de production adénovirale et une faible expression du transgène ont été rapportés^7.

Ici, nous présentons un protocole amélioré pour la construction, l’emballage et la purification des adénovirus à l’aide du système AdEasy. Ces améliorations ont permis l’emballage de l’adénovirus d’une manière plus rapide et plus économique par rapport à la méthode originale développée par Bert Vogelstein^2,10,en raison des avantages suivants: (i) la recombinaison dans BJ5183-contenant pAdEasy-1 par transformation chimique des bactéries; ii) la sélection des clones recombinants par PCR; iii) la transfection de cellules AD293 à l’aide du système de transfection K2 pour l’emballage adénoviral; iv) la précipitation de particules adénoviraux du milieu de culture après conditionnement et amplification viraux; v) la purification adénovirale par ultracentrifugation à gradient de chlorure de césium (CsCl) en une seule étape.

Le protocole de production d’adénovirus à l’aide du système AdEasy (Figure 1) comprend les étapes suivantes :

(1) Recombinaison de pAdTrack-GFP avec pAdEasy-1 dans les bactéries BJ5183
(2) Emballage des particules adénoviraux
(3) Amplification de l’adénovirus
(4) Purification des particules adénoviraux à partir du lysat cellulaire et du milieu de culture
(5) Titrage d’adénovirus.

Figure 1 : La technologie de production d’adénovirus. Les principales étapes de la technologie adénovirale sont: (1) La recombinaison du pAdTrack-GFP avec le plasmide pAdEasy-1 dans les bactéries BJ5183. Les plasmides recombinés sélectionnés sont amplifiés dans les bactéries DH5α puis purifiés ; (2) L’emballage des particules adénovirales dans les cellules AD293, qui produisent des protéines adéno-E1; (3) L’amplification de l’adénovirus dans les cellules d’AD293 ; (4) La purification des particules adénoviraux du lysat cellulaire et du milieu de culture par ultracentrifugation sur un gradient de densité CsCl ; (5) Le titrage de l’adénovirus et les tests fonctionnels. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Dans ce protocole, nous avons illustré la technologie pour la production de l’adénovirus, qui peut induire l’expression de GFP dans les cellules hôtes. La GFP est déjà insérée dans l’épine dorsale du vecteur navette pAdTrack-CMV (Addgene #16405), sous un deuxième promoteur CMV et est utilisée comme gène rapporteur(Figure 1). Pour cette raison, nous avons désigné ici le vecteur pAdTrack-CMV comme pAdTrack-GFP et nous avons évalué l’expression de GFP à des fins démonstratives. Outre l’expression de la GFP, le système peut être utilisé pour surexprimer un gène d’intérêt, qui peut être cloné dans les multiples sites de clonage du pAdTrack-CMV. Un gène ou un minigène cloné dans le pAdTrack-CMV est généralement plus efficace pour l’induction d’expression par rapport à l’ADNc^11. Les données ont montré une forte expression de GFP dans les cellules transduites (telles que les hépatocytes, les cellules endothéliales) provenant de diverses sources (humaines, bovines, murines). Le transfert de gènes à médiation adénovirale représente l’un des principaux outils de développement de thérapies géniques modernes.

Protocole

Note de sécurité : En général, les adénovirus sont classés comme des organismes de niveau de biosécurité 2 et, par conséquent, toutes les manipulations doivent être effectuées dans une armoire de biosécurité de classe II par une personne formée, portant un équipement de protection contre les risques biologiques (y compris des gants, un masque facial pour les aérosols biologiques, un sarrau de laboratoire, etc.). Tous les matériaux solides contaminés par l’adénovirus doivent être désinfectés avec une solution d’eau de Javel à 10% pendant 30 min et autoclavés pendant 30 min à 121 °C et 1 bar. Selon le gène inséré, l’adénovirus créé peut avoir un potentiel dangereux et peut être classé dans d’autres niveaux de biosécurité.

1. Préparation expérimentale

1. Utilisez une hotte de culture cellulaire séparée pour les manipulations adénoviraux et un incubateur séparé pour chaque type d’adénovirus. Utiliser des flacons en T avec bouchons filtrants pour l’emballage et l’amplification viraux; éviter autant que possible les expériences de transduction dans les plaques de Petri ventilées.
2. Videz la hotte de culture cellulaire après chaque utilisation et exposez-la aux UV pendant 15 min.
3. Autoclave périodiquement l’aide pipette, pipettes, et d’autres ustensiles. Si possible, culture dans un laboratoire de culture cellulaire/hotte séparé les cellules pour l’emballage adénoviral (cellules AD293) et les cellules à utiliser dans les expériences de transduction. Les lots de différents adénovirus amplifiés au cours de la même période doivent être vérifiés pour la contamination croisée par PCR.
4. Préparez les solutions suivantes.
   1. Préparer le milieu SOB (Super Optimal Broth) : 20 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure, 0,5 g de NaCl (concentration finale de 10 mM), 2,5 mL de 1 M KCl (concentration finale de 2,5 mM), et_H2O à 1 L. Après autoclavage à 121 °C, ajouter les solutions stériles suivantes : 5 mL de 1 M_MgCl2 et 5 mL de 1 M MgSO4.
   2. Préparer le milieu SOC (Super Optimal broth with Catabolite repression) : dans 1 L de SOB stérile, ajouter les solutions stériles suivantes : 20 mL de 1 M de glucose, 5 mL de 1 M_MgCl2, et 5 mL de 1 M MgSO4.
   3. Préparer la solution de précipitation : dissoudre 29,5 g d’acétate de potassium dans 60 mL de_H2O,ajouter 11,5 mL d’acide acétique et_H2O à 100 mL.
   4. Préparer le tampon de remise en suspension : 95 mL de glucose à 20 %, 5 mL de Tris-Cl 1 M pH 8, 4 mL d’EDTA 0,5 M pH 8, et ajouter_H2Oà 200 mL.
   5. Préparer la solution de lyse : 4,8 mL de NaOH 8,3 M, 10 mL de SDS à 20 % et_H2O à 200 mL.

