Article de méthode

Génération de modèles expérimentaux aigus et chroniques d’expression tic motrice chez le rat

DOI :

10.3791/61743

⸱

27 mai 2021

 ,  , 
1The Leslie & Susan Goldschmied (Gonda) Multidisciplinary Brain Research Center, Bar-Ilan University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons des protocoles pour générer des modèles expérimentaux aigus et chroniques d’expression tic chez les rats se comportant librement. Les modèles sont basés sur l’implantation de canules striatales et l’application ultérieure de l’antagoniste GABAA. Le modèle aigu utilise des injections transitoires tandis que le modèle chronique utilise des perfusions prolongées via une pompe mini-osmotique implantée sous-cutanée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les tics moteurs sont des mouvements soudains, rapides et récurrents qui sont les symptômes principaux du syndrome de la Tourette et d’autres troubles tiques. La pathophysiologie de la génération tic est associée à l’inhibition anormale des ganglions basiques, en particulier sa structure primaire d’entrée, le striatum. Dans les modèles animaux des rongeurs et des primates non humains, l’application locale des antagonistes de GABAA, tels que la bicuculline et la picrotoxine, dans les parties motrices du striatum induit la désinhibition locale ayant pour résultat l’expression des tics moteurs.

Ici, nous présentons des modèles aigus et chroniques de tics moteurs chez les rats. Dans le modèle aigu, les microinjections bicucullines par une canule implantée dans le striatum dorsal provoquent l’expression de tics durant de courtes périodes de temps allant jusqu’à une heure. Le modèle chronique est une alternative permettant l’extension de l’expression tic à des périodes de plusieurs jours voire semaines, en utilisant l’infusion continue de bicuculline via une pompe mini-osmotique sous-cutanée.

Les modèles permettent l’étude des mécanismes comportementaux et neuronaux de la génération tic dans toute la voie des ganglions cortico-basiques. Les modèles prennent en charge l’implantation de dispositifs d’enregistrement et de stimulation supplémentaires en plus des canules d’injection, permettant ainsi une grande variété d’utilisations telles que la stimulation électrique et optique et les enregistrements électrophysiologiques. Chaque méthode présente des avantages et des lacunes différents: le modèle aigu permet de comparer les propriétés cinématiques du mouvement et les changements électrophysiologiques correspondants avant, pendant et après l’expression des tics et les effets des modulateurs à court terme sur l’expression des tics. Ce modèle aigu est simple à établir; toutefois, il est limité à une courte période de temps. Le modèle chronique, bien que plus complexe, rend possible l’étude de la dynamique tic et des effets comportementaux sur l’expression tic sur des périodes prolongées. Ainsi, le type de requête empirique détermine le choix entre ces deux modèles complémentaires d’expression tic.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les tics sont le symptôme déterminant du syndrome de tourette (SS) et d’autres troubles tic. Les tics sont décrits comme des mouvements soudains, rapides et récurrents (tics moteurs), ou des vocalisations (tics vocaux)1. L’expression tic fluctue généralement dans ses propriétés temporelles (fréquence)2 et spatiales (intensité, emplacement du corps)3 sur plusieurs échelles de temps (heures, jours, mois et années). Ces changements sont affectés par différents facteurs, tels que les caractéristiquesenvironnementales 4,5,les états comportementaux6,7et la suppression volontaire et temporaire8.

Bien que le mécanisme neuronal régissant les tics moteurs ne soit pas encore entièrement compris, un nombre croissant d’études théoriques et expérimentales ont fourni de nouvelles preuves quant à sa nature9. Actuellement, la pathophysiologie de la génération tic est pensée pour impliquer la boucle cortico-basique des ganglions (CBG), et spécifiquement est associée à l’inhibition anormale du striatum, le noyau primaire d’entrée des ganglions de la base10,11,12. Des études antérieures chez les rongeurs et les primates ont démontré que le striatum peut être désinhibé par l’application locale de différents antagonistes du GABAA, tels que la bicuculline et la picrotoxine13,14,15,16,17,18. Cette intervention pharmacologique mène à l’expression tic passagère de moteur dans le côté contralatéral à l’injection, de ce fait établissant un modèle aigu robuste des désordres tic avec la validité de visage et de construction. Le modèle aigu est simple à induire et permet d’étudier les effets de la modulation à court terme tels que la stimulation électrique et optique concomitante aux enregistrements électrophysiologiques et cinématiques avant, pendant et après l’expression tic. Cependant, le modèle aigu est limité à la courte période suivant l’injection. Sur la base du modèle aigu, nous avons récemment proposé un modèle chronique de génération tic chez le rat qui utilise une infusion prolongée et à taux fixe de bicuculline au striatum via une pompe mini-osmotique sous-cutanée-implantée19. Ce modèle étend la période d’expression tic à plusieurs jours/semaines. La libération constante de bicuculline sur une longue période de temps permet l’examen des effets d’une variété de facteurs tels que les traitements pharmacologiques et les états comportementaux sur l’expression tic.

Ici, nous présentons des protocoles pour générer les modèles aigus et chroniques de l’expression tic chez les rats. En fonction de la question de recherche spécifique, les protocoles permettent le réglage fin des paramètres notamment l’implantation unilatérale ou bilatérale, le site du tics (selon l’organisation somatotopique du striatum)18 et l’angle de l’implant-canule (en fonction de l’emplacement des dispositifs implantés supplémentaires). La méthode utilisée dans le modèle chronique est partiellement basée sur des produits commerciaux, mais avec des ajustements critiques pour s’adapter au modèle tic. Cet article détaille les ajustements nécessaires pour personnaliser ces modèles de tics.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Toutes les procédures ont été approuvées et supervisées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux et ont respecté le Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire et les Lignes directrices de l’Université Bar-Ilan pour l’utilisation et le soin des animaux de laboratoire en recherche. Ce protocole a été approuvé par le Comité national pour les expériences sur les animaux de laboratoire du Ministère de la santé.

REMARQUE: Ce protocole utilise des rats Long-Evans femelles (modèles aigus et chroniques) et des rats Sprague Dawley femelles (modèle aigu) âgés de 3 à 10 mois, 280-350 g. La mise en œuvre de ces modèles dans d’autres souches, poids ou âges doit être testée avec soin pour différentes réactions.

1. Modèle aigu

  1. Préparation pré-opératoire
    1. Préparation implant-canule
      REMARQUE: L’implant-canule permet des injections bicucullines locales dans le striatum.
      1. Couper un hypo-tube en acier inoxydable de 25 G (DO 0,02'', ID 0,015'') pour obtenir une canule implantaire(figure 1,dispositif #1). Utilisez un outil rotatif pour obtenir des bords droits. La longueur de la canule dépend de la profondeur de la cible d’implantation, de l’angle d’implantation de la canule et de la hauteur finale du capuchon cimenté. La profondeur de la cible d’implantation doit être supérieure de 2 mm (0,079'') à celle de la cible d’injection finale pour prévenir les lésions tissulaires.
        Remarque : l’objet le plus élevé implanté détermine la hauteur du capuchon.
      2. Poncer et lisser les bords de l’implant-canule, empêchant une friction mécanique supplémentaire au cerveau. Insérez une aiguille de 30 G (0,01'') à travers elle pour éliminer toute obstruction interne.
    2. Préparation factice
      REMARQUE: Le mannequin est un fil interne amovible placé à l’intérieur de la canule implantée. Le mannequin scelle la canule implantée, empêchant ainsi son obstruction.
      1. Faites un mannequin en coupant un fil de 0,013'' avec un outil rotatif. Le mannequin doit être 3 mm (0,118'') de plus que la longueur de l’implant-canule(figure 1,dispositif #2).
      2. Insérez le mannequin dans la canule de l’implant jusqu’à ce qu’il atteigne la fin. Pliez l’excès de fil en le pinçant contre la canule. La partie pliée doit être rincée avec la canule de l’implant pour empêcher le mannequin de tomber de la canule implantée et pour empêcher le rat de l’enlever.
    3. Préparation de l’injecteur
      REMARQUE: L’injecteur, composé d’un tube flexible et d’une canule d’injection(figure 1,dispositif #3), permet une injection bicuculline directe dans le striatum.
      1. Couper un tube de microbore polymère souple de 70 cm (27.559'') (OD 0.06'', ID 0.02'')(Figure 1, dispositif #3.1).
        REMARQUE: La longueur du tube flexible est définie par la distance entre la cage expérimentale et l’emplacement de la machine de la pompe à perfusion. Il doit être assez long pour permettre la libre circulation du rat pendant la période d’injection, mais pas trop longtemps, pour éviter que le rat ne s’y emmêle (voir figure 3A).
      2. Couper un hypo-tube en acier inoxydable de 30 G (DO 0,012'', ID 0,007'') pour obtenir une canule d’injection(figure 1,dispositif #3.2). Utilisez un outil rotatif pour obtenir des bords droits. Il doit mesurer 5 mm (0,197'') de plus que la canule de l’implant: 2 mm (0,079'') de plus que la canule implantée dans le cerveau pour atteindre la cible d’injection finale, et 3 mm (0,118'') pour l’insérer dans le tube flexible.
      3. Poncer et lisser la pointe de la canule d’injection, empêchant une friction mécanique supplémentaire au cerveau. Insérez un fil de 0,005' de diamètre pour vérifier qu’il n’est pas obstrué.
      4. Insérer 3 mm (0,118'') de la canule d’injection dans le tube flexible et coller le joint entre eux, pour obtenir un injecteur. Utilisez de la colle cyanoacrylate (CA) et un accélérateur d’AC.
      5. Fixez une seringue avec une aiguille de 25 G (0,018'') remplie d’eau stérile à l’injecteur et lavez-la. Cela garantit que l’orientation de l’écoulement sortant de la canule d’injection est droite et sans effort. Surtout, si le flux n’est pas droit, utilisez la pointe de l’aiguille de 30 G (OD 0.01'') pour enlever les obstructions et agrandir le trou de la canule d’injection, et re-vérifier le débit.
    4. Préparation du porte-canule
      REMARQUE: Le porte-canule est connecté au bras stéréotaxique et tient la canule de l’implant pendant l’implantation. Le porte-canule se compose d’une base porte-canule et d’un support de canule en plomb, qui sont collés ensemble(figure 1,dispositif #4). Pendant l’implantation, la base porte-canule est attachée au bras stéréotaxique, et le fil porte-canule est attaché à la canule-implant.
      1. Base porte-canule: Coupe de 10 cm (3.947'') en acier inoxydable, hypo-tube de 22 G (OD 0.028'', ID 0.017'')(Figure 1,dispositif #4.1).
      2. Fil porte-canule : Couper le fil de 0,013'' sur une longueur de 3 mm (0,118'') plus longue que la canule-implant désirée(figure 1,dispositif #4.2).
      3. Insérez le plomb porte-canule dans la base du porte-canule et collez le joint entre eux, à l’aide de la colle CA et de l’accélérateur CA. Le plomb doit être 1 mm (0,039'') plus court que l’implant-canule, afin d’éviter les lésions tissulaires pendant l’implantation.
    5. Préparation de la bicuculline : dissoudre le méthodure bicucullin dans du liquide physiologique salin ou cérébrospinal artificiel (ACSF) jusqu’à une concentration finale de 1 μg/μL. Divisez la bicuculline dissoute en seringues de 1 mL, couvrez de papier d’aluminium et congelez à -20 °C jusqu’à ce que nécessaire. Si nécessaire, décongelez la seringue avant de l’utiliser.
  2. chirurgie
    1. Induire une anesthésie initiale en plaçant le rat dans une chambre conçue et délivrer 4-5% d’isoflurane mélangé avec un taux de 0,5-1 L/min. Ensuite, injectez au rat par voie intramusculaire (IM ou IP) un mélange de kétamine et de xylazine (100 et 10 mg/kg, respectivement).
    2. Rasez la tête du rat à l’aide d’une tondeuse électrique.
    3. Mettez du gel de lidocaïne dans les oreilles du rat. Mettez de la vaseline sur les yeux du rat pour éviter le dessèchement cornéen et les traumatismes.
    4. Fixez le rat dans le cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille et de barre de dents.
    5. Écouvillonnez le cuir chevelu du rat avec de l’iode povidone, puis avec une lingette à l’alcool pour stériliser la zone. Infiltrez le long de la ligne désirée d’incision avec la solution de lidocaïne de 0,5 - 1% par voie sous-cutanée (Sc). À l’aide d’une lame de scalpel, faites une incision le long du cuir chevelu.
    6. Tirez le fascia vers les bords pour ouvrir la zone chirurgicale.
    7. Nettoyez le crâne avec une solution saline stérile, à l’aide de cotons-tiges. En cas de saignement, utilisez un cautérisant pour cautériser le capillaire sanguin. Cette étape est cruciale pour la stabilité du plafond au fil du temps.
    8. Serrez le fascia avec quatre hémostatiques incurvés (deux antérieurs, deux postérieurs) pour agrandir le site chirurgical.
    9. Mesurez les coordonnées bregma et lambda. Nivellez les coordonnées dorsoventrales (DV) des deux points, de sorte qu’ils se situent dans une plage de 100 μm.
    10. À l’aide de l’appareil stéréotaxique, mesurer et marquer les coordonnées des zones d’intérêt et des vis d’ancrage à implanter. Les coordonnées de canule à implantation directe pour l’induction tic dans la zone des membres antérieurs sont : AP : +1 à +1,5, mL : ±2,5, DV : 3 ; zone hindlimb: AP: -0,4 à -0,5, mL: ±3,5, DV: 318,20.
      REMARQUE: En cas d’implantation de plusieurs dispositifs qui empêchent l’implantation de canule droite, modifiez l’angle d’implantation de la canule et ses coordonnées en conséquence (coordonnées des membres antérieurs: AP: +2,7, mL: ±2,5, DV: 3, angle 15 ° de l’antérieur au postérieur).
    11. Percez des trous dans le crâne au microscope. Utilisez une perceuse dentaire avec des fraises rondes en carbure de taille 1/4-1/2 bit. Pour minimiser les risques de lésions cérébrales, ajustez la vitesse de forage en fonction des compétences de forage et évitez toute pression mécanique. Percez jusqu’à ce que le cerveau soit visible, pendant environ 1 mm. Absorbez tout sang avec un coton-tige et lavez-le avec une solution saline stérile.
      REMARQUE: Les vis d’ancrage servent à stabiliser le capuchon. Assurez-vous que les vis sont situées dans les deux hémisphères et le long de l’axe antérieur-postérieur.
    12. Implantation de canules
      1. Vissez les vis d’ancrage dans les trous. Utilisez des vis en acier inoxydable #0 x 1/8.
        REMARQUE: Le nombre de vis d’ancrage dépend du nombre total de dispositifs implantés. Les vis de terre (par exemple pour les enregistrements électriques ou les stimulations électriques) doivent atteindre la surface du cerveau.
      2. Fixez le porte-canule au bras stéréotaxique.
      3. Faites glisser l’implant-canule sur le porte-canule. Positionnez lentement la canule de l’implant au-dessus du trou jusqu’à ce qu’elle atteigne le cerveau.
      4. Mesurez les coordonnées DV à partir de la surface du cerveau. Abaissez l’implant-canule jusqu’à la cible d’implantation. Absorbez tout sang sortant du trou avec un coton-tige, lavez-le avec une solution saline stérile, puis séchez bien.
      5. Collez la canule implantée sur le crâne à l’aide de colle en gel. Attendez jusqu’à ce que sec.
      6. Appliquez du ciment dentaire le long de la canule implantée pour l’attacher au crâne. Laisser s’étendre de 2 mm (0,079'') à partir de son extrémité supérieure pour permettre l’insertion du mannequin. Attendez jusqu’à ce que sec.
        REMARQUE: Ne mettez pas de ciment sur le porte-canule.
      7. Soulevez le porte-canule, en laissant la canule implantée en place.
      8. Insérez le mannequin dans la canule implantée.
      9. Implantez tous les autres dispositifs tels que les réseaux d’enregistrement, les fibres optiques, les électrodes de stimulation, etc. Appliquez du ciment dentaire sur le reste du crâne, en couvrant tous les implants.
      10. Injecter 3 mL de solution de Ringer à température ambiante et carprofène 5 mg/kg SC21.
      11. Surveillez le rat jusqu’à ce qu’il reprenne conscience (l’animal est debout, a le contrôle de ses voies respiratoires et n’est pas en danger d’aspiration). Retournez le rat dans sa cage d’origine pour une récupération complète.
  3. Micro-injections
    REMARQUE: Pendant l’injection, il est crucial de vérifier que le flux de la bicuculline est intact. Cela peut être fait en laissant une petite bulle d’air se former dans l’injecteur et en surveillant son mouvement. Le volume restant de l’injecteur peut être rempli de solution saline, de sorte qu’aucune bicuculline n’est gaspillée.
    1. Fixer l’injecteur à une seringue bicuculline avec une aiguille de 25 G (DO 0,018''). Remplissez ~ 1/3-1/2 de l’injecteur et retirez la seringue, ce qui permet la formation d’une petite bulle d’air.
    2. Fixer l’injecteur à une seringue stérile remplie de solution saline à l’aiguille de 25 G (DO 0,018''). Remplissez l’injecteur jusqu’à ce que la bicuculline atteigne la fin et qu’une petite goutte en sorte.
    3. Retirez le piston d’un microsyringe en verre de précision de 10 μL.
    4. Coupez et fixez un tube en polymère court-flexible (~ 3 cm, 1,181'') au microsyringe en verre de précision.
    5. Connectez l’autre extrémité du tube court-flexible à une seringue de 1 mL, aiguille de 25 G (OD 0.018'') remplie d’eau stérile.
    6. Injectez de l’eau à travers le tube court-flexible dans le microsyringe de verre de précision jusqu’à ce que de l’eau en sorte. Débranchez le tube court-flexible.
    7. Réinsérez le piston jusqu’à ce qu’il atteigne la marque d’environ 7 μL sur le microsyringe en verre de précision.
    8. Insérez le microsyringe en verre de précision dans la fente destinée à la pompe à perfusion.
    9. Fixez l’injecteur au microsyringe en verre de précision et configurez les réglages à un débit de 0,35 μL/min et à un volume total de 0,35 μL.
    10. Mettez une lingette en papier sous la pointe de l’injecteur. Marquez l’emplacement de la bulle d’air sur l’injecteur, démarrez la machine de pompe à perfusion et vérifiez qu’une goutte de bicuculline apparaît. Après l’injection, marquez à nouveau l’emplacement de la bulle d’air.
      REMARQUE: La différence entre les deux marques correspond à la différence souhaitée lors de l’injection expérimentale.
    11. Mettez le rat dans la cage expérimentale et retirez le mannequin.
    12. Insérez l’injecteur dans la canule implantée par l’extrémité (voir figure 3A).
    13. Démarrez la machine de pompe à perfusion. Vérifiez que la bulle d’air est en mouvement. Démarrez le chronomètre pour garder une trace des heures d’initiation et de fin des tics.
    14. Une minute après l’injection, retirez l’injecteur et réinsérez lentement le mannequin.
      REMARQUE: L’insertion du mannequin après l’injection pousse la bicuculline dans la cible d’injection.
  4. Post-injection
    1. Débranchez l’injecteur du microsyringe en verre de précision.
    2. Lavez la solution restante de l’injecteur à l’aide d’une seringue remplie d’air. Nettoyez l’injecteur avec de l’eau stérile, puis égouttez-le en injectant de l’air à travers l’injecteur.
    3. Débranchez le microsyringe en verre de précision de la machine de pompe à perfusion et nettoyez-le avec de l’eau stérile.

2. Modèle chronique

  1. Préparation pré-opératoire
    1. Préparation du guide de la canule
      REMARQUE: Le guide de la canule fait partie du tube d’infusion et est utilisé pour attacher la canule d’infusion au support de canule pendant l’implantation.
      1. Couper 12 mm (0,472'') d’acier inoxydable, 25 G (DO 0,02'', ID 0,015'') hypo-tube pour obtenir un guide de canule(figure 2,dispositif #1). Utilisez un outil rotatif pour obtenir des bords droits.
      2. Préparer un porte-canule comme décrit à l’étape 1.1.4. Insérez le porte-canule dans le guide de la canule pour vérifier qu’il est correctement attaché et retirez-le.
    2. Préparation infusion-canule
      REMARQUE: La canule d’infusion fait également partie du tube d’infusion. Il est implanté dans la cible finale du striatum et permet une perfusion focale de bicuculline.
      1. Couper en acier inoxydable, hypo-tube de 30 G (DO 0,012'', ID 0,007'') pour obtenir une infusion-canule. Utilisez un outil rotatif pour obtenir des bords droits. La longueur totale de la canule d’infusion est la somme de la profondeur d’implantation souhaitée plus un facteur de sécurité (~1-2 mm, 0,039''-0,079''), la partie pliante de la canule d’infusion (2 mm, 0,079''), le chevauchement avec le guide de la canule (3 mm, 0,118''), et la partie horizontale (4 mm, 0,157'')(Figure 2,dispositif #2).
        REMARQUE: Contrairement au modèle aigu, la profondeur d’implantation est égale à la cible de perfusion finale.
      2. Insérez un fil de 0,005'' de diamètre dans la canule d’infusion et pliez-les en forme de L à l’endroit prévu. La partie verticale correspond à la profondeur d’implantation souhaitée plus 4-5 mm (0,157''-0,197''), et la partie horizontale mesure 4 mm (0,157'') de long.
        REMARQUE: L’insertion du fil intérieur empêche l’obstruction de la canule pendant la flexion.
    3. Préparation flexible de tube de cathéter
      REMARQUE: C’est aussi un composant du tube de perfusion. Il relie la canule de perfusion à la pompe mini-osmotique via un adaptateur de tube.
      1. Couper 8 cm (3.149'') de tubes en polyéthylène (PE)-10 (ID 0.011'', OD 0.025'')(figure 2,dispositif #3).
        REMARQUE : La longueur du cathéter est déterminée par la distance entre la cible d’implantation et l’emplacement de la pompe, ce qui permet de déplacer librement la tête et le cou du rat (voir la figure 3B).
    4. Assemblage du tube de perfusion
      REMARQUE: Le tube de perfusion conduit la bicuculline de la pompe mini-osmotique au cerveau. Il se compose du guide de la canule, de la canule d’infusion, du cathéter flexible, de l’adaptateur de tube et du modérateur d’écoulement(figure 2).
      1. Retirez le fil interne de la canule à perfusion. Inspectez la canule au microscope pour vous assurer que ses bords sont ouverts et propres des deux côtés; sinon, utilisez une aiguille de 30 G (DO 0,01'') pour l’ouvrir.
      2. Collez le guide de la canule à la section verticale de la canule d’infusion, près de la partie plieuse, sur le chevauchement de 3 mm (0,118''), à l’aide de colle CA et d’accélérateur CA.
      3. Insérez la partie horizontale de la canule d’infusion dans le cathéter-tube flexible. Le chevauchement doit être d’au moins 2 mm (0,079'').
      4. Éjecter le capuchon translucide du modérateur de débit de la pompe. Cela révélera le court tube de canule en acier inoxydable(Figure 2,dispositif #5.1).
        REMARQUE: Le modérateur de flux fait partie du kit de pompe mini-osmotique. Il est composé d’un capuchon translucide, d’une courte canule, d’une bride blanche et d’une longue partie canule. La partie canule longue est insérée dans la pompe mini-osmotique et la partie canule courte est connectée au tube cathéter via un adaptateur de tube.
      5. Plongez l’adaptateur de tube(Figure 2,appareil #4) dans 70% d’alcool. Attendez quelques minutes pour laisser le matériau gonfler.
      6. Fixez l’adaptateur de tube à la partie canule courte du modérateur d’écoulement, jusqu’à ce qu’il touche la bride blanche(Figure 2,dispositif #5.2). L’adaptateur de tube rétrécira dans l’air pour former une connexion scellée étanche.
      7. Insérez le cathéter flexible dans l’extrémité ouverte de l’adaptateur de tube, jusqu’à ce qu’il touche la partie canule courte du modérateur d’écoulement.
      8. Maintenez la longue pièce de canule(Figure 2,dispositif #5.3) à l’aide d’un support de clip et collez toutes les connexions. Les connexions sont entre l’adaptateur de tube et la bride blanche, l’adaptateur de tube et le tube de cathéter flexible, et enfin le tube de cathéter flexible et la partie horizontale de la canule d’infusion. Attendez plusieurs heures jusqu’à ce que la colle soit complètement sèche (selon le type de colle).
        REMARQUE: Utilisez un adhésif compatible PE pour empêcher les connexions de se détacher.
      9. Injectez de l’eau stérile à travers la longue partie canule du tube de perfusion, à l’aide d’une seringue avec une aiguille émoussé de 27 G (0,014''). Vérifiez que l’eau s’écoule en douceur à travers la canule d’infusion. Injectez de l’air à travers le tube de perfusion pour drainer l’eau.
    5. Amorçage de la pompe mini-osmotique
      REMARQUE: L’amorçage est une procédure de démarrage qui permet à la pompe de démarrer la perfusion immédiatement après l’implantation.
      1. Remplissez un bain chauffant avec de l’eau à la température du corps (~ 37 ° C). Remplissez un petit bécher avec une solution saline stérile et placez-le dans le bain de chauffage.
      2. Enveloppez la mini pompe osmotique avec une lingette en papier et fixez-la verticalement avec l’ouverture tournée vers le haut, à l’aide d’un support de clip.
      3. Remplissez la pompe avec ACSF à l’aide d’une seringue avec une aiguille émoussé de 27 G (0,014''). Tout en retirant la seringue, continuez d’injecter l’ACSF pour empêcher l’air d’entrer. Une bulle ACSF apparaîtra dans l’ouverture de la pompe.
        REMARQUE: La perfusion initiale d’ACSF permet au rat de récupérer complètement de la chirurgie avant que les tics ne soient induits. Éventuellement, la pompe remplie de bicuculline peut être implantée lors de la chirurgie primaire pour éviter le remplacement de la pompe suivante, mais elle n’est pas optimale19.
      4. Fixez une seringue, 27 G (0,014'') aiguille émoussé à la longue canule-partie du tube de perfusion et injecter ACSF à travers elle. Tout en retirant la seringue, continuez à injecter l’ACSF, pour empêcher l’air d’entrer. Une bulle ACSF apparaîtra dans la longue partie canule.
      5. Insérez la longue partie canule dans la pompe, bulle à bulle. Une bulle ACSF devrait apparaître à l’extrémité de la canule d’infusion.
      6. Placez la pompe dans le bécher. Amorcez la pompe, fixée au tube de perfusion, pendant au moins 4 à 6 heures (à ~37 °C) avant l’implantation de la pompe. Assurez-vous que seule la pompe entre en contact avec la solution saline.
    6. Chirurgie d’implantation de pompe
      1. Anesthésier le rat selon le protocole d’anesthésie. Voir l’étape 1.2.1.
      2. Rasez la tête et le dos du rat, à l’aide d’une tondeuse électrique, légèrement postérieure aux omoplates.
      3. Effectuez les étapes de base de la chirurgie, comme décrit aux étapes 1.2.3-1.2.11. L’incision doit être le long du cuir chevelu jusqu’à l’os occipital.
      4. Stériliser un gros hémostatique (~14 cm de long, 5.512'') en autoclave. Insérez l’hémostatique à travers l’incision et créez une poche sous-cutanée dans le dos du rat en l’ouvrant et en le fermant alternativement sous la peau à travers la ligne midscapular.
        REMARQUE: La poche doit être assez grande pour contenir la pompe et lui permettre de se déplacer légèrement.
    7. Mini-pompe osmotique et implantation de tube d’infusion
      1. Fixez le porte-canule au bras stéréotaxique et placez-le dans la position souhaitée pour l’implantation.
      2. Retirez la pompe du bain de chauffage et placez-la sur le dos du rat recouvert d’une lingette en papier.
      3. Faites glisser le guide de la canule du tube d’infusion sur le porte-canule.
      4. Tenez la pompe avec un hémostatique et insérez-la doucement dans la poche sous-cutanée.
      5. Implantez les vis d’ancrage.
        REMARQUE: Implantez les vis d’ancrage après avoir inséré la pompe, pour éviter le blocage de l’ouverture de la poche, et avant l’implantation de la canule pour éviter le déplacement de la canule.
      6. Implantez la canule de perfusion dans la cible et collez-la sur le crâne à l’aide de colle en gel. Attendez jusqu’à ce que sec. Les coordonnées de l’induction des membres antérieurs sont : AP : +1 à +1,5, mL : ±2,5, DV : 5.
      7. Appliquez du ciment dentaire le long de la canule à perfusion pour le fixer au crâne. Attendez jusqu’à ce que sec.
      8. Soulevez le porte-canule en laissant la canule implantée en place.
      9. Implantez tous les autres dispositifs. Appliquez du ciment dentaire sur le reste du crâne, en couvrant tous les implants. Laissez suffisamment de cathéter flexible dans la poche sous-cutanée non fixée pour permettre la libre circulation du rat.
        REMARQUE: Assurez-vous qu’il n’y a pas de zones exposées entre le crâne et l’ouverture de la poche, et que le cathéter n’est pas plié.
      10. Finaliser la chirurgie comme indiqué aux étapes 1.2.12.10-1.2.12.11.
  2. Chirurgie de remplacement de pompe
    REMARQUE: Chaque type de pompe mini-osmotique a sa propre période de perfusion d’administration prédéterminée. Par conséquent, la chirurgie de remplacement de la pompe doit être effectuée avant la date d’expiration.
    1. Préparation pré-opératoire
      1. Répéter les étapes 2.1.5.1 à 2.1.5.2.
      2. Remplissez la pompe avec de la bicuculline à l’aide d’une seringue avec une aiguille émoussée de 27 G (0,014''). Tout en retirant la seringue, continuer à injecter bicuculline, pour empêcher l’air d’entrer.
      3. Insérez le modérateur de flux (attaché à son capuchon translucide) à l’intérieur de la pompe.
      4. Placez la pompe dans le bécher. Amorcez la pompe pendant au moins 4 à 6 heures (à ~37 °C) avant le remplacement de la pompe.
    2. chirurgie
      1. Anesthésier le rat (voir étape 1.2.1.1) et se raser le dos à l’aide d’une tondeuse électrique.
      2. Écouvillonnez le dos du rat avec de l’iode povidone, puis avec une lingette à l’alcool pour stériliser la zone. Infiltrez le long de la ligne désirée d’incision avec une solution de lidocaïne de 0,5-1% (SC).
      3. Faites une incision sur la peau au-dessus de la pompe implantée. Lavez la poche avec ACSF à température ambiante et séchez avec des tampons de gaze. Utilisez des rideaux jetables autoclavés pour couvrir la zone près de l’incision.
      4. Détachez la pompe remplie d’ACSF du modérateur de débit à l’aide d’un hémostatique et jetez-la.
      5. Retirez la pompe remplie de bicuculline du bain de chauffage. Détachez et jetez le modérateur d’écoulement de la pompe remplie de bicuculline.
      6. Fixez doucement la pompe remplie de bicuculline au modérateur d’écoulement implanté. Évitez de toucher la peau environnante.
        NOTA : Les étapes 2.2.2.4 à 2.2.2.6 doivent être effectuées rapidement pour prévenir les bulles d’air. Cependant, la pompe doit être insérée lentement pour empêcher l’entrée rapide de la bicuculline dans le cerveau.
      7. Appuyez sur les deux marges de l’incision étroitement ensemble, en utilisant une pince. Collez la ligne d’incision avec un adhésif tissulaire. Comme alternative, fermez l’incision à l’aide de sutures.
      8. Écouvillonnez la zone avec de l’iode povidone et finalisez la chirurgie comme indiqué aux étapes 1.2.12.10-1.2.12.11.

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Résultats

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Les protocoles de génération des modèles aigus et chroniques pour l’induction tic chez les rats ont été présentés ci-dessus. Les protocoles couvrent la préparation complète pour la chirurgie et les expériences(figure 1 pour le modèle aigu, figure 2 pour le modèle chronique). L’application de bicuculline dans les secteurs de moteur du striatum a comme conséquence l’expression du tics continu de moteur. Les tics apparaissent du côté controlatéral de l’application ...

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Discussion

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Dans ce manuscrit, nous avons détaillé les protocoles des modèles aigus et chroniques pour l’induction tic chez un rat se comportant librement. Ces protocoles décrivent la préparation de tous les composants, la chirurgie et le processus expérimental qui peuvent être adaptés pour la personnalisation afin de répondre à des besoins de recherche spécifiques. Le principe primaire sous-jacent à ces modèles est l’application locale directe de la bicuculline aux zones motrices du striatum, qui est connu pour jouer un rôle clé da...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude a été financée en partie par une subvention de l’Israel Science Foundation (ISF) (297/18). Les auteurs remercient M. Bronfeld d’avoir établi le modèle de rongeur aigu et M. Israelashvili pour ses commentaires.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Vis d’ancrageMicro FastenersSMPPS0002#0 x 1/8 - Tête cylindrique Vis à tôle
Micculline méthiodide bicullineSigma Aldrich14343
Accélérateur de cyanoacