Dépistage in Vivo CRISPR/Cas9 pour évaluer simultanément la fonction génétique dans la peau de la souris et la cavité buccale

Résumé

Ici nous décrivons une méthodologie rapide et directe de criblage d’in vivo CRISPR/Cas9 utilisant des injections lentiviral embryonnaires ultrason-guidées dans utero pour évaluer simultanément des fonctions de plusieurs gènes dans la peau et la cavité buccale des souris immunocompétentes.

Résumé

Les modèles de souris génétiquement modifiés (GEMM) ont joué un rôle déterminant dans l’évaluation de la fonction génétique, la modélisation des maladies humaines et le modèle préclinique d’évaluation des avenues thérapeutiques. Cependant, leur nature de temps, de travail et de coût-intensive limite leur utilité pour l’analyse systématique de la fonction de gène. Les progrès récents des technologies d’édition du génome surmontent ces limitations et permettent la génération rapide de perturbations génétiques spécifiques directement dans des organes de souris spécifiques d’une manière multiplexée et rapide. Ici, nous décrivons une méthode basée sur CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) pour générer des milliers de clones knock-out génétiques dans l’épithélium de la peau et de la cavité buccale des souris, et fournir un protocole détaillant les étapes nécessaires pour effectuer un écran CRISPR in vivo direct   pour les gènes suppresseurs de tumeurs. Cette approche peut être appliquée à d’autres organes ou à d’autres technologies CRISPR/Cas9 telles que CRISPR-activation ou CRISPR-inactivation pour étudier la fonction biologique des gènes pendant l’homéostasie tissulaire ou dans divers contextes de maladies.

Introduction

L’un des défis de la recherche sur le cancer à l’ère postgénomique est d’extraire la grande quantité de données génomiques pour les mutations génétiques causales et d’identifier les nœuds du réseau génétique qui peuvent être ciblés thérapeutiquement. Alors que les analyses bioinformatiques ont énormément contribué à atteindre ces objectifs, l’établissement de modèles in vitro et in vivo efficaces est une condition préalable pour déchiffrer la complexité des systèmes biologiques et des états de la maladie et pour permettre le développement de médicaments. Alors que les modèles conventionnels de souris transgéniques ont été largement utilisés pour les études génétiques in vivo sur le cancer, leur nature à forte intensité de coût, de temps et de main-d’œuvre a largement interdit l’analyse systématique des centaines de gènes du cancer putatifs démêlés par la génomique moderne. Pour surmonter ce goulot d’étranglement, nous avons combiné une méthodologie d’injection in utero guidée par ultrasons^{précédemment établie 1,2} avec une technologie d’édition de gènes CRISPR/Cas9 (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)³ pour induire et étudier simultanément des mutations de perte de fonction de centaines de gènes dans la peau et la cavité buccale d’une seule souris.

La méthodologie décrite ici utilise des injections guidées par ultrasons de lentivirus modifiés dans la cavité amniotique des embryons vivants de souris au jour embryonnaire E9.5. La cargaison lentivirale contenant des composants CRISPR/Cas9 transduisent l’ectoderm de surface à une seule couche, ce qui donne plus tard naissance à l’épithélium de la peau et de la cavité buccale. La peau est composée d’un épiderme externe, suivi d’une membrane et d’un derme du sous-sol. Epidermis est un épithélium stratifié composé d’une couche interne basale, qui maintient le contact avec la membrane du sous-sol et a une capacité proliférative et de cellules souches. La couche basale donne lieu aux couches différenciées ci-dessus telles que les couches de cornée épineuses, granulaires et stratiques^2,4. Les études de traçage de lignée ment montrent que cette méthode directe in vivo CRISPR/Cas9 manipule génétiquement les cellules souches résidentes des tissus dans la couche basale qui persistent tout au long de l’âge adulte. Comme le lentivirus peut être titré pour transduire l’ectoderme de surface E9.5 à la densité clonale, cette méthode peut être utilisée pour générer des souris mosaïques hébergeant des milliers de clones discrets knock-out gène. Le séquençage de prochaine génération peut ensuite être utilisé pour analyser l’effet de l’ablation des gènes crispr/cas9 dans ces clones d’une manière multiplexée⁵.