2. Recombinaison du vecteur viral pAdTrack-GFP avec le plasmide pAdEasy-1 dans les bactéries BJ5183

1. Linéarisation de pAdTrack-GFP et purification du plasmide linéarisé.
   1. Préparez le mélange de digestion suivant sur de la glace:
      10 μg de pAdTrack-GFP
      5 μL de tampon incolore 10x
      2 μL de Pme I
      _H2O d’un volume final de 50 μL.
   2. Incuber à 37 °C pendant 3 heures au bain-marie.
   3. Inactiver à 65 °C pendant 20 min.
   4. Vérifier l’efficacité de la digestion de pAdTrack-GFP avec Pme I : faire fonctionner 1 μg du plasmide digéré en parallèle avec 1 μg de plasmide non digéré sur un gel d’agarose à 0,8%.
2. Isolement et purification de l’ADN
   REMARQUE: Les étapes 1 à 6 doivent être effectuées dans une hotte.
   1. Ajouter un volume égal de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) sur le mélange de digestion et inverser le tube jusqu’à ce que le mélange soit homogène.
   2. Centrifuger pendant 3 min à 16 200 x g,puis transférer la phase aqueuse supérieure dans un tube de collecte.
   3. Ajouter un volume égal de phénol/chloroforme/alcool isoamylique (25:24:1) sur la phase organique inférieure et le vortex.
   4. Centrifuger pendant 3 min à 16 200 x g,puis transférer la phase supérieure dans le même tube de collecte.
   5. Ajouter un volume égal de chloroforme sur la phase aqueuse récoltée dans le tube de collecte et le vortex.
   6. Centrifuger pendant 3 min à 16 200 x g,puis transférer la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube de collecte.
   7. Ajouter un volume 1/10 d’acétate de sodium 3 M, et 2 volumes d’éthanol et de vortex froids à 100%.
   8. Incuber pendant 1 heure à -70 °C ou pendant une nuit à -20 °C.
   9. Décongeler l’échantillon sur de la glace et le centrifuger pendant 10 min à 16 200 x g et 4 °C.
   10. Retirer le surnageant et ajouter 750 μL d’éthanol à 75 %.
   11. Centrifuger pendant 3 min à 16 200 x g et 4 °C et retirer le surnageant.
   12. Faites brièvement tourner le tube pour enlever tout le surnageant et sécher le culot dans le capot. Ne séchez pas longtemps la pastille d’ADN car il est difficile de dissoudre.
   13. Dissoudre le culot dans 15 μL de_H2O.
   14. Mesurer la concentration d’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre (p. ex. Nanodrop).
3. Transformation des bactéries AdEasier-1 avec pAdTrack-GFP
   REMARQUE: Dans cette étape, la recombinaison de pAdTrack-GFP avec le plasmide pAdEasy-1 a lieu.
   1. Préparez les bactéries adeasier-1 (contenant du BJ5183 pAdEasy-1, Addgene #16399) chimiquement compétentes, à l’aide d’un kit de transformation commerciale, en suivant les instructions du fabricant. Conserver les aliquotes de bactéries compétentes de 100 μL à -80 °C.
   2. Décongeler une partie aliquote de bactéries AdEasier-1 compétentes sur de la glace et ajouter 1 μg de pAdTrack-GFP digéré pme I purifié. Mélanger doucement en faisant glisser le tube (ne pas pipetter le mélange). Incuber pendant 10 min sur la glace.
   3. Ajouter 900 μL de milieu SOC et incuber pendant 1 heure à 37 °C en secouant.
   4. Microfuge pendant 5 min à 600 x g.
   5. Enlevez 900 μL du surnageant, mélangez la pastille et le surnageant et ensemencez les bactéries transformées sur des plaques de LB-agar avec de la kanamycine.
   6. Incuber pendant environ 16 heures à 37 °C (ne pas dépasser 18 heures).
4. Sélection des clones positifs possibles par PCR
   1. Diviser les cure-dents en deux moitiés et stériliser les demi-cure-dents par autoclavage.
   2. Ramassez de petites colonies translucides à l’aide de demi-cure-dents stériles.
   3. Brièvement, faites pivoter le demi-cure-dent avec des bactéries dans de l’eau de 10 μL (dans un tube PCR), puis mettez le demi-cure-dent dans un tube Eppendorf de 1,5 mL contenant 100 μL de milieu SOC avec de la kanamycine. Incuber pendant 4-6 heures à 37 °C, pendant que vous testez les clones par PCR « négative » et « positive ».
   4. Incuber les tubes PCR contenant 10 μL d’eau avec des bactéries pendant 5 min à 95 °C pour obtenir l’échantillon bactérien et exécuter en parallèle la PCR « négative » et « positive ».
   5. PCR « négative » - pour tester l’intégrité pAdTrack-GFP: Préparez le mélange PCR suivant pour la PCR négative sur la glace.
      5 μL de l’échantillon bactérien
      0,1 μL d’amorce avant (4631 F : 5'-CAGTAGTCGGTGCTCGTCCAG)
      0,1 μL d’amorce inverse (5616 R : 5'-TATGGGGGCTGTAATGTTGTCTC)
      0,1 μL de dNTP 10 mM
      3 μL de tampon 5x
      1,5 μL de MgCl₂ 25mM
      0,1 μL de GoTaq Polymérase
      _H2O jusqu’à un volume final de 15 μL
      REMARQUE: Le contrôle positif dans lequel le modèle d’ADN est le vecteur pAdTrack-GFP doit être inclus.
   6. PCR « positif » - pour tester la présence du gène d’intérêt. Utilisez des amorces spécifiques pour le gène inséré et préparez le mélange comme à l’étape précédente. Les amorces utilisées pour GFP étaient les suivantes :
      F: 5'-CAAGGACGACGGCAACTACA
      R: 5'-ATGGGGGTGTTCTGCTGGTA
   7. Exécutez en parallèle le PCR « négatif » et le PCR « positif ». Le programme PCR est: 5 min, 95 ° C; 40 cycles des étapes suivantes: 30 sec, 95 °C; 30 sec, 68 °C; 1 min, 72 °C; allongement final : 10 min, 72 °C.
      REMARQUE: Adaptez la température de recuit pour amplifier le gène d’intérêt.
   8. Évaluer les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% et faire la sélection des clones.
   9. Envisager un traitement ultérieur des clones qui ne donnent aucun produit de PCR pour la « PCR négative » et le produit de PCR spécifique après la « PCR positive ».
5. Cultiver les cultures bactériennes de clones recombinants sélectionnés
   1. Diluer les cultures des clones présumés positifs (ce qui a donné lieu à l’étape 2.4.3.) dans 4 mL de milieu SOC avec de la kanamycine, et les incuber pendant la nuit à 37 °C en secouant.
6. Isolement de l’ADN plasmidique de la bactérie AdEasier-1 (Miniprep utilisant la lyse alcaline)
   1. Transférer 1,5 mL de culture bactérienne dans des tubes à microcentrifugation, centrifuger pendant 1 min à 16 200 x g, et enlever le surnageant.
   2. Transférer une autre culture bactérienne de 1,5 mL dans le même tube, répéter la centrifugation et retirer le surnageant.
   3. Ajouter 200 μL de tampon de remise en suspension (50 mM de glucose, 10 mM d’EDTA, 25 mM de Tris-HCl pH 8).
   4. Ajouter 200 μL de solution de lyse (NaOH 0,2 N, FDS à 1 %), mélanger doucement en inversant le tube.
   5. Ajouter 200 μL de solution de précipitation (60 mL d’acétate de potassium 5 M, 11,5 mL d’acide acétique glaciaire, ajouter_H2Ojusqu’à 100 mL) et mélanger doucement en inversant le tube.
   6. Centrifuger pendant 3 min à 16 200 x g.
   7. Transférer le surnageant dans un nouveau tube à microcentrifugation, ajouter 500 μL d’isopropanol, mélanger et incuber pendant 20 min sur la glace.
   8. Centrifuger pendant 15 min à 16 200 x g et ajouter 500 μL d’éthanol à 75 %.
   9. Centrifuger pendant 10 min à 16 200 x g et retirer le surnageant.
   10. Centrifuger pendant 3 min à 16 200 x g,retirer le surnageant et ajouter 15 μL de_H2O.
7. Amplification, isolement et nouveau test des plasmides recombinés
   1. Transformation de la bactérie DH5α avec l’ADN isolé des cellules AdEasier-1.
      1. Préparez les bactéries compétentes DH5α à l’aide du kit de transformation commerciale, en suivant les instructions du fabricant.
      2. Décongeler 100 μL de bactéries compétentes DH5α sur la glace, ajouter l’ADN recombinant et incuber 10 min sur la glace. Ensemencez ensuite les bactéries sur des plaques de LB-agar avec de la kanamycine.
      3. Incuber à 37 °C pendant la nuit.
      4. Ramassez plusieurs colonies et cultivez chacune dans 2 mL de milieu LB avec de la kanamycine, à 37 °C, pendant la nuit, avec des secousses.
   2. Isoler l’ADN (Miniprep à l’aide de la lyse alcaline) et ressusciter l’ADN obtenu dans 25 μL_H2O.
   3. Confirmer les clones positifs par digestion enzymatique.
      1. Préparez le mélange suivant sur la glace :
         5 μL d’ADN recombinant
         1,5 μL de tampon incolore 10x
         0,5 μL de Hind III ou Pst I
         _H2O jusqu’à un volume final de 15 μL
      2. Incuber à 37 °C pendant 30 min.
         REMARQUE: En tant que témoin, digérer également les plasmides pAdTrack-GFP et pAdEasy-1.
      3. Dans chaque échantillon, ajoutez 3 μL de tampon de chargement Sx6 avec la RNase A (si la RNase A n’est pas présente dans les tampons de minipréparation).
      4. Exécutez les fragments d’ADN digérés sur électrophorèse sur gel d’agarose à 1%.
         REMARQUE: Le modèle de digestion d’un clone positif comprend la majorité des fragments du plasmide pAdEasy digéré, révélant la recombinaison pAdEasy avec le vecteur pAdTrack. Le gène d’intérêt doit être mis en évidence par la digestion avec les enzymes de restriction utilisées pour le clonage.
   4. Préparation de l’ADN plasmidique (qualité transfection) pour l’emballage des adénovirus.
      1. Cultiver une culture de 200 mL de bactéries à partir d’un clone positif pour isoler l’ADN du plasmide.
      2. Isoler l’ADN plasmidique à l’aide d’une trousse commerciale pour l’ADN plasmidique Midiprep (p. ex. Qiagen Plasmid Midi Kit) en suivant les instructions du fabricant.

3. Emballage des particules adénoviraux

1. Jour 1. Amorcer les cellules AD293
   1. Laver les cellules AD293 avec du PBS et les incuber avec 0,125% de trypsine pendant 2-5 min à 37 °C.
   2. Recueillir les cellules en milieu froid avec du sérum.
   3. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g à 4 °C.
   4. Ressusciter les cellules en milieu avec du sérum et ensemencer les cellules à une densité d’environ 2 x 10⁶/T25 fiole. De préférence, utilisez un ballon avec un filtre.
2. Jour 1. Digérer l’ADN recombinant avec pac I
   1. Préparez le mélange suivant :
      6 μL d’ADN recombinant (1 μg/μL)
      2 μL de Pac I
      2,5 μL de tampon incolore 10x
      _H2O jusqu’à un volume final de 25 μL
   2. Incuber pendant 3 h (ou pendant une nuit) à 37 °C, puis inactiver l’enzyme à 65 h C pendant 20 min.
   3. Précipitation de l’ADN avec de l’éthanol : ajouter 2,5 μL d’acétate de sodium (1/10 v/v) 3 M et 2 à 3 volumes d’éthanol à 100 %. Incubation pendant 30 min à -70 °C ou pendant la nuit à -20 °C.
   4. Centrifuger à 16 200 x g pendant 30 min à 4 °C et ressusciter la pastille dans de l’eau stérile.
3. Jour 2 : Transfection de cellules AD293 à l’aide d’un réactif K2
   1. Ajouter 40 μL de multiplicateur K2 sur les cellules, deux heures avant la transfection.
   2. Préparer des solutions A et B :
      Solution A : Ajouter 6 μg d’ADN l-linéarisé pac dans 260 μL d’Opti-MEM.
      Solution B : Ajouter 21,6 μL de réactif K2 dans 248,4 μL d’Opti-MEM.
   3. Ajouter la solution A sur la solution B et mélanger doucement par pipetage.
   4. Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante. Ajoutez le mélange A et B goutte à goutte aux cellules.
4. Jour 3-11: Surveiller l’expression de la GFP par microscopie à fluorescence
   REMARQUE: Les cellules doivent apparaître vertes en microscopie à fluorescence et doivent se détacher progressivement.
5. Jour 11: Récoltez les particules adénoviraux F1
   1. Recueillir les cellules détachées et le milieu dans un tube de 50 mL, gratter les cellules adhérentes et les ajouter dans le même tube.
   2. Centrifuger pendant 5 min à 400 x g, recueillir le surnageant dans un nouveau tube et ressusciter le culot cellulaire dans 0,5 mL de PBS.
   3. Perturbation cellulaire
      1. Transférer la suspension cellulaire dans un tube à microcentrifugation.
      2. Effectuer trois cycles de gel/dégel (gel dans l’azote liquide ou à -80 °C/dégel à 37 °C pendant au maximum 7 min).
      3. Passez les cellules brisées à travers une aiguille de seringue de 23 G trois fois.
   4. Enlever les débris cellulaires par centrifugation à 9 600 x g pendant 12 min.
   5. Transférer le surnageant dans le tube de 50 mL avec le milieu collecté.

4. Amplification de l’adénovirus

NOTA : Si les cellules AD293 n’ont pas atteint la confluence nécessaire, les aliquotes des stocks adénoviraux (lysat obtenu à partir des cellules productrices du virus) à utiliser pour l’infection peuvent être stockées à -80 °C.

1. Préparez les particules adénoviraux F2.
   1. Ensemencez les cellules AD293 dans une fiole T75 (5 x 10⁶ cellules/fiole).
   2. Infecter environ 90% des cellules AD293 confluentes à l’aide des particules adénovirales F1: ajouter l’homogénat cellulaire et le milieu de la fiole T25 sur les cellules cultivées dans la fiole T75.
   3. Surveiller l’expression de la GFP par microscopie à fluorescence.
   4. Récoltez les cellules productrices de virus lorsque ~ 90% de l’AD293 transducé sont détachés (~ le^{5 e} jour après la transduction). Maintenir le milieu de culture cellulaire à 4 °C.
   5. Perturber les cellules (de même que celles de F1) dans 1 mL PBS.
2. Préparez les particules adénoviraux F3.
   1. Infecter ~ 90% des cellules AD293 confluentes ensemencées dans une fiole T175 avec des particules adénovirales F2 et le milieu de culture cellulaire des particules adénovirales F2.
   2. Récoltez les cellules (~ 5 jours après la transduction).
   3. Perturber les cellules (de même que celles de F1) dans 2 mL de PBS.
3. Préparez les particules adénoviraux F4.
   1. Infecter 5 flacons T175 contenant environ 90% de cellules AD293 confluentes avec des particules adénovirales F3 et un milieu de culture cellulaire.
   2. Récoltez les cellules (~ 5 jours après la transduction).
   3. Perturber les cellules (de même que celles de F1) dans 3 mL de PBS.
4. Préparez les particules adénoviraux F5.
   1. Infecter 25 fioles T175 contenant environ 90% de cellules AD293 confluentes avec le stock adénoviral F4 et le milieu de culture cellulaire.

5. Purification de l’adénovirus à partir du lysat cellulaire et du milieu de culture

1. Récolte des cellules productrices du virus et du milieu de culture.
   1. Récolter les cellules AD293 de F5 après 5 jours de transduction.
   2. Conservez le milieu dans une bouteille stérile pour la précipitation des particules adénoviraux.
      REMARQUE: Conserver le milieu au réfrigérateur jusqu’à la purification de l’adénovirus.
   3. Centrifuger les cellules à 400 x g, pendant 5 min, à 4 ^°C.
   4. Ressusciter la pastille finale dans 5 mL de Tris HCl 10 mM, pH 8 avec 2 mM_MgCl2.
   5. Aliquote la suspension dans des tubes de 1,5 mL.
   6. Perturber les cellules (de même que celles de F1) : trois cycles de congélation/décongélation.
      NOTA : Si l’ultracentrifugation ne peut pas être effectuée immédiatement, maintenir les échantillons à -80 °C.
   7. Passez la suspension cellulaire à travers une aiguille de seringue 23G pendant trois fois.
   8. Centrifuger l’homogénat à 9 600 x g, pendant 12 min.
   9. Conservez le surnageant pour la purification de l’adénovirus par ultracentrifugation par gradient CsCl.
2. Précipitation de l’adénovirus libéré dans le milieu de culture.
   1. Apportez la bouteille avec un milieu de culture cellulaire enregistré à température ambiante.
   2. Ajouter 121 g de sulfate d’ammonium à chaque 500 mL de milieu de culture cellulaire (la saturation de la solution doit être comprise entre 40 et 42%).
   3. Mélanger soigneusement jusqu’à ce que le sulfate d’ammonium soit complètement dissous.
   4. Incuber pendant au moins 2,5 heures à température ambiante.
   5. Centrifuger à 1600 x g, pendant 15 min, à 22 ^°Cet conserver la pastille.
   6. Ressusciter la pastille dans 4 mL de Tris HCl 10mM pH 8 avec 2mM_MgCl2; cette suspension doit être purifiée immédiatement par ultracentrifugation à gradient CsCl.
      REMARQUE : Si l’étape de purification ne peut être réalisée par la suite, dialysez pendant une nuit la pastille remise en suspension contre 10mM tris HCl, pH 8 avec 2mM_MgCl2.
3. Purification des adénovirus par ultracentrifugation.
   1. Préparer un gradient CsCl discontinu dans des tubes en polypropylène pour le rotor SW41Ti. Ajouter 3 mL de CsCl à 765 mg/mL (haute densité : 1,4 g/L) au fond du tube. Ajouter lentement 3 mL de CsCl de 288,5 mg/mL (faible densité : 1,2 g/L) au-dessus de la première couche de CsCl.
   2. Superposer délicatement 3 à 4 mL de suspension de particules adénovirales libérées par les cellules ou précipitées du milieu de culture cellulaire (tel que décrit précédemment) au-dessus du gradient.
   3. Remplissez les tubes d’huile minérale et mettez les tubes dans les seaux SW41Ti froids.
   4. Équilibrer les tubes. Assurez-vous que les tubes en polypropylène remplis sont chargés symétriquement dans le rotor. Mettez le rotor dans l’ultracentrifuge.
   5. Centrifuger à 210 000 x g et 4 °C, pendant 18 heures, sans frein.
   6. Placez les tubes ultracentrifuges sur un support avec un papier noir derrière pour obtenir les bandes.
   7. Jetez la phase supérieure claire, les débris cellulaires et la bande supérieure dans un conteneur à déchets avec la solution de blanchiment.
   8. Récolter la bande la plus basse qui contient l’adénovirus complet (~700 μL - 1 mL) dans un tube stérile de 1,5 mL et le garder sur la glace.
   9. Pré-mouiller une cassette de dialyse dans un tampon de dialyse (tampon Tris-Cl 10 mM pH 8, 2 mM_MgCl2).
   10. Injecter l’adénovirus purifié dans la cassette de dialyse à l’aide d’une seringue de 2 mL.
   11. Dialyser pendant la nuit contre 10 mM de tampon Tris-Cl pH 8, 2 mM_MgCl2 (changer le tampon de dialyse 3 à 4 fois).
   12. Récolter le stock adénoviral de la cassette de dialyse dans des aliquotes de 10 à 100 μL.
   13. Ajouter du saccharose à une concentration finale de 4 % aux aliquotes virales (pour la cryoprotection).
   14. Conserver les aliquotes à -80 °C.

6. Titrage des adénovirus

1. Jour 1: Placage des cellules
   1. Ensemencez les cellules AD293 à une densité de 2,5 × 10⁵ cellules par puits (dans une plaque de culture de 12 puits) dans un milieu de croissance complète de 1 mL, comme le montre la figure 2. Assurez-vous que les cellules sont réparties uniformément dans chaque puits pour une détermination précise du titre.

Figure 2 : Conception de la plaque de titrage. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. Jour 2 : Transduction des cellules
   1. Détachez les cellules d’un puits avec de la trypsine et comptez-les. Notez ce nombre car il sera utilisé pour calculer le titre viral.
   2. Effectuer des dilutions en série (1/10⁴; 1/10⁵; 1/10⁶; 1/10⁷) du stock viral dans 1 mL de milieu de croissance complet comme suit :
   3. 1/10³: dilution du stock de virus - ajouter 2 μL de stock viral à 1998 μL de milieu complet.
   4. 1/10⁴: Faire dilution 1:10 de 1/10³ par dilution de 120 μL à 1080 μL de milieu complet (A).
   5. 1/10⁵: Faire dilution 1:10 de B en diluant 120 μL de A à 1080 μL de milieu complet (B).
   6. 1/10⁶: Faire dilution 1:10 de C en diluant 120 μL de B à 1080 μL de milieu complet (C).
   7. 1/10⁷: Faire dilution 1:10 de D par dilution de 120 μL de C à 1080 μL de milieu complet (D).
      NOTA: Préparer 3 tubes de chaque dilution (A, B, C, D) pour effectuer l’expérience en trois exemplaires.
   8. Retirer le milieu de culture cellulaire des puits et ajouter les dilutions préparées du virus, comme le montre la figure 2.
3. Jour 3 : Surveillance de l’expression GFP
   1. Vérifiez les puits pour la présence de cellules vertes à l’aide d’un microscope à fluorescence.
4. Jour 4 : Analyse cytométrique en flux de cellules GFP-positives
   1. Préparer et étiqueter douze tubes de 1,5 mL.
   2. Recueillir le milieu de culture cellulaire (avec les cellules détachées) dans des tubes de 1,5 mL et les garder sur la glace.
   3. Ajouter 200 μL de trypsine dans chaque puits.
   4. Incuber la plaque pendant 2 à 3 min à 37 °C dans l’incubateur à CO_2.
   5. Récoltez les cellules dans les mêmes tubes Eppendorf avec le milieu de culture cellulaire. Gardez les tubes sur la glace.
   6. Granuler les cellules à 400 x g, pendant 5 min, à 4 °C.
   7. Retirez le surnageant; garder les tubes sur la glace.
   8. Remise en suspension de la pastille dans 250 μL de PBS + 2 % de FBS; garder les tubes sur la glace.
   9. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes ou une plaque de cytométrie en flux.
   10. Exécuter les échantillons sur un cytomètre de flux enregistrant la fluorescence des cellules exprimant la GFP.
       Calcul du titre: Les échantillons avec 5 à 20% de cellules GFP positives de la population mère doivent être pris en compte pour le calcul du titre viral à l’aide de la formule suivante:
       Titre (TU/mL) = D x F/100 x C/V
       D = facteur de dilution
       F = pourcentage de cellules positives / 100
       C = nombre de cellules / puits
       V = volume d’inoculum viral

7. Transduction adénovirale des cellules cibles et test de l’expression induite des protéines

1. Jour 1: Ensemencement des cellules
   1. Ensemencer les cellules cibles en veillant à ce qu’elles soient réparties uniformément dans les puits.
2. Jour 2: Transduction des cellules
   1. Détachez les cellules cibles d’un puits et comptez-les.
   2. Calculer le volume approprié de suspension adénovirale nécessaire pour transduire les cellules avec le nombre désiré de particules infectieuses par cellule.
   3. Ajoutez la quantité correspondante de suspension virale aux cellules cibles.
3. Jour 3: Retrait de la suspension virale et vérification de l’expression de la GFP
   1. Remplacer le milieu de culture cellulaire contenant des particules adénoviraux par un milieu frais.
   2. Vérifiez l’expression GFP au microscope à fluorescence.

Résultats

Nous avons modifié et amélioré le protocole original de Vogelstein afin d’atteindre une production d’adénovirus plus rapide et plus efficace. Tout d’abord, nous avons révisé la méthodologie pour obtenir une sélection plus facile des recombinants. Après recombinaison, les clones bactériens BJ5183 ont été testés par « PCR négative » pour évaluer l’intégrité de pAdTrack-GFP comme indicateur de l’absence de recombinaison(figure 3A),ou par « PCR positive » pour identifier le gène d’intérêt, assimilé dans notre cas à la GFP(Figure 3B). Dans les PCR « négatifs » et « positifs », nous avons utilisé pAdTrack-GFP comme modèle de contrôle, ce qui donnait une bande de 986 pb pour l’intégrité de pAdTrack(Figure 3A,voie 1), et une bande de 264 pb pour GFP(Figure 3B,voie 3). Les amorces utilisées pour la « PCR négative » ont été conçues pour amplifier un fragment de 986 pb contenant le site PmeI dans pAdTrack-GFP. Ce fragment d’ADN est considérablement agrandi après recombinaison et n’est pas amplifié dans les clones recombinants positifs. Les clones négatifs pour la recombinaison, dans lesquels pAdTrack-GFP est resté intact, sont représentés dans la figure 3A,les voies 3, 4 et 6. Les amorces recuit sur les séquences d’ADN adjacentes au site de recombinaison. Les clones recombinants positifs potentiels(figure 3A,voies 2 et 5) ont exprimé la GFP, comme le montre la figure 3B,les voies 1 et 2. L’ADN plasmidique de ces clones a été isolé et utilisé pour la transformation du DH5α afin d’obtenir une plus grande quantité d’ADN. Ces plasmides recombinants présélectionnés amplifiés dans le DH5α ont ensuite été testés par digestion enzymatique. Sur la figure 3C-E sont illustrés les résultats de la digestion enzymatique d’un clone recombinant positif digéré avec des enzymes de restriction Hind III, PstI, BamHI(figure 3C, D, E voie 2). Les modèles de digestion HindIII et PstI du clone recombinant étaient similaires à ceux obtenus pour pAdEasy-1 puisque HindIII et PstI ont coupé le plasmide pAdEasy-1 24 et 25 fois, respectivement ,(Figure 3C et D, voie 3) ; HindIII couper une fois et PstI couper quatre fois le vecteur pAdTrack-GFP(Figure 3C et D,voie 1). BamHI coupe deux fois le vecteur pAdEasy-1(Figure 3C,voie 3), et une fois pAdTrack-GFP(Figure 3C,voie 1).

PacI a découpé un fragment de 4,5 kb du plasmide recombinant(figure 3F,voie 2), un fragment de 2863 pb de pAdTrack-GFP(figure 3F,voie 1), et linéarisé le vecteur pAdEasy-1(figure 3F,voie 3). L’échelle d’ADN est représentée à la figure 3C-F,dans les voies 4. Le plasmide de recombinaison a été digéré avec pac I pour une utilisation ultérieure pour la transfection AD293.

Figure 3 : La recombinaison de pAdTrack-GFP avec le plasmide pAdEasy-1. Les plasmides obtenus après la recombinaison de pAdTrack-GFP et de pAdEasy-1 ont été testés par PCR « négative » pour l’intégrité pAdTrack-GFP (A). Les clones non recombinants ont été mis en évidence par la présence d’une bande de 986 pb correspondant à la séquence amplifiée à partir du plasmide pAdTrack-GFP (A, voies 3, 4 et 6). Les clones potentiellement positifs pour la recombinaison (A, voies 2 et 5) ont été également obtenus. Lorsque le vecteur pAdTrack-GFP a été utilisé comme modèle, une bande de 986 pb pour pAdTrack-GFP (A, voie 1) a été obtenue. Les clones recombinants potentiellement positifs ont été testés pour l’expression de GFP par PCR « positive » (B); une bande de 264 pb apparaît pour les deux clones potentiellement recombinés (B, voies 1 et 2), ainsi que pour le plasmide pAdTrack-GFP. L’ADN d’un clone recombinant potentiel a été testé avec HindIII, PstI, BamHI, et l’enzyme de restriction PacI (C-F, voies 2). Dans les témoins, le vecteur pAdEasy-1 (C-F, voies 3) et le plasmide pAdTrack-GFP (C-F, voies 1) ont été digérés avec les mêmes enzymes. L’échelle d’ADN est représentée dans la voie C-F 4. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

L’emballage et l’amplification adenoviral ont été exécutés en cellules AD293. Les particules adénovirales (AdV-GFP) ont été purifiées à partir du lysat cellulaire AD293 ainsi que du milieu de culture cellulaire, où elles avaient été libérées par les cellules infectées. Pour concentrer l’adénovirus présent dans le milieu de culture cellulaire, les particules ont été précipitées avec du sulfate d’ammonium puis remises en suspension dans 10 mM de Tris HCl pH 8 avec 2 mM de_MgCl2,le même tampon que celui utilisé pour la lyse cellulaire. Par la suite, les particules adénoviraux du lysat cellulaire et du milieu de culture ont été purifiées par ultracentrifugation discontinue de gradient CsCl. Après ultracentrifugation, une forte bande d’AdV-GFP purifié a été obtenue, comme le montre la figure 4.

Ill. 4 : Purification adénovirale par ultracentrifugation sur un gradient CsCl discontinu. L’homogénat cellulaire et l’adénovirus précipité du milieu ont été soumis à l’ultracentrifugation sur un gradient discontinu formé par des solutions CsCl basses et à haute densité. Des bandes fortes de gfp- adénovirus ont été prouvées dans les deux cas. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Pour déterminer le titre viral exprimé en unités de transduction par un mL (TU/mL), les cellules AD293 ont été infectées par des dilutions périodiques de l’AdV-GFP. Après 48 heures, les cellules infectées ont exprimé la GFP, dans une corrélation inverse avec le facteur de dilution de la suspension virale. Ceci a été observé par microscopie à fluorescence et le pourcentage de cellules GFP-positives a été déterminé par cytométrie de flux (Figure 5). Pour calculer le titre, la dilution virale qui a induit 5 à 20% des cellules GFP-positives a été considérée (Figure 5C). Habituellement, nous obtenons un titre viral d’environ 10¹⁰ (TU/mL) pour l’adénovirus de la GFP.

Ci-dessous, nous fournissons un exemple de calcul de titre adénoviral pour un lot adénoviral spécifique dans lequel 300000 cellules (C) ont été transduites avec une solution adénovirale de 1 mL (V), à un facteur de dilution de 10⁶ (D), pour lequel 6% de cellules GFP-positives (F) ont été obtenues:

Titre (TU/mL) = D x F/100 x C/V = 10⁶ x 6/100 x 300000/1 = 1,8 x 10¹⁰ TU/mL

Figure 5 : Évaluation du titre adénoviral. Des cellules AD293 ont été infectées avec de diverses dilutions adenoviral. Quarante-huit heures plus tard, on a observé les cellules par microscopie de fluorescence et analysées par cytometry d’écoulement pour déterminer le pourcentage de cellules positives de GFP induites par différentes dilutions adenoviral (A-D). Pour établir la porte pour la cytométrie d’écoulement, des cellules non-transduites ont été également analysées (E). Le titre calculé pour le facteur de dilution 10^6,quand 6% des cellules étaient positives de GFP était 1.8 x 10¹⁰ TU/mL. Pour les panneaux A-E, barres: 100μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Pour tester le potentiel de transduction de l’adénovirus préparé, quatre variétés de cellule ont été employées : cellules endothéliales humaines (EA.hy926), cellules endothéliales aortiques bovines (BAEC), hépatocytes murins (Hepa 1-6), et cellules stromal mésenchymateuses murines (MSC). Des cellules endothéliales (EA.hy926 et BAEC) ont été transduites avec 25 TU/cellule, les hepatocytes ont été transduites avec 5 TU/cellule et MSC ont été transduites avec 250 TU/cellule.

Voici un exemple de la façon dont le volume de la suspension adenoviral nécessaire pour infecter 3 x 10⁶ cellules avec 25 TU/cellule, utilisant la suspension adenoviral avec 1.8 x 10¹⁰ TU/mL, a été calculé.

Pour 1 cellule .............. 25 TU
3 x 10⁶ cellules .............. x TU x = 75 x 10⁶ TU
Si le stock viral contient
1,8 x 10¹⁰ TU .............. 1 mL
75 x 10⁶ TU .............. y mL y = 4,2 x 10^-3 mL = 4,2 μL de stock viral

Quarante-huit heures après transduction, les cellules ont été analysées par microscopie de fluorescence. Comme le montre la figure 6,les cellules endothéliales humaines ou bovines ont été transduites avec une bonne efficacité (~50 %) pour 25 TU/cellule(figure 6 EA.hy926 et BAEC). Les hépatocytes murins (Hepa 1-6) ont été efficacement transduites par l’adénovirus à une faible quantité de particules d’adénovirus (5 TU/cellule), mais ils sont également sensibles à l’adénovirus puisqu’un pourcentage plus élevé de cellules mortes (cellules PI-positives) a été enregistré (~16%) par rapport aux autres types de cellules. Les cellules stromales mésenchymateuses étaient les plus difficiles à transduire (Figure 6), en raison du manque de récepteurs adénoviraux spécifiques (données inédites).

Ill. 6 : L’infectiosité de l’adénovirus et l’induction de l’expression de la GFP dans les cellules transduites. Les cellules endothéliales humaines (EA.hy926), les cellules endothéliales aortiques bovines (BAEC), les hepatocytes murins (Hepa 1-6), et les cellules stromal mesenchymal murines (MSC) ont été transduites avec la quantité indiquée d’adénovirus. GFP a été détecté par microscopie de fluorescence et le pourcentage des cellules positives de GFP a été analysé par l’écoulement cytometry. Les cellules PI-positives déterminées par cytométrie de flux montrent la mortalité cellulaire déterminée par transduction virale. Ea.hy926 cellules, cellules endothéliales aortiques bovines, et cellules Hepa 1-6 ont été fortement transduites par l’adénovirus, le rendement de la transduction s’étendant de 41 - 52%. Pour msc, une plus grande quantité de virus (250 TU/cellules) a induit seulement 27% GFP positif des cellules transduites. Barres: 100μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Les adénovirus recombinants sont un outil polyvalent pour la livraison et l’expression des^{gènes 12,13,14.} Pour induire une forte expression protéique par transduction adénovirale, la séquence codante du gène d’intérêt est insérée dans le génome de l’adénovirus. Le système adénoviral AdEasy, développé dans le laboratoire de Bert Vogelstein, comprend un plasmide de squelette (pAdEasy-1) contenant la majeure partie du génome de l’adénovirus de type sauvage sérotype 5, et un vecteur navette (pAdTrack), conçu pour le clonage de gènes^2,10. La suppression des gènes adénoviraux E1 (responsable de l’assemblage des particules virales infectieuses) et E3 (codant pour les protéines impliquées dans l’évasion de l’immunité de l’hôte) a créé un espace dans le génome adénoviral, dans lequel un gène d’intérêt de 6,5-7,5 kb peut être inséré^2,3. Cette taille est suffisante pour de nombreux gènes, en particulier pour ceux qui ont des introns plus courts^15,16,17. Il y a aussi des chercheurs rapportant la production d’adénovirus porteurs de l’ADNc d’un transgène^18,19,20. Cependant, nous avons obtenu un rendement plus faible d’expression de transgène pour les adénovirus porteurs d’ADNc que pour leurs homologues porteurs d’un gène ou d’un mini-gène (données non montrées).

L’amélioration et l’adaptation des méthodes précédentes^{2,10,14,18,21,}la technologie de production adénovirale nécessite un temps plus court, un coût inférieur et moins d’efforts. L’ADN adénoviral pleine longueur est obtenu par recombinaison entre le vecteur navette et le plasmide pAdEasy-1 dans la souche E. coli sujette à la recombinaison homologue, BJ5183. Le protocole implique la transformation chimique des cellules AdEasier-1 (bactéries BJ5183 contenant pAdEasy-1). Cette technique ne nécessite pas d’électroporateur qui peut ne pas être disponible dans certains laboratoires, est très simple, augmente le rendement de recombinaison et réduit le temps nécessaire pour obtenir des cellules compétentes et effectuer la transformation. La présélection des clones recombinants effectuée par PCR raccourcit encore le temps et facilite l’ensemble de la procédure. Une procédure similaire a été utilisée par Zhao et ses collègues²², cependant, dans le protocole, nous avons optimisé les séquences des amorces.

Pour l’emballage et l’amplification de l’adénovirus GFP, une lignée cellulaire dérivée hek293 a été utilisée, à savoir les cellules AD293, qui sont plus adhérentes à la plaque de culture. D’autres lignées cellulaires couramment utilisées pour la production adénovirale sont les suivantes: 911, 293FT, pTG6559 (dérivé A549), PER. C6 (son dérivé), GH329 (dérivé HeLa), N52. E6, et HeLa-E1^23,24,25,26. Dans nos mains, aucune amélioration de la production adénovirale n’a été obtenue quand 911 cellules ont été employées (données non montrées). La transfection des cellules AD293 avec le plasmide recombinant utilisant le réactif K2 a fortement augmenté l’efficacité de l’étape d’emballage viral. Après la production d’adénovirus, jusqu’à ~ 70% de l’adénovirus est encore à l’intérieur des cellules et est libéré par trois cycles de congélation et de décongélation. Augmenter le nombre de cycles ne convient pas car cela détruit l’adénovirus.

Tout au long du processus de production adénovirale de routine, de nombreuses particules virales sont libérées dans le milieu de culture cellulaire. L’élimination de ce milieu de culture cellulaire pendant la récolte des cellules AD293 infectées entraînerait une perte virale importante. Nous avons optimisé le protocole décrit par Schagen et ses collègues pour purifier les particules adénoviraux du milieu de culture cellulaire par précipitation avec du sulfate d’ammonium^27. Cette méthode a une plus grande efficacité dans la récupération de l’adénovirus à partir du milieu de culture cellulaire par rapport à la méthode utilisant le polyéthylène glycol^28. L’adénovirus précipité doit être purifié immédiatement par ultracentrifugation ou conservé au réfrigérateur pendant quelques jours, mais seulement après dialyse, pour éliminer l’excès de sel. Garder le précipité plus de quelques heures sans dialyse est nocif pour le virus.

La purification des particules adénoviraux par ultracentrifugation réalisée en une seule étape réduit la manipulation du stock adénoviral et facilite la procédure par rapport aux protocoles utilisant les étapes successives d’ultracentrifugation^14,29. La dialyse de l’adénovirus purifié est nécessaire pour éliminer le chlorure de césium qui peut affecter davantage la transduction. Dans le protocole, nous avons utilisé un tampon Tris contenant mgCl₂ mais pas de saccharose pour la dialyse, car il nécessite une quantité énorme et injustifiée de saccharose qui est nécessaire autrement comme conservateur pour la congélation. Ainsi, nous avons ajouté du saccharose plus tard, directement dans les stocks adénoviraux préparés pour la congélation. Pour éviter la congélation et le dégel fréquents de l’adénovirus purifié, il est conseillé d’aliquoter les stocks adénoviraux et de les stocker à -80 °C. Le titre adenoviral a été évalué par l’écoulement cytometry considérant le gène de rapporteur de GFP et le pourcentage de cellules transduites pour une dilution virale spécifique. Cette méthode est plus rapide par rapport au « dosage de la plaque » classique et est plus confiante par rapport à l’évaluation des protéines de la capside (par diverses méthodes telles que ELISA ou cytométrie en flux) qui ne révèle pas la capacité d’infection des particules adénovirales. Cependant, la quantification basée sur ELISA, la Q-PCR ou l’analyse de plaque à l’aide de kits disponibles dans le commerce sont des méthodes alternatives, particulièrement utiles pour le titrage des adénovirus qui ne contiennent pas de traceur fluorescent.

Considérant que les adénovirus pAdTrack sont dérivés du sérotype 5 des adénovirus humains qui est reconnu par les récepteurs coxsackievirus et adénovirus (CAR), nous avons démontré la capacité du GFP-adénovirus à transduire des cellules d’origine humaine (cellules endothéliales), mais aussi des cellules d’autres origines : bovine (cellules endothéliales) et murine (cellules stromales mésenchymateuses et hépatocytes). Les données ont montré que le GFP-adénovirus peut induire un niveau élevé d’expression d’un transgène.

En conclusion, nous avons optimisé cette technologie laborieuse pour réduire le temps, les coûts et l’effort nécessaire pour obtenir les particules adénoviraux. L’adénovirus préparé est capable d’infecter divers types de cellules et d’induire l’expression du gène d’intérêt. Ce protocole peut être employé dans une série d’expériences puisque le transfert adénoviral-négocié de gène représente l’un des principaux outils pour développer des thérapies géniques modernes.

ABRÉVIATIONS : AdV-GFP, particules adénoviraux; BAEC, cellules endothéliales aortiques bovines; CsCl, chlorure de césium; GFP, protéine fluorescente verte; MSC, cellules stromales mésenchymateuses; TU, unités de transduction.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
AD293 cellules	Agilent Technologies	240085
AdEasier-1 cellules	Addgene	16399
Agarose I (pour électrophorèse)	Thermo Scientific	17850
Sulfate d’ammonium	Sigma	A4418
Ampicilline sel sodique	Sigma	A0166
BamH I	Thermo Scientific	FD0054
Plaques de culture cellulaire 100 mm	Eppendorf	30702115
Chlorure de césium	Sigma	L4036
DH5alpha bactéries	Thermo Scientific	18265017
DMEM (GlutaMAX, 4.5g/L D-Glucose)	Gibco	3240-027
EA.hy926 cellules	ATCC	CRL-2922
EDTA	Sigma	E5134
Éthanol (99.8 %)	Roth	5054.2
Sérum de veau fœtal	Sigma	F7524
Fioles T25, T75, T175	Eppendorf	30712129
Glucose	Sigma	G7021
Hepa 1-6 hépatocytes murins	ATCC	CRL-1830
Hind III	Thermo Scientific	FD0504
Sulfate de Kanamycine	Thermo Scientific	15160054
Système de transfection K2	Biontex	T060-5.0
LB medium	Formedium	LBx0102
LB-agar	Formedium	LBx0202
Mix & Go E. coli Kit de transformation	Zymo Research	T3001
Midori Green Advanced DNA stain	Nippon Genetics Europe	MG-04
NaOH	Sigma	S8045
Opti-MEM	Thermo Scientific	31985070
Pac I	Thermo Scientific	FD2204
pAdEasy-1	Addgene	16400
pAdTrack-CMV	Addgene	16405
Phénol :chloroforme :alcool isoamylique (24:24:1)	Invitrogen	15593-031
Polymérase GoTaq	Promega	M3005
Pme I (Mss I)	Thermo Scientific	FD1344
Acétate de potassium	VWR Chemicals	43065P
Pst I	Thermo Scientific	FD0614
Qiagen Midi Prep kit	Qiagen	12125
Racleur de cellules	TPP	99003
SDS	Thermo Scientific	28365
Slide-A-Lyzer cassettes de dialyse	Thermo Scientific	66330
Pyruvate de sodium	SIGMA	P5280-100G
Seringue avec 23G neeedle	B Braun	464BR
Tris HCl	Sigma	1185-53-1
Trypan blue	Roth	CN76.1
Tubes 50ml	TPP	91050
Tubes Ultra-Clear (14x89 mm)	Beckman Coulter	344059
Centrifugeuse (réfrigérée)	Sigma Sartorius	3-19KS
HeraeusFresco 17 Microcentrifugeuse	Thermo Scientific	75002420
Ultracentrifugeuse avec rotor SW41Ti	Beckman Coulter	Optima L-80 XP
Capot de culture	Thermo Scientific	Classe II
Pipettes (0-2µ ; l, 1-10 et micro ; L, 2-20µ ; l, 10-100 et micro ; l, 20-200µ ; l, 100-1000 et micro ; l)	Thermo Scientific
Dry Block Heating Thermostat	Biosan	TDB-120
Thermocycle	SensoQuest	012-103
Bain-marie	Memmert	WNB 14