Article de méthode

Isolement de l’histone des tissus foliolaires de Sorgho pour le profilage de spectrométrie de masse top down des marqueurs épigénétiques potentiels

DOI :

10.3791/61707

⸱

4 mars 2021

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 2DOE-Joint Genome Institute, Lawrence Berkeley Laboratory, 3Kearney Agricultural Research and Extension Center, University of California Agriculture and Natural Resources, 4West Side Research and Extension Center, University of California, 5Department of Plant Sciences, University of California, Davis, 6Department of Plant and Microbial Biology, University of California, Berkeley

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole a été développé pour extraire efficacement les histones intactes des matériaux de feuilles de sorgho pour le profilage des modifications post-translationnelles de l’histone qui peuvent servir de marqueurs épigénétiques potentiels pour aider à l’ingénierie des cultures résistantes à la sécheresse.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les histones appartiennent à une famille de protéines fortement conservées dans les eucaryotes. Ils emballent l’ADN dans des nucléosomes en tant qu’unités fonctionnelles de chromatine. Les modifications post-translationnelles (MNP) des histones, qui sont très dynamiques et peuvent être ajoutées ou enlevées par des enzymes, jouent un rôle essentiel dans la régulation de l’expression des gènes. Chez les plantes, les facteurs épigénétiques, y compris les MNP histones, sont liés à leurs réponses adaptatives à l’environnement. La compréhension des mécanismes moléculaires du contrôle épigénétique peut apporter des opportunités sans précédent pour des solutions innovantes de bioingénierie. Ici, nous décrivons un protocole pour isoler les noyaux et purifier les histones du tissu foliaire du sorgho. Les histones extraites peuvent être analysées sous leurs formes intactes par spectrométrie de masse descendante (MS) couplée à la chromatographie liquide en phase inversée (RP) en ligne (LC). Les combinaisons et la stoichiométrie de plusieurs MNP sur le même protéoforme histone peuvent être facilement identifiées. En outre, la coupure de queue d’histone peut être détectée à l’aide du flux de travail LC-MS descendant, ce qui donne le profil PTM global des histones de base (H4, H2A, H2B, H3). Nous avons appliqué ce protocole précédemment pour profiler les MNP histones à partir de tissus foliaire de sorgho prélevés dans le cadre d’une étude sur le terrain à grande échelle, visant à identifier les marqueurs épigénétiques de la résistance à la sécheresse. Le protocole pourrait potentiellement être adapté et optimisé pour l’immunoprécipitation-séquençage de chromatine (ChIP-seq), ou pour étudier des MNP d’histone dans des usines semblables.

Introduction

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On s’attend à ce que la gravité et la fréquence croissantes de la sécheresse affectent la productivité des culturescéréalières 1,2. Le sorgho est une culture céréalière d’alimentation et d’énergie connue pour sa capacité exceptionnelle à résister à des conditions limitantl’eau 3,4. Nous poursuivons la compréhension mécaniste de l’interaction entre le stress dû à la sécheresse, le développement des plantes et l’épigénétique des plantes desorgho [Sorgho bicolore (L.) Moench]. Nos travaux antérieurs ont démontré de fortes connexions entre le microbiome végétaux et rhizosphère dans l’aclimation de la sécheresse et les réponses au niveaumoléculaire 5,6,7. Cette recherche ouvrira la voie à l’utilisation de l’ingénierie épigénétique pour adapter les cultures aux scénarios climatiques futurs. Dans le cadre des efforts de compréhension de l’épigénétique, nous visons à étudier les marqueurs protéiques qui ont un impact sur l’expression des gènes au sein de l’organisme végétal.

Les histones appartiennent à une famille de protéines très conservées dans les eucaryotes qui emballent l’ADN en nucléosomes en unités fondamentales de chromatine. Les modifications post-translationnelles (MNP) des histones sont réglées dynamiquement pour contrôler la structure de la chromatine et influencer l’expression des gènes. Comme d’autres facteurs épigénétiques, y compris la méthylation de l’ADN, les MNP histone jouent un rôle important dansde nombreux processus biologiques 8,9. Des analyses à base d’anticorps comme les taches occidentales ont été largement utilisées pour identifier et quantifier les MNP histones. En outre, l’interaction des MNP histones et de l’ADN peut être efficacement sondée par immunoprécipitation de chromatine – séquençage (ChIP-seq)10. Dans ChIP-seq, la chromatine avec l’histone ciblé spécifique PTM est enrichie par des anticorps contre ce PTM spécifique. Ensuite, les fragments d’ADN peuvent être libérés de la chromatine enrichie et séquencés. Des régions de gènes qui interagissent avec l’histone ciblé PTM sont révélées. Cependant, toutes ces expériences reposent fortement sur des anticorps de haute qualité. Pour certaines variantes/homologs histones ou combinaisons de MNP, le développement d’anticorps robustes peut être extrêmement difficile (en particulier pour plusieurs MNP). En outre, les anticorps ne peuvent être développés que si l’histone PTM ciblé est connu. 11 Par conséquent, des méthodes alternatives pour le profilage global non ciblé des MNP histones sont nécessaires.