Nous avons récemment utilisé cette méthode pour évaluer la fonction de 484 gènes qui montrent des mutations récurrentes dans le carcinome épilemous de tête et de cou humain (HNSCC)^5. HNSCC est un cancer dévastateur avec un taux de mortalité élevé de 40-50% et il est^{le 6ème} cancer le plus commun dans^{le monde entier 6}. Le HNSCC se présente dans les muqueux des voies respiratoires supérieures ou de la cavité buccale et est associé à la consommation de tabac et d’alcool ou à l’infection par le virus du papillome humain (VPH). Le carcinome cutané de cellules squamous (CSC) sont des tumeurs de peau et représentent le deuxième cancer le plus commun chez l’homme^7. Le CSC cutané et le HNSCC sont histologiquement et moléculairement très semblables, avec un pourcentage élevé de cas présentant l’altération dans TP53, PIK3CA, NOTCH1, et HRAS^8. Bien qu’il n’y ait qu’une poignée de gènes mutés à haute fréquence, il existe des centaines de gènes trouvés mutés à basse fréquence (et 5 %), un phénomène communément appelé la distribution à longue queue. Comme la majorité des gènes à longue queue n’ont pas de validation biologique ou clinique, nous avons utilisé cette technologie de dépistage IN vivo CRISPR pour modéliser la perte de fonction de ces gènes chez les souris sujettes aux tumeurs avec des mutations sensibilisantes dans p53, Pik3ca ou Hras et identifié plusieurs nouveaux gènes suppresseurs de tumeur qui coopèrent avec p53, Pik3ca ou Hras pour déclencher le développement^{tumoral 5}.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour générer des bibliothèques de sgRNA lentiviral CRISPR sgRNA multiplexed et effectuer crispr/cas9 gène knock-out écrans dans l’ectoderm surface de la souris. Il convient de noter que cette méthodologie peut être adaptée pour intégrer d’autres technologies de manipulation génétique telles que l’activation CRISPR (CRISPRa) et l’inactivation CRISPR (CRISPRi) ou modifiée pour cibler d’autres systèmes organiques chez la souris pour étudier les fonctions génétiques.

Protocole

Ce protocole a été approuvé et exécuté conformément à l’IACUC de l’Université de Toronto.

1. Conception et clonage de bibliothèques CRISPR en commun

1. Sélectionnez 4-5 sgARN ciblant les gènes de souris d’intérêt à partir de ressources telles que le concepteur sgRNA broad institute (https://portals.broadinstitute.org/gpp/public/analysis-tools/sgrna-design) ou chopchop serveur (https://chopchop.cbu.uib.no). Sélectionnez un nombre égal d’ARN sgRNA non ciblés à partir de Sanjana et coll.^9, par exemple, afin de générer une bibliothèque de gRNA de contrôle s’œnant de taille égale.
2. Lors de la construction des bibliothèques sgRNA, assurez-vous qu’il y a suffisamment de couverture pour chaque sgRNA dans le système d’organes ciblé. Pour la peau de souris, l’épiderme à E9.5 est une seule couche qui contient ~150.000 cellules, dont la plupart ont la capacité de cellules souches^4. Si la transduction lenti-virale entraîne une infectiosité de 15 à 20 %, seulement 18 000 à 24 000 cellules seront transduites à l’E9,5. Échelle de l’expérience en conséquence.
3. Pour le clonage et l’amplification de ces bibliothèques sgRNA, ajouter des sites de restriction enzymatique BsmBI ainsi que des séquences d’ADN liant l’amorce à 5' et 3' fin de la sgRNA et commander les oligos de pleine longueur résultant comme puce oligonucléotide mis en commun (Figure 1A).
   1. Pour multiplexer différentes bibliothèques sur une seule puce, ajoutez des séquences d’amorce spécifiques à la bibliothèque.
   2. À l’aide des paires d’amorce appropriées, amplifiez chaque bibliothèque séparément de la puce oligo mise en commun. Dans un tube PCR, mélanger 25 μL de mélange principal de polymélas 2 x, 20 μL d’eau libre DNase/RNase, 5 ng d’ADN de puce oligo, 2,5 μL d’amorce avant appropriée et 2,5 μL d’amorce inversée appropriée. Utilisez 12-15 cycles et amplifiez avec 98 °C denaturation, 63-67 °C annealing, 72 °C paramètres d’extension pour chaque cycle dans la machine PCR.
   3. Exécutez le produit PCR sur un gel d’agarose de 2,5 % et purifiez ~100 bp PCR produit à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ADN gel.
4. Préparer le plasmide épine dorsale.
   1. Digérer 5 μg de la Cre-recombinase contenant du pLKO-Cre stuffer v3 plasmide avec 2 μL de BsmBI dans un mélange de réaction de 50 μL pendant 1 h à 55 °C, suivi de 1 μL d’incubation de phosphatase alcaline pendant 45 min à 37 °C selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE : Cre-recombinase contenant pLKO-Cre stuffer v3 plasmide est un plasmide à base de lenti-viral qui contient l’enzyme Cre-recombinase pour enlever la cassette Lox-Stop-Lox dans les cellules de souris et a également un promoteur U6 pour conduire l’expression de sgRNA et tracrRNA. Une version avec Cas9 et sans Cas9 peut être utilisée et disponible sur Addgene #158030 et #158031.
   2. Exécutez l’ADN digéré sur un gel d’agarose de 1 % et purifiez la bande vectorielle linéarisée de 7 kb à l’aide d’un kit de nettoyage de l’ADN du gel. Il convient de noter qu’une bande de farce de 2 kb doit également être visible indiquant un digest réussi.
5. Configurer la réaction de ligature pour générer une bibliothèque plasmide sgRNA.
   1. Mélanger 1 μg de vecteur purifié et 30 ng d’insert PCR purifié avec 2 μL de BsmBI, 5 μL de ligase d’ADN T4, 10 μM ATP et 1x tampon spécifique à BsmBI. Incuber le mélange de ligature toute la nuit à 37 °C. Utilisez un tube supplémentaire contenant tous les matériaux ci-dessus, sauf l’insert PCR comme un contrôle négatif.
   2. Le lendemain matin, purifier le mélange de ligature à l’aide du kit de nettoyage oligo et elute dans 7 μL d’eau libre RNase/DNase.
6. Électroporer la bibliothèque en cellules compétentes.
   1. Ajouter 2 μL de bibliothèque sgRNA élitée ou de mélange de ligature de contrôle négatif à 25 μL de cellules électrocompétentes décongelées dans des cuvettes pré-réfrigérées (1,0 mm) sur la glace. Électroporate suivant le protocole du fabricant (10 μF, 600 Ohms, 1800 Volts). À la cuvette ajouter 975 μL de milieu de récupération (ou milieu SOC) dans les 10 s de l’impulsion.
   2. Transférer les cellules électroporées dans un tube de culture et incuber pendant une heure à 37 °C dans un incubateur de secousses bactériennes à 300 rpm.
7. Estimer l’efficacité de la transformation et la couverture de la bibliothèque par sgRNA.
   1. Préparer une dilution 100 fois en transférant 10 μL de la réaction de transformation contenant des cellules électroporées avec la bibliothèque sgRNA ou la ligature de contrôle négatif à 990 μL de Recovery Medium et bien mélanger.
   2. Plaque 10 μL du mélange de transformation dilué sur une plaque d’agar préchauffée de 10 cm LB + ampicilline (100 μg/L). Il en résulte une dilution 10 000 fois des transformateurs et l’utilisation de cette plaque pour calculer l’efficacité de la transformation. Effectuer l’incubation des plaques à 30 °C pendant 14-16 h.
8. Plaquez le reste de la réaction de transformation en étalant 100 μL de cellules récupérées sur chaque plaque d’un total de 10 plaques d’agar préchauffées de 15 cm LB + ampicilline. Incuber les plaques de 14 à 16 h à 30 °C. Il convient de noter que la croissance à 30 °C minimise la recombinaison entre les deux répétitions terminales à long terme dans le plasmide viral.
9. Pour évaluer le succès du clonage, calculer l’efficacité de la transformation. Comptez le nombre de colonies sur la plaque de dilution contenant des transformateurs de la bibliothèque sgRNA ou la ligature de contrôle négatif (plaques de 10 cm, étape 1.8.2). Le mélange de contrôle négatif ne devrait pas avoir ou seulement très peu de colonies. Pour obtenir le nombre total de colonies, multipliez le nombre de colonies par 10 000.
   REMARQUE : Le nombre total de colonies comptées représente une couverture de bibliothèque qui devrait être d’au moins 200 x colonies par SGRNA.
   1. Assurez-vous qu’une bibliothèque de 2000 sgARN comptera au moins 400 000 colonies. Dans le cas où il n’y aurait pas assez de colonies, répéter et mettre en place plus d’électroporation.
10. Contrôle de la qualité : À partir de la plaque de dilution, choisissez 20 colonies et ajoutez chaque colonie à un tube de culture individuel contenant 3 mL de lb de médias + ampicilline. Incuber les 20 tubes toute la nuit à 30 °C secouant à 250 rpm. Purifier l’ADN plasmide à l’aide d’un kit de mini-préparation selon les instructions du fabricant et la séquence Sanger tous les 20 échantillons d’ADN plasmide pour vérifier chaque échantillon a une séquence sgRNA différente en utilisant l’amorce U6 (5'-GAG GGC CTA TTT CCC ATG ATT CC-3').
11. Récolter les colonies à partir de chaque plaque de 15 cm.
    1. Ajouter 7 mL de LB moyen, puis gratter les colonies de la plaque LB Agar à l’avec un épéiste cellulaire. Utilisez une pipette de 10 mL pour transférer les cellules dans un flacon conique stérile de 2 L. Répéter l’répétition pour toutes les plaques et les bactéries de la piscine dans le flacon de 2 L. Incuber le flacon pendant 2-3 h en secouant à 30 °C. Centrifugez la culture et recueillez la pastille.
    2. Purifier l’ADN plasmide à l’aide d’un kit de purification maxi-plasmide.
12. Contrôle de qualité supplémentaire : Utilisez 1 ng d’ADN plasmide de bibliothèque sgRNA maxi-prep et exécutez une réaction PCR à l’aide d’amorce séquençage de nouvelle génération selon les instructions du fabricant. La représentation de tous les sgARN dans la bibliothèque peut être vérifiée par plate-forme de séquençage profond.

2. Production de lentivirus à haut litre adapté à la transduction in vivo

REMARQUE : Effectuez toutes les étapes de cette section du protocole dans une installation BSL2+ dans une armoire de biosécurité de type II de type A2. 293FT et surtout les cellules d’emballage 293NT permettent une production de virus plus élevée. Utilisez des cellules à faible passage (

1. Préparer les cellules d’emballage virales.
   1. Le jour 1, plaque HEK293T cellules sur 6 plaques de poly-L-lysine enduites de 15 cm à 35% confluence dans les supports de croissance (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin-Streptomycine solution antibiotique (w / v)). Incuber les cellules pendant la nuit à 37 °C, 5 % de CO₂.
   2. Une fois que les cellules plaquées sont confluentes à 70-80% et réparties uniformément, remplacez les supports de croissance par 25 mL de sérum et de médias DMEM sans antibiotiques.
   3. Ajouter les médias lentement sur les côtés des flacons lors de l’alimentation, comme hek293T et 293NT cellules peuvent se détacher facilement de la culture tissulaire en plastique
2. Préparer le mélange de transfection.
   1. Ajouter 65 μg de plasmides d’emballage lentiviral psPAX2, 43 μg de VSV-G exprimant l’enveloppe plasmide pMD2.G, 65 μg de plasmide de bibliothèque sgRNA et 240 μL de polyéthylènemine de mg/mL (PEI) à 6 mL de DMEM et vortex.
      REMARQUE : Utilisez toujours une bouteille de DMEM non ouverte ou très récemment ouverte pour la transfection, car le pH à cette étape est critique, et le DMEM devient plus basique au fil du temps une fois ouvert.
   2. Incuber pendant 15 min à température ambiante. Ce mélange de transfection suffit aux cellules plaquées sur des plaques de 6 x 15 cm avec une surface de 870 cm^2. Mettre à l’échelle le mélange de transfection en fonction des exigences de l’expérience.
3. Transfection des cellules d’emballage virales.
   1. Après 15 minutes d’incubation, transfecter chacune des plaques de 15 cm en ajoutant 1 mL du mélange de transfection dans le sens de la goutte dans toute la plaque. Incuber à 37 °C, 5 % de CO₂ pendant 8 h.
   2. Après l’incubation, retirer les supports sans sérum contenant le mélange de transfection et ajouter 30 mL de culture régulière aux plaques de 15 cm et à la culture pendant 48 h à 37 °C, 5 % de CO_2.
4. Après 48 h, recueillir le supernatant viral et filtrer à travers le filtre PVDF de 0,45 μm. Gardez 1 mL du supernatant viral et rangez-les à -80 °C pour le contrôle de la qualité et le titrage viral.
5. Concentrez le supernatant viral par centrifugation de gradient saccharose dans une centrifugeuse à grande vitesse à l’aide de la tête du rotor SW28.
   1. Tubes ultracentrifugeuses de premier choix en les lavant avec 70% d’éthanol, suivis de 3 rinçages avec PBS. Répartir uniformément environ 30 mL du supernatant viral dans chacun des tubes de 6 ultracentrifugeuses.
   2. Pipette doucement au fond de chaque tube 4 mL de la solution de saccharose de 20% (20 g de saccharose dans 100 mL de PBS). Placez les six tubes d’ultracentrifugeuse dans les six seaux pivotants SW28 et équilibrez précisément chaque paire de seaux adverses en ajoutant ou en enlevant le supernatant viral.
   3. Centrifugeuse supernatant viral à 4 °C pendant au moins 2 h et jusqu’à 4 h à 80 000 x g et 4 °C. Une fois la centrifugation terminée, jetez soigneusement le supernatant.
   4. Égoutter le supernatant restant en plaçant des tubes d’ultracentrifugeuse à l’envers sur une serviette en papier souple stérile pendant au moins 2 minutes et essuyer les gouttelettes de supernatant à l’intérieur du tube à l’aide d’une serviette en papier souple pour se débarrasser de tout milieu résiduel. Une petite pastille blanche grisâtre peut être visible au fond du tube.
   5. Ajouter 20-25 μL froid, PBS frais à chaque tube. Tubes de joint avec le film de paraffine et les tubes d’incubation droit sur la glace avec la secousse douce sur un shaker orbital de plate-forme pendant ~2 h.
   6. À l’aide d’une pipette de 20 μL, déloger soigneusement et resuspendre la pastille du premier tube, en prenant soin de ne pas former de bulles. Transférer le milieu dans le tube suivant et répéter le processus jusqu’à ce que toutes les granulés de virus aient été délogés et combinés dans un tube d’environ 120-150 μL de volume. Incuber cette suspension virale de haut niveau pour un autre ~ 2 h sur la glace avec des secousses douces.
   7. Transférer la suspension virale dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et faire tourner le tube à 4 °C dans une centrifugeuse réfrigérée et pré-refroidie à 12 000 x g pendant 2 min. Aliquot le supernatant viral clair soigneusement comme aliquots 10 μL dans des tubes séparés de 0,2 mL et stocker à -80 °C. Jetez la pastille au fond du tube car cela obstruera l’aiguille pendant les injections embryonnaires.
6. Titration de la bibliothèque de lentivirus CRISPR mise en commun
   REMARQUE : La suspension virale qui en résulte devrait donner une concentration d’environ 2 000 fois et la solution virale qui en résulte et devrait avoir un viral de 10⁷à 10⁹, ce qui est suffisant pour plus de 100 chirurgies E9.5 décrites ci-dessous.
   1. Graines R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato souris fibroblastes embryonnaires (MEFs) ou R26-Lox-STOP-Lox-tdTomato kératinocytes primaires ou toute autre ligne cellulaire Cre-reporter dans une plaque de puits 2 x 6.
   2. Une fois que la cellule atteint ~40% de confluence, les cellules sont prêtes pour la transduction. À cette époque, déterminer le nombre de cellules dans un puits pour permettre le calcul du titer viral plus tard. Changer les médias des cellules de Cre-reporter en supports de croissance complétés par du polybrene de 10 μg/mL (=bromure d’hexadiméthrine).
   3. Diluer 1 μL de virus concentré avec 2 mL de supports de croissance. Ajouter 0, 10, 50, 200 μL de suspension virale diluée et 50 200 μL de virus non concentré à partir de l’étape 2.4 et mélanger les plaques et incuber pendant la nuit à 37 °C, 5 % de CO₂.
   4. Enlevez les supports de croissance contenant le virus le lendemain, lavez les cellules avec PBS et remplacez-les par des supports de croissance normaux. Le surnatant à ce stade est toujours considéré comme un déchet viral et doit être éliminé conformément à la réglementation institutionnelle BSL2.
   5. Approximativement 36-48 h après transduction, évaluez la recombinaison cre-médiée de la cassette de Lox-STOP-Lox et l’expression de tdTomato par FACS. Calculer le titer viral. Calculer les unités de formation des colonies (cfu)/mL à l’aide de la formule suivante :
      
      REMARQUE : La comparaison entre la suspension virale concentrée et son supernatant viral non concentré permettra d’estimer le succès de (1) la production virale ainsi que (2) la concentration virale. Alternativement, le titer viral peut être estimé en utilisant la méthode qRT-PCR¹⁰. La production et la concentration à grande échelle de lentivirus peuvent également être effectuées à l’aide d’une concentration en deux étapes avec une concentration de cartouche suivie d’une ultracentrifugation comme^{décrit précédemment 2}.

3. Chirurgie guidée ultra-sonore et injection

NOTE: Cette technologie a été adaptée de^4,11. La microinjection orientée vers la transduction de l’épithélium de surface doit être effectuée au jour embryonnaire E9.5, lorsque l’ectoderm de surface se compose d’une seule couche et avant la formation du periderme à partir de E10, ce qui empêcherait la transduction de cette couche basale. De préférence mettre en place des souris le vendredi, de sorte que le premier jour possible avec e9,5 embryons est le lundi suivant. Utilisez des souris Rosa26-Lox-STOP-LOX-Cas9-GFP (Jackson Laboratory #024857) pour une efficacité optimale CRISPR/Cas9¹².

1. Mettre en place des souris mâles et femelles appropriées pour les grossesses 10 jours avant la date de chirurgie souhaitée.
   1. Contrôlez les souris au cours des jours suivants pour identifier les souris potentiellement enceintes. Confirmer la grossesse la veille de la chirurgie prévue (c.-à-d. E8.5) à l’aide d’ultrasons.
2. Préparer la boîte de Pétri modifiée.
   1. À l’aide du ruban adhésif à double face, collez la membrane en silicone sur le fond de la boîte de Pétri couvrant l’ouverture circulaire. À l’aide de ciseaux pointus, couper une ouverture ovale de 2 x 10 mm dans la membrane de silicone.
3. Préparation du système de microinjection
   1. Préparer les aiguilles d’injection à partir d’un capillaire en verre à paroi épaisse à l’aide d’un puller micropipette avec les paramètres suivants : Pression = 200; Chaleur = 769; Traction = 0; Vitesse = 140; Temps = 100.
   2. Utilisation de ciseaux fins pour couper la pointe de l’aiguille au niveau où son diamètre est d’environ 30 μm. Biseauté l’aiguille à l’aide d’aiguiseur d’aiguille à 20° sur une plaque abrasive de qualité fine avec mouillage régulier pendant 20 min.
   3. Stériliser l’aiguille de microinjection en poussant 70% d’éthanol à l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille de 26 G1/2. À l’aide d’une seringue de 10 mL et d’une aiguille de 26 G1/2 chargée d’huile minérale, remplissez l’aiguille de microinjection. Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles dans l’aiguille de microinjection.
   4. Monter l’aiguille du microinjecteur sur le micromanipulateur selon les instructions du fabricant.
4. Chargez l’aiguille avec la bibliothèque virale sgRNA.
   1. Pipette 10 μL de suspension virale sur un parafilm fixé sur une surface plane.
   2. À l’aide d’un micromanipulateur, expulser l’huile minérale. La présence d’un petit volume d’huile dans l’aiguille empêchera le lentivirus de contacter le piston. Chargez environ 4-5 μL de suspension virale par aspiration lente sans bulles d’air.
5. Anesthésier la souris enceinte à l’aide d’une chambre d’induction isoflurane. Réglez le régulateur d’oxygène à 1 L/min et vaporisateur d’isoflurane à 2%. Pour déterminer si l’animal est anesthésié, vérifiez par pincement d’un bout à l’autre après ~3-5 min dans la chambre d’induction d’isoflurane.
6. Placez le côté ventral anesthésié de l’animal vers le haut sur le stade de chirurgie chauffée (40 °C) et appliquez des rubans de chirurgie pour maintenir les pattes en place avec le tube d’anesthésie nez-cône pour un approvisionnement constant en isoflurane et en oxygène jusqu’à ce que la chirurgie soit terminée.
7. Confirmer la grossesse E9.5 si elle n’a pas été faite à E8.5.
   1. Appliquer une petite quantité (~ 1/2 c. à thé) d’une crème d’épilation sur l’abdomen et l’étendre sur une zone de 3 x 3 cm à l’aide d’un applicateur à pointe de coton.
   2. Après 2-3 min, retirer délicatement la crème avec de la gaze ou du tissu et essuyer la zone propre à l’aide de PBS et 70% d’éthanol.
   3. À l’aide de la sonde à ultrasons et du gel, vérifiez la souris enceinte pour le jour embryonnaire E9.5. Il convient de noter que cela peut également être fait la veille à l’E8.5 pour gagner du temps le jour de la chirurgie réelle.
   4. Retirer le gel à ultrasons et essuyer la zone propre à l’aide du SPB, puis 70 % d’éthanol pour désinfecter.
8. Injecter 0,02 cc d’analgésique buprénorphine sous-cutanée dans le barrage de souris.
9. Exposer chirurgicalement l’utérus
   1. À l’aide de forceps et de ciseaux stériles, faire une incision verticale ~ 2 cm dans la peau de la souris.
   2. À l’aide de forceps contondants séparer la peau autour de l’incision du péritoine.
   3. À l’aide de forceps et de ciseaux stériles, couper à travers le péritoine.
   4. À l’aide de forceps contondants, retirez doucement la corne de l’utérus gauche et droite et comptez les embryons.
   5. Réinsérez la plupart des cornes utérine, mais laissez l’extrémité distale d’une corne utérine contenant 3 embryons exposés.
   6. À l’aide de forceps contondants, poussez doucement et tirez l’utérus avec les 3 embryons à travers l’ouverture de la membrane en silicone de la boîte de Pétri modifiée.
   7. Stabiliser la boîte de Pétri à l’aide de cubes d’argile modélisée.
10. Stabiliser l’utérus avec les trois embryons à l’intérieur de la boîte de Pétri à l’aide d’un moule en silicone. Aplatir la prise de silicone sur le côté des embryons à l’aide d’un couteau pointu.
11. Remplissez la boîte de Pétri avec du PBS stérile. Rincer la membrane de silicium sur le fond de la boîte de Pétri avec le ventre de la mère enceinte empêchant ainsi toute fuite.
12. Déplacez la tête d’ultrason dans la boîte de Petri ~0.5 cm au sommet de l’embryon supérieur et ajustez le stade de sorte que la cavité amniotique devienne clairement visible dans la vue d’ultrason.
13. Alignez soigneusement l’aiguille injecteur dans la boîte de Pétri modifiée. À l’aide du micromanipulateur, placez la pointe de l’aiguille à environ 5 mm de l’embryon supérieur. Puis basculer l’aiguille d’avant en arrière et se déplacer dans le plan où sa pointe apparaît la plus brillante dans l’image ultrasonique.
14. À l’aide du micromanipulateur, pousser l’aiguille à travers la paroi utérine dans la cavité amniotique.
15. Injectez du lentivirus contenant la bibliothèque sgRNA.
    1. Pré-programmer l’injecteur à 62 nL et vitesse d’injection lente. Le microinjecteur peut être programmé pour injecter des volumes spécifiques à une vitesse lente ou rapide.
    2. Appuyez sur le bouton Inject 8 fois pour un total de 496 nL par embryon. Ajustez le volume aux besoins requis et au titer viral. Un litre viral de 1 x 10⁸ pfu/mL et 496 nL de volume d’injection se traduira par environ 30% d’infectiosité.
    3. Répétez la même procédure pour les deux autres embryons.
    4. Soulevez la tête de l’ultrason et retirez la fiche en silicone.
    5. Poussez doucement les 3 embryons dans l’abdomen de la souris à l’aide d’un échange stérile de coton.
    6. Retirez doucement les 3 embryons suivants et répétez la procédure d’injection jusqu’à ce que le nombre désiré d’embryons soit injecté.
       REMARQUE : Ne dépassez pas 30 minutes d’anesthésie, car les mères enceintes sont beaucoup plus susceptibles d’avorter leurs embryons au-delà de ce délai. Un chirurgien expérimenté peut injecter jusqu’à 12 embryons dans un délai de 30 min de chirurgie.
16. Soulevez la tête de l’ultrason, retirez le micromanipulateur avec l’aiguille, aspirez le PBS et retirez la boîte de Pétri. À l’aide de lingettes stériles, absorbez tout PBS qui aurait pu s’accumuler dans la cavité abdominale.
17. Fermer l’incision péritonéale à l’aide de sutures absorbables. Utilisez deux agrafes pour fermer l’incision dans la peau abdominale.
    REMARQUE : Tout en effectuant des chirurgies in utero guidées ultra-sonores, il faut prendre le plus grand soin de maintenir un environnement propre, de maintenir la stérilité autant que possible et d’éviter tout contaminant possible. Si plus d’une chirurgie doit être effectuée le même jour, il est important de stériliser les instruments de dissection à l’aide d’un stérilisateur de perles et de nettoyer d’autres appareils qui rencontre des tissus de souris nettoyés avec de l’éthanol. Cela augmente considérablement la survie plus élevée des embryons après la chirurgie. Le taux de survie pour la méthode de chirurgie décrite ici est constamment entre 80-100%.
18. Soins post-ur opérés.
    1. Laisser la femelle enceinte récupérer dans une cage chauffée et observer pendant 15-30 min.
    2. Vérifiez le canal vaginal pour le sang, qui est un signe précoce de l’avortement et des complications. Pour soulager la douleur postopératoire, administrer l’analgésique deux fois par jour pendant deux jours après la chirurgie.
19. Identifier les embryons transduced/nouveau-nés Rosa26-Lox-STOP-Lox-Cas9-GFP souris à l’aide d’un microscope à disséquer fluorescent, une lampe de poche de protéine fluorescente et des lunettes de filtre ou par génotypage pour les particules virales intégrées dans les agrafes d’oreille ou de queue.
    REMARQUE : Les souris sont mieux identifiées à l’aide d’un microscope fluorescent jusqu’au jour postnatal 3 avant que les cheveux ne commencent à pousser.
20. Pour assurer une couverture suffisante pour la bibliothèque CRISPR, calculez la couverture en fonction des paramètres suivants : l’ectoderm de surface de la souris E9.5 se compose d’environ 150 000 cellules; la transduction d'~20% a comme conséquence un taux minimal de double infection (~1/10 cellules doublement infectées)^4,5,11; à 20% d’infectiosité, chaque embryon a 30.000 cellules infectées. Assurez-vous qu’au moins 100 cellules individuelles sont transduites avec un SGRNA donné. Par exemple, un bassin de 2000 sgARN nécessite 2 x 10⁵ cellules ou 6-7 animaux.

4. Procédure de séquençage en profondeur

1. Au point de terminaison expérimental tel que la formation de tumeur ou tout autre phénotype, sacrifiez la souris et récoltez le tissu d’intérêt. Utilisez une trousse d’extraction d’ADN de sang et de tissu pour purifier l’ADN génomique selon le protocole du fabricant. Avant de commencer l’extraction de l’ADN à partir de tumeurs, nettoyer le banc de travail avec l’ADN Effacer et travailler loin de la zone de laboratoire où les plasmides sont manipulés.
   REMARQUE : Il est important de générer un échantillon de référence pour permettre le calcul des changements de pli sgRNA au fil du temps. Les embryons transduced 3 jours après l’infection ou les cellules transduced (voir l’étape 2. 6) peuvent servir d’échantillon de référence pour déterminer la représentation de sgRNA dans la bibliothèque originale.
2. Utilisez de l’ADN génomique de 100 ng – 1,5 μg comme modèle dans une réaction PCR 1 de pré-amplification de 50 μL à l’aide des amorces externes énumérées dans le tableau 1 et le programme PCR décrits dans le tableau 2. Configurez suffisamment de réaction pour donner la couverture désirée.
   REMARQUE : Configurer la réaction pcr de codage à barres dans une zone dédiée distincte du laboratoire ou dans une hotte de culture tissulaire qui est nettoyée à fond par effacement d’ADN pour éviter toute contamination. Exécutez un contrôle négatif pour chaque plaque PCR avec de l’eau comme modèle pour vous assurer qu’il n’y a pas de contamination.
3. Regroupez toutes les réactions pcr 1 et exécutez 20 μL sur un gel agarose de contrôle de 1,5 % pour vérifier l’amplification réussie d’une bande de 600 pb.
4. Utilisez 5 μL de la réaction PCR1 mise en commun comme modèle dans une réaction pcr 2 de 50 μL à l’aide d’une combinaison unique d’amorce codée à barres énumérée dans le tableau 3 et le programme PCR décrit dans le tableau 4. Exécutez 50 μL de réaction PCR 2 sur un gel d’agarose de 2 % et purifiez la bande de 200 bp à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon les instructions du fabricant.
   REMARQUE : L’étape de pré-amplification n’est requise que pour l’amplification d’un tissu transduced complexe. Si l’amplification d’une seule tumeur qui a vraisemblablement développé former une cellule clonale et contient donc juste un sgRNA unique, on peut sauter le PCR1 de pré-amplification et procéder tout de suite avec PCR2.
5. Quantifier la concentration d’ADN à l’aide de la quantification fluorométrique et les envoyer pour séquençage en profondeur à l’installation de séquençage (p. ex., 1 million de lectures par tumeur).
6. Utilisez Bowtie v1.2.3, qui ne permet que les alignements non giflés, aligner les lectures séquencées à la bibliothèque sgRNA¹³. Créez un index de nœud papillon à l’aide de la commande de construction de nœud papillon en entrant les séquences sgRNA en format fasta. Cartographiez les lectures à l’aide de la commande bowtie avec des options -m 2 -v 1, ce qui permet un maximum de deux inadéquations pendant l’alignement de lecture et les rejets lit qui alignent plus d’une séquence sgRNA bibliothèque. En règle générale, plus de 80% des lignes s’alignent sous ces paramètres.
7. Utilisez la commande de compter MAGeCK pour obtenir la table de compt compte de lecture en utilisant le fichier aligné comme^{entrée 14}. le tableau de comptage de sgRNA peut être employé pour l’analyse en aval telle que, déterminer le sgRNA différentiel (MAGeCK) et trouver les gènes essentiels (BAGEL).

Résultats

La figure 1A montre la conception des oligonucléotides pour le multiplexage de plusieurs bibliothèques CRISPR personnalisées d’une manière rentable d’une seule puce oligo de 12 ou 92 k. Une fois que les sgARN (code couleur bleue) sont sélectionnés, les oligonucléotides sont conçus avec des sites de restriction (BsmBI de couleur orange) et des paires d’amorce PCR spécifiques à la bibliothèque (couleur verte codée). Plusieurs bibliothèques peuvent être conçues en utilisant une combinaison uniq...

Discussion

L’édition du génome CRISPR/Cas9 a été largement utilisée dans des études in vitro et in vivo pour étudier les fonctions génétiques et les processus cellulaires. La plupart des études in vivo utilisent des cellules éditées par le gène CRISPR/Cas9 greffées dans un modèle animal (allogreffe ou xénogreffe). Bien qu’il s’agit d’un outil puissant pour étudier la génétique du cancer et les fonctions cellulaires, il manque encore le microenvironnement des tissus indigènes et pourrait provoquer des blessures et / ou des réponses ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Filtre 0,45 micron	Sigma	S2HVU02RE
puce oligo 12k ou 92k	Customarray Inc. (Genscript)
Plaques de culture cellulaire de 15 cm	Corning
293FT	Invitrogen	R70007
293NT	Systems Biosciences	LV900A-1
Phosphatase alcaline	NEB	M0290L
Amplicillin	Fisher Scientific	BP1760-25
ATP	NEB	9804S
BsmBI		NEB R0580L
Suture intestinale chromique	Covidien
Séquençage profond (Next-Seq ou Hi-Seq)	Kit
	Zymo Research	D4008
DNAesy Kit d’extraction d’ADN de sang et de tissus	Qiagen	69506
Cellules électrocompétentes Endura	Lucigen	60242-1
Capillaires en verre	Drummond	3-000-203-G/X
Cellules HEK293T	ATCC	CRL-3216
Centrifugeuse à grande vitesse	Beckman Coulter	MLS-50
LB Agar	Wisent Technologies	800-011-LG
Extracteur de micropipettes	Sutter Instrument	P97
Huile minérale	Sigma	M5904
Mini-prep plasmide	Kit Frogga Bio	PDH300
Système d’anesthésie à l’oxygène	de souris Visual Sonics
Micromanipulateur Nanoject II	Drummond
NEBuffer 3.1 ( Tampon pour BsmBI)	NEB	R0580L
Aiguiseur d’aiguilles	Sutter Instrument	BV-10
Kit de nettoyage d’oligo	Zymo research	D4060
PAGE purifié illumina sequencing primer	IDT DNA
PEI (polyethyleneimine)	Sigma	408727-100ML
Pâte			à modeler Permoplast
Pétridish avec ouverture centrale	Visual Sonics
pMD2.G	Addgene	12259
psPAX2	Addgene	12260
Q5 Polymérase 2x Master mix	NEB	M0494L
Qubit Quantification fluorométrique	Invitrogen	Q33327
Semi-circulaire Bouchon en silicone	Corning
Membrane silicone	Visual Sonics
T4 DNA ligase	NEB	M0202L
Tubes ultra-centrifuges Beckman	Coulter	344058
Vevo2000 échographe	Visual Sonics