La spectrométrie de masse (SP) est une méthode complémentaire pour caractériser les MNP histones, y compris les MNP inconnus pour lesquels les anticorps ne sontpas disponibles 11,12. Le flux de travail bien établi de la SP « ascendante » utilise des protéases pour digérer les protéines en petits peptides avant la séparation de la chromatographie liquide (LC) et la détection de la SP. Parce que les histones ont un grand nombre de résidus de base (lysine et arginine), la digestion de la trypsine (protéase spécifique à la lysine et à l’arginine) dans le flux de travail ascendant standard coupe les protéines en peptides très courts. Les peptides courts sont techniquement difficiles à analyser par LC-MS standard, et ne préservent pas l’information sur la connectivité et la stoichiométrie de plusieurs MNP. L’utilisation d’autres enzymes ou l’étiquetage chimique pour bloquer les lysines génère des peptides plus longs qui sont plus appropriés pour la caractérisation de l’histone PTMs13,14.

Alternativement, l’étape de digestion peut être complètement omise. Dans cette approche « descendante », des ions protéiques intacts sont introduits dans la SP par ionisation par électrospray (ESI) après la séparation en ligne du LC, ce qui donne des ions des protéoformes histones intacts. En outre, les ions (c.-à-d. protéoformes) d’intérêt peuvent être isolés et fragmentés dans le spectromètre de masse pour donner les ions de séquence pour l’identification et la localisation de PTM. Par conséquent, la SP descendante a l’avantage de préserver les informations protéoformes et de capturer la connectivité de plusieurs MNP et tronqués terminaux sur le même protéoforme15,16. Les expériences descendantes peuvent également fournir des informations quantitatives et offrir un aperçu des biomarqueurs au niveau de protéines intactes17. Ici, nous décrivons un protocole pour extraire l’histone de la feuille de sorgho et analyser les histones intactes par LC-MS de haut en bas.

Les données d’exemple indiquées dans la figure 1 et la figure 2 proviennent de feuilles de sorgho recueillies à la semaine 2 après la plantation. Bien que l’on s’attende à une variation du rendement, ce protocole est généralement agnostique par rapport à des conditions d’échantillonnage spécifiques. Le même protocole a été utilisé avec succès pour le tissu foliaire végétaux de sorgho prélevé dans 2, 3, 5, 8, 9 et 10 semaines après la plantation.

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Protocole

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1. Préparation du matériel de feuille de sorgho

REMARQUE : Les plantes de sorgho ont été cultivées dans le sol dans le champ à Parlier, CA.

  1. Recueillir les feuilles de sorgho des plantes dans des tubes de centrifugeuse de 50 mL et congeler immédiatement le tube dans de l’azote liquide. Recueillir le tissu folilaire en arrache la troisième et quatrième feuille entièrement émergée de la barre primaire.
    REMARQUE : Vous trouverez plus de détails sur l’état du terrain, la croissance de l’échantillon et la collecte dans lerapport publié 18.
  2. Moudre les feuilles avec de l’azote liquide et les transférer immédiatement dans un tube de centrifugeuse.
  3. Conserver la feuille de sol à -80 °C jusqu’à utilisation. Prenez environ 4 g de poudre de feuilles cryo-moulues pour l’analyse de l’histone de chaque échantillon.

2. Préparation des tampons et des matériaux (3-4 h)

REMARQUE : Les solutions de stock à forte concentration peuvent être faites à l’avance et stockées jusqu’à utilisation. Mais tous les tampons de travail doivent être rafraîchis le jour de l’extraction (par dilution du stock et en mélangeant avec d’autres contenus) et être placés sur la glace pendant le processus. Toute l’expérience doit être effectuée à 4 °C sauf indication contraire.

  1. Préparer 2,5 M de saccharose en dissolvant 42,8 g de saccharose (342,30 g/mol) dans 15 mL d’eau stérile sur plaque chauffante dans un récipient en verre en remuant continuellement. Porter le volume à 50 mL une fois que le saccharose s’est complètement dissous. Conserver le saccharose à 4 °C jusqu’à utilisation.
  2. Préparer 1 M Tris pH 8 en dissolvant 1,576 g de Tris HCl dans 10 mL de H2O dans un tube centrifugeuse de 15 mL. Ajuster le pH avec naoh à 8 et vérifier avec du papier pH. Conservez-le à 4 °C jusqu’à utilisation.
  3. Préparer 1 M dithiothreitol (TNT) en pesant 231 mg de TNT (154,25 g/mol) et en le dissolvant dans de l’eau stérile de 1,5 mL. La TNT doit être faite fraîche ou utiliser des aliquots congelés stockés.
  4. (Facultatif) Préparer les inhibiteurs supplémentaires en mélangeant trois sels différents. Préparer 18,38 mg d’orthovanadate de sodium (183,91 g/mol) dans 1 mL d’eau stérile, puis préparer séparément le butyrate de sodium en ajoutant 11,008 mg de butyrate de sodium (110,09 g/mol) dans 1 mL d’eau stérile. Préparer le sel final en ajoutant 4,199 mg de fluorure de sodium (41,99 g/mol) dans 1 mL d’eau. Mélanger les trois solutions de sel en volume égal comme solution de stock pour les « inhibiteurs supplémentaires » (33 mM de chacun des trois produits chimiques).
    REMARQUE : Le vanadate de sodium polymérise à des concentrations supérieures à 0,1 mM sous pH neutre. Il est conseillé d’activer le vanadate de sodium pour le dépolymerize pour une efficacité maximale suivant les protocoles publiés19. Alternativement, le vanadate de sodium activé est disponible dans le commerce. Dans ce cas, le vanadate de sodium n’a pas été activé intentionnellement, de sorte que l’efficacité ne se réduit pas. Le vanadate de sodium activé n’a pas encore été testé pour ce protocole.
  5. Préparer 1 M de MgCl2 en dissolvant 0,952 g de chlorure de magnésium anhydre (95,2 g/mol) dans 10 mL de H2O dans un tube de centrifugeuse de 15 mL. Conserver 1 M MgCl2 à 4 °C jusqu’à utilisation.
  6. Préparer 10% (v/v) Triton X-100 en mélangeant 53,5 g de Triton X-100 avec 35 mL d’eau stérile, porter jusqu’à 50 mL avec de l’eau et le stocker à température ambiante.
  7. Préparer 5% guanidine tampon pH7 (appelé « tampon Gdn ») qui sera utilisé pour conditionner la résine au moins pendant la nuit - préparer 0,1 M potassium hydrogène phosphate dibasic (K2HPO4) en pesant 870 mg de K2HPO4 et dissoudre dans 50 mL d’eau stérile et stocker à 4 °C.
  8. Peser 0,7 g d’hydrochlorure de guanidine et dissoudre en 0,1 M K2HPO4 à un volume final de 14 mL. Réglez le pH à 7 en vérifiant avec du papier pH.
  9. Faire tremper la résine sèche faible échange de cation (WCX) dans 5% Guanidine tampon pH 7 pendant la nuit. Retirez le supernatant et remplissez-le d’un tampon Gdn frais de 5 % et trempez-le à nouveau toute la nuit pour laisser la résine s’équilibrer complètement (jusqu’à ce que le supernatant ait le même pH que le tampon d’origine).
  10. Avant de commencer l’expérience dans la section suivante, mélangez les reagents pour faire tampon EB1, EB2A et EB2B basé sur le tableau 1. Ajouter tous les inhibiteurs et la TNT frais juste avant utilisation.
RéactifsConcentration des stocksEB1 (EB1)EB2A (EB2A)EB2B (EB2B)
Volume (mL)Volume (mL)Volume (mL)
Saccharose2,5 M4.41.250.5
Tris HCl pH81M (1M)0.250.1250.05
Tnt1M (1M)0.1250.06250.025
H2O20.2259.68754.375
comprimé inhibiteur de la protéase (IP)0,5 pilule0,5 pilule0,5 pilule
Inhibiteurs supplémentaires (facultatif)33mM0.250.1250.05
MgCl2 1M (1M)0.1250.05
Triton X10010%1.25
Volume global25 mL12,5 mL5 mL

Tableau 1 : Composition des tampons d’extraction (EB).

  1. Faites le tampon de lyse de noyaux (NLB) basé sur le tableau 2. Préparer le NLB à l’avance et conserver à 4 °C jusqu’à utilisation. Ajouter les comprimés PI frais juste avant utilisation à 1x (0,5 comprimé par 5 mL). Voir le tableau 2 pour des volumes spécifiques.
NlbConcentration des stocksVolume (mL)
Nacl5M (5M)0.4
Tris HCl pH81M (1M)0.05
Triton X10010%0.5
Edta0,5 M0.2
H2O3.85
Comprimés PI0,5 pilule
Inhibiteurs supplémentaires (facultatif)33mM0.05
Volume global5 mL

Tableau 2 : Composition du tampon de lyse des noyaux (NLB).

3. Procédure d’isolement des noyaux

REMARQUE : Il est recommandé d’effectuer les étapes 3.1-3.3 du premier jour (2-3 h), d’enregistrer les noyaux dans le tampon NLB à -80 °C et de reprendre le lendemain (ou plus tard) pour la purification des protéines (4 h). Les étapes d’isolement des noyaux de ce protocole ont été adaptées à partir d’un protocole chip-seq de sorgho utilisé à l’Institut conjoint du génome. Des lavages supplémentaires et une séparation du gradient de saccharose peuvent être nécessaires pour assurer la pureté des noyaux pour les applications ChIP-seq.

  1. Filtration des débris (~0.5 h)
    1. Pesez la poudre de feuilles moulues ~4 g, en vous assurant qu’elle reste congelée en plaçant sur de la glace sèche ou de l’azote liquide jusqu’à ce qu’elle soit prête à l’emploi.
    2. Ajouter des comprimés inhibiteurs de la protéase à EB1 à une concentration finale de 0,2 x (0,5 comprimé pour 25 mL par échantillon). Utilisez un pilon en plastique miniature ou une pointe de pipette pour pré-écraser les comprimés dans un tube de microcentrifugeuse avant d’ajouter aux tampons pour aider à la dissolution du comprimé dans le tampon. Pour éviter la perte de matériel, ajoutez le comprimé PI et soniquez le tampon pour dissoudre le comprimé.
    3. Ajouter 20 mL d’EB1 à la poudre de feuilles moulues congelées, vortex doucement et mélanger jusqu’à ce que la poudre soit complètement suspendue. Continuer à mélanger doucement pendant ~10 min.
    4. Filtrer à travers le maillage 100, en rinçant le matériau filtré deux fois avec 2 mL d’EB1 à chaque fois.
      REMARQUE : Le filtrate et les débris filtrés doivent être verts. Si le suivi à l’aide d’un microscope, on devrait être en mesure de voir des noyaux intacts et des chloroplastes intacts dans le filtrate à ce stade. La majorité des gros débris doivent être absents ou épuisés. Mélanger les dyes comme le bleu méthylène avec l’échantillon. Les noyaux sont facilement observables sous forme de sphères bleu foncé/aigue-marine de ~3-5 μm de diamètre lorsqu’elles sont visualisées à l’aide d’un objectif de 20x, 40x et/ou 100x. Par rapport aux noyaux, les chloroplastes sont de taille similaire, mais de couleur verdâtre et souvent de forme plus ovale. Les vacuoles sont également semblables aux noyaux dans la taille et la forme, mais ils ne prendra pas facilement le colorant bleu de Méthylène.
    5. Centrifugeuse le filtrate combiné à 3 000 x g pendant 10 min à 4 °C dans un rotor balançant du seau aux débris de granulés et aux grands organites subcellulaires, y compris les noyaux et les chloroplastes.
      REMARQUE : Il est recommandé de préparer l’EB2A pendant ce spin (voir l’étape 3.2.1).
    6. Décanter le surnatant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
      REMARQUE : Comme aucun détergent n’a encore été ajouté, la pastille doit rester vert intense et le supernatant doit être, tout au plus, vert pâle/jaune.
  2. Lyse des organites non cibles (~0.5 h)
    1. Préparer l’EB2A en ajoutant des inhibiteurs de la protéase à une concentration finale de 0,4 x (0,5 comprimé par EB2A de 12,5 mL).
    2. Resuspendez la pastille de l’étape 3.1.6 dans 5 mL d’EB2A et incubez sur la glace pendant 10 min avec un mélange doux.
      REMARQUE : La concentration de détergent doit être optimisée pour lyser préférentiellement les cellules intactes et les chloroplastes, mais pas les noyaux. La quantité requise peut varier d’un organisme à l’autre. Il est recommandé de vérifier la lyse des chloroplastes et la rétention des noyaux intacts au microscope.
    3. Centrifugeuse à 2 100 x g pendant 15 min à 4 °C dans un rotor balançant du seau pour pelleter les débris et les noyaux.
      REMARQUE : À ce stade, le supernatant doit être intensément vert, et la pastille doit être beaucoup moins verte que celle observée aux stades précédents en raison de la lyse des chloroplastes et de la libération de chlorophylle dans le cytosol.
    4. Décanter le surnatant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
  3. Isolement des noyaux des contaminants cytoplasmiques restants (~0,5 h)
    1. Préparer l’EB2B en ajoutant des inhibiteurs de la protéase à une concentration finale de 1x (0,5 comprimé par 5 mL EB2B).
    2. Resuspendez la pastille nucléaire brute de l’étape 3.2.3 dans 2 mL d’EB2B.
      REMARQUE : EB2B ne contient pas de Triton X-100, de sorte qu’aucune lyse supplémentaire ne devrait se produire à ce stade.
    3. Centrifugeuse à 2 100 x g pendant 15 min à 4 °C dans un rotor balançant du seau pour pelleter les débris et les noyaux.
      REMARQUE : Les petits organites et les composants cytoplasmiques ne doivent pas être granulés, de sorte qu’ils doivent rester dans le supernatant.
    4. Décanter le surnatant, en prenant soin de ne pas déranger la pastille.
    5. Resuspendez la pastille à l’aide de 250 μL de NLB (ajouter 0,5 comprimé inhibiteur de la protéase frais pour 5 mL).
      REMARQUE : L’objectif est de résuser les noyaux dans une quantité minimale de NLB sans perte matérielle significative. Parce que NLB est très visqueux et les granulés contiennent une grande quantité de débris insolubles, il est très difficile à pipette et a tendance à s’accrocher à l’intérieur des pointes pipette. Pour cette raison, il est recommandé de réutiliser la même pointe pipette chaque fois que possible. S’il s’agit de matières résiduelles dans une pointe de pipette, il suffit d’accrocher la pipette d’une étagère ou d’une grille pendant ~1 min pour permettre à la gravité de recueillir le matériau à l’ouverture de la pointe. Ne pas pipette agressivement pour résuspendre les granulés. Au lieu de cela, utilisez la pointe pipette comme tige de remue-remuer jusqu’à ce que le matériau granulé peut être aspiré dans la pointe pipette. C’est-à-dire qu’il est parfaitement bien que les grosses touffes de granulés restent à ce stade tant qu’il peut être aspiré dans une pointe de pipette.
    6. Vortex 15 s au maximum pour homogénéiser et resuspendre partiellement le matériau. Sonicate pendant 5 min à 4 °C, puis conserver à -80 °C.
      REMARQUE : Pour les étapes subséquentes, gardez à l’esprit que la quantité totale de NLB ajoutée est de 250 μL, mais le volume apparent total de l’échantillon peut être jusqu’à deux fois plus élevé en raison de débris insolubles. L’échantillon est congelé et décongelé pour aider à la lyse des noyaux.
  4. Lyse des noyaux et extraction d’histone (~4 h)
    1. Ajouter 750 μL de tampon Gdn de 5 % à l’échantillon décongelé. Sonicate pendant 15 min à 4 °C.
    2. Transférer l’échantillon dans un seul tube de 2 mL et faire tourner 10 000 x g pendant 10 min à 4 °C.
      REMARQUE : Le supernatant aura probablement l’air vert. Les étapes de chromatographie suivantes devraient éliminer la plupart des pigments de la protéine.
    3. En attendant l’étape 3.4.1 et 3.4.2, préparez la colonne pour le nettoyage de la chromatographie d’échange d’ions. Rincer la colonne de chromatographie avec 2 mL d’acétyonitrile et 4 mL d’eau pour minimiser la contamination à la surface.
    4. Chargez 200~300 μL de résine WCX (pré-conditionnée avec tampon Gdn à 5%) sur la colonne chromatographie. Laissez la résine s’installer. Laver quatre fois avec 1 mL de tampon Gdn de 5 %. Gardez le tube et la colonne sur la glace pour le reste des étapes de purification.
    5. Mettez la colonne de chromatographie sur un tube de collecte de 2 mL. Chargez le supernatant de l’étape 3.4.2 lentement sur le lit de résine sans perturber la résine (essayez de tomber lentement du côté des tubes). Laissez la solution passer par la gravité. Au fur et à mesure que la solution circule, chargez l’élitiste vers le haut de la colonne 6 à 8 fois pour permettre une liaison maximale à la résine. Ensuite, jetez l’élitiste.
    6. Chargez 2 mL de tampon Gdn de 5 % pour laver les protéines non histones de la colonne. Jetez l’élitiste.
    7. Histones elute avec tampon 1 mL 20% Gdn. Recueillir l’élixent, qui contient des protéines d’histone.
    8. Utilisez le filtre de rotation de 3 kDa de coupure de poids moléculaire (MWCO) (0.5 mL) pour desalt l’eluent de l’étape 3.4.6. Avant utilisation, chargez 500 μL de solvant de lavage (0,2 % d’acide formique dans 3 % d’ACN) et faites-le tourner deux fois pour nettoyer le filtre.
      REMARQUE : Il est recommandé de commencer à laver le filtre MWCO tout en effectuant les étapes de chromatographie de résine pour gagner du temps. Les étapes suivantes du filtre de spin prennent ~3-4 h.
    9. Première charge 500 μL d’échantillon d’histone, tourner à 14.000 x g pendant ~25 min pour réduire le volume jusqu’à ~100 μL. Chargez ensuite encore 400 μL d’échantillon et tournez à 14 000 x g à nouveau pendant ~25 min. Chargez les 100 μL d’échantillon fin, rincez le tube d’échantillon avec 300 μL de solvant de lavage et chargez le solvant dans le filtre. Tournez à nouveau à 14 000 x g pendant ~25 min.
    10. Chargez 400 μL de solvant de lavage, tournez à 14 000 x g pendant ~25 min pour réduire le volume à ~100 μL ou moins. Chaque cycle réduit la concentration de sel d’un cinquième. Répétez pendant encore trois cycles pour amener la concentration de guanidine à ~0,01%. Inverser le filtre dans un tube de collecte propre et tourner à 1000 x g pendant 2 min. Enregistrez l’échantillon d’histone purifié à -20 °C ou -80 °C pour analyse.
      REMARQUE : Il est recommandé de tourner plus longtemps (30-40 min) à la dernière étape afin de minimiser le volume de l’échantillon afin d’obtenir une concentration plus élevée. Le volume devrait être en mesure de descendre à 50-70 μL.

4. Spectrométrie de masse des histones purifiées

  1. Acquisition de données de spectrométrie de masse chromatographie liquide (LC-MS)
    1. Estimer la concentration de protéines par analyse de l’acide bicinchoninique (BCA) suivant le protocole du fabricant.
      REMARQUE : BCA ne peut fournir qu’une estimation de la concentration totale de protéines, mais pas de la qualité de la purification de l’histone. Si l’instrumentation de la SP n’est pas facilement disponible pour vérifier la qualité de la purification de l’histone, une tache occidentale peut être utilisée. La phase inversée LC couplée à la détection d’absorption ultraviolette de 210 nm décrite dans notre rapport précédent peut également êtreemployée 20. Le chromatogramme peut être comparé à une norme connue pour vérifier la qualité de l’échantillon. Cependant, différents organismes peuvent avoir des profils d’élitution différents. Par conséquent, l’utilisation des normes d’histone des organismes semblables est fortement recommandée.
    2. Connectez une colonne analytique de phase inversée (RP) C18 (p. ex., 3 μm 300 Å, colonne diamètre intérieur 75 μm, diamètre extérieur 360 μm, longueur 70 cm) et une colonne de piégeage C18 (p. ex., 3,6 μm, diamètre intérieur de la colonne 150 μm, diamètre extérieur 360 μm, longueur 5 cm) à un système de chromatographie liquide nanoflow à double pompe (p. ex., Waters NanoAcquity). Les solvants binaires sont A: 0,1% d’acide formique dans l’eau, et B: 0,1% d’acide formique dans l’acétyltrile.
      REMARQUE : La double pompe LC comprend une pompe de lavage et une pompe à gradient. Les deux pompes passent par deux étapes dans chaque analyse , une étape de piégeage suivie de l’étape analytique. Au stade du piégeage, la pompe de lavage s’écoule dans la colonne de piégeage et la pompe de gradient s’écoule dans la colonne analytique. Au stade analytique, la colonne de piégeage est couplée à la colonne analytique, et la pompe de gradient s’écoule dans les deux colonnes. La pompe de lavage va alors aux déchets.
    3. Étape de piégeage : Configurer la méthode LC pour charger d’abord 1 à 2 μg d’échantillon d’histone sur la colonne de piégeage. Desalt l’échantillon par la pompe à laver à 3 μL/min 5% solvant B pendant 10 min. Réglez la pompe analytique à 0,3 μL/min 5 % solvant B pour l’équilibrage.
    4. Étape analytique : Réglez la pompe de gradient (0,3 μL/min) pour commencer à partir de 5 % B et la rampe à 30 % à 15 min. Ensuite, passer à 41% B à 100 min avant un lavage organique élevé jusqu’à 95% B à la fin.
      REMARQUE : Le gradient peut être optimisé en fonction des différents profils de rétention sur les colonnes individuelles. Typiquement, les histones pleine longueur s’élit autour de 30%-40% B sur les conditions spécifiées de LC. Des gradients plus longs peuvent être utilisés pour augmenter le nombre de spectres MS2 pour capturer plus de protéoformes histones.
    5. Mettre en place une méthode d’acquisition dépendante des données sur un MS haute résolution (par exemple, Thermo Orbitrap Fusion Lumos ou similaire) avec une capacité de dissociation de transfert d’électrons (ETD). Utilisez le mode protéines intactes et effectuez tous les étalonnages nécessaires comme le suggère le fabricant. Les paramètres critiques sont décrits ci-dessous. Ceux-ci seront spécifiques à l’instrument utilisé.
      1. MS1: plage de balayage 600-2000 m/z, résolution 120k (à m/z 200), 4 microscans, cible AGC 1E6, injection maximale 50 ms.
      2. MS2: résolution 120k; 1 microscan; Cible AGC 1E6; MS/MS dépendant des données : END alterné (temps de réaction de 25 ms, temps d’injection maximum 500 ms) et dissociation collisionnelle à haute énergie (HCD, énergie de collision normalisée de 28 % avec ±5 % d’énergie intensifiée, temps d’injection maximum 100 ms); fenêtre d’isolement de 0,6 Da; priorité sur les États les plus chargés.
      3. Exclusion dynamique : fenêtre de temps de 120 s, ± de masse de 0,7 Da. Exclure les états de charge inférieurs à 5 et les états de charge indéterminés.
    6. Exécutez quelques injections de peptide ou d’histone sur de nouvelles colonnes pour équilibrer et vérifier le système, avant d’exécuter les échantillons réels. Pour l’exécution d’un grand nombre d’échantillons, ajoutez des blancs courts ou des lavages entre les échantillons pour minimiser le report. Laissez les colonnes équilibrer pendant 15-20 min à l’état de départ (5% solvant B) avant l’échantillon suivant.
      REMARQUE : Des gradients LC plus longs et un temps d’injection maximum plus élevé pour ms2 peuvent améliorer la qualité spectrale pour identifier plus de protéoformes d’histone.
  2. Traitement des données LC-MS et identification protéoforme
    1. Obtenez la séquence protéique (sorgho) en format FASTA auprès de JGI (https://genome.jgi.doe.gov) ou UniProt (https://www.uniprot.org/).
    2. Utilisez MSConvert21 (http://proteowizard.sourceforge.net/tools.shtml) pour convertir les fichiers de données brutes de l’instrument (*.raw) en format mzML.
    3. Téléchargez la suiteTopPIC 22 (http://proteomics.informatics.iupui.edu/software/toppic/) pour le traitement des données. Le programme peut être exécuté dans la ligne de commande ou par l’interface graphique.
    4. Utilisez TopFD dans la suite TopPIC pour déconvoluter les spectres du fichier mzML à partir de l’étape 4.2.2. Les paramètres par défaut peuvent être utilisés. Mais la « fenêtre précurseur » (-w) doit être réduite à 1 m/z parce qu’une fenêtre d’isolement étroite est utilisée.
    5. Utilisez TopPIC dans la suite TopPIC pour identifier les protéoformes. La plupart des paramètres par défaut peuvent être utilisés. Réglez le spectre et le type de coupure protéoforme en FDR (taux de fausse découverte) et réglez la valeur limite à 0,01 (1 % de FDR) ou comme vous le souhaitez. Réglez la « tolérance aux erreurs protéoformes » à 5 (Dalton). Chargez le fichier FASTA à partir de l’étape 4.2.1 et le fichier « *_ms2.msalign » à partir de l’étape 4.2.4. Ensuite, commencez la recherche.
      REMARQUE : Le paramètre « tolérance aux erreurs protéoformes » combinera des protéoformes avec des masses similaires (± 5 Da) comme une seule. Cela permet de réduire la redondance dans les comptes protéoformes. Cependant, il doit être utilisé avec prudence parce qu’une grande tolérance fusionnera les protéoformes avec de petites différences de masse ou pas. Ce paramètre n’est disponible que dans la version TopPIC 1.3 ou plus tard.
    6. Les protéoformes identifiés peuvent être examinés dans le fichier « *_proteoform.csv » ou visualisés à l’aide du module Topview sous le dossier « *_html » de la sortie.
    7. La liste des protéoformes générée à partir des étapes ci-dessus à l’aide de TopPIC annote les MNP histones comme des changements de masse. Afin de localiser les MNP individuels, une liste de modification doit être incluse. Une description détaillée se trouve dans le manuel TopPIC. Vous passez également à l’étape suivante pour effectuer une analyse complémentaire des données à l’aide du paquet23 (https://github.com/PNNL-Comp-Mass-Spec/Informed-Proteomics).
    8. Suivez les instructions et utilisez le module PbfGen pour convertir les données brutes de l’instrument en fichier PBF. Ensuite, déconvolutez les données MS1 à l’aide du module ProMex pour produire un fichier ms1ft (liste de fonctionnalités, chaque fonctionnalité représente une combinaison unique de masse et de temps de rétention).
    9. Créez un FASTA ciblé pour la protéomique informée à l’aide de la liste des protéines identifiées de TopPIC à l’étape 4.2.6.
      REMARQUE : La recherche sur l’ensemble du génome à l’aide d’une protéomique informée avec un grand nombre de MTC variables peut être extrêmement lente et causer des plantages. Par conséquent, il est recommandé de réduire la taille de FASTA en incluant uniquement les protéines cibles.
    10. Créez une liste de modification ciblée pour rechercher des MNP histones suivant le format dans le fichier d’exemple. Les M PTM communs à inclure sont : acétylation de lysine, monométhylation de lysine, di-méthylation de lysine, tri-méthylation de lysine, phosphorylation de sérine/threonine/tyrosine, acétylation n-terminale de protéine, oxydation de méthionine/cystéine. Pour le sorgho, la monométhylation n-terminale protéique, la diméthylation et la triméthylation doivent être ajoutées.
      REMARQUE : La protéomique informée ne recherche que les MTC spécifiés dans la liste. Si des MNP non spécifiés sont présents, le protéoforme peut ne pas être identifié ou être mal identifié à d’autres protéoformes. Toutefois, la liste PTM doit être tenue aussi courte que possible afin de minimiser le temps de recherche.
    11. Exécutez le module MSPathFinder pour identifier les protéoformes à l’aide des fichiers à partir de l’étape 4.2.8, de la FASTA focalisée de l’étape 4.2.9 et de la liste de modification de l’étape 4.2.10. Les paramètres par défaut peuvent être utilisés.
    12. Les résultats peuvent être visualisés dans LcMsSpectator en chargeant tous les fichiers de résultats.
      REMARQUE : D’autres outils bioinformatiques sont disponibles pour le traitement et la visualisation des données descendantes, chacune avec ses propresforces 24,25,26,27,28. Le sorgho et de nombreux autres organismes ont limité les informations connues concernant les MNP histones dans la base de données. Utilisez TopPIC d’abord pour identifier les changements de masse des MNP. Cette analyse peut facilement découvrir des MNP connus et inconnus. Ensuite, les MTM détectés peuvent être recherchés de manière ciblée soit en spécifier une liste PTM dans TopPIC, soit avec d’autres outils complémentaires.

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Résultats

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Suivant le protocole, les histones peuvent être extraites et identifiées à l’aide de l’analyse LC-MS. Les données brutes et les résultats traités sont disponibles chez MassIVE (https://massive.ucsd.edu/) via l’adhésion: MSV000085770. Sur la base des résultats toppic de l’échantillon représentatif (disponible également de MassIVE), nous avons identifié 303 protéoformes histones (106 H2A, 72 H2B, 103 H3 et 22 protéoformes H4). Des protéoformes ribosomiques co-purifiés ont également été détectés, s’échappant généralement tô...

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Discussion

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Le protocole présenté décrit comment extraire les histones des échantillons de feuilles de sorgho (ou plus généralement de feuilles de plantes). On s’attend à ce que le rendement moyen d’histone soit 2-20 μg par matériel de feuille de sorgho de 4-5 g. Les matériaux sont suffisamment purs pour l’analyse de l’histone en aval par LC-MS (principalement des histones avec ~20% de contamination par les protéines ribosomales). Un rendement plus faible peut être obtenu en raison de variations d’échantillons ou de défaillances pot...

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Remerciements

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Nous remercions Ronald Moore et Thomas Fillmore d’avoir aidé avec des expériences de spectrométrie de masse, et Matthew Monroe pour le dépôt de données. Cette recherche a été financée par des subventions du Département américain de l’énergie (DOE) Recherche biologique et environnementale dans le cadre du projet Epigenetic Control of Drought Response in Sorgho (EPICON) sous le numéro de prix DE-SC0014081, du département de l’Agriculture des États-Unis (USDA; CRIS 2030-21430-008-00D), et par l’intermédiaire du Joint BioEnergy Institute (JBEI), une installation parrainée par le DOE (Contrat DE-AC02-05CH11231) entre Lawrence Berkeley National Laboratory et DOE. La recherche a été effectuée à l’aide de l’Environmental Molecular Sciences Laboratory (EMSL) (grid.436923.9), un bureau du DOE de l’installation d’utilisateurs des sciences parrainé par le Bureau de la recherche biologique et environnementale.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AcétonitrileFisher ChemicalA955-4L
Dithiothréitol (DTT)Sigma43815-5G
EDTA, solution 500mM, pH 8,0EMD Millipore Corp324504-500mL
Acide formiqueThermo Scientific28905
Chlorhydrate de guanidineSigmaG3272-100G
MgCl2SigmaM8266-100G
Phosphate de potassium, dibasiqueSigmaP3786-100G
protéase, comprimés completsRoche5892791001
Butyrate de sodiumSigma303410-5GUtilisé pour l’inhibiteur de l’histone désacétylase
Chlorure de sodium (NaCl)SigmaS1888
Sodium FluorureSigmaS7020-100GUtilisé pour l’inhibiteur de la phosphatase
Orthovanadate de sodiumSigma450243-10GUtilisé pour l’inhibiteur de la phosphatase
SaccharoseSigmaS7903-5KG
Tris-HClFisher ScientificBP153-500 g
Triton X-100SigmaT9284-100ML
Résine échangeuse de cations faibles, maille 100-200 analytique (BioRex70)Bio-Rad142-5842
Disposables
Colonne de chromatographie (Bio-Spin)BIO-RAD732-6008
Mesh 100 Tissu filtrantMillipore SigmaNY1H09000Ceci fait partie du kit Sigma (catalogue # CELLYTPN1) pour l’extraction de noyaux de plantes. Des filtres similaires avec la même taille de maille peuvent être utilisés.
micropipette (P20, P200, P1000)Tube Sigma
, 50mL/15mL, Centrifugeuse, ConiqueGenesee Scientific28-103
Tube, Microcentrifugeuse, 1,5/2 mLSigma
Equipment
Balance analytiqueFisher Scientific01-912-401
Béchers ( 50mL &ndash ; 2L)
Microcentrifugeuse avec refroidissementFisher Scientific13-690-006
Micropipettes
Centrifugeuse à godet oscillant avec refroidissementFisher Scientific
VortexFisher Scientific50-728-002
Sonicateur à bain d’eauFisher Scientific15-336-120
Cocktail d’inhibiteurs de Pointes de

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Mots-clés

Isolement des histonesPurification des noyauxChromatographie d change d ionsModifications post traductionnellesChromatographie liquideAnalyse des prot oformesDessalage des prot ines

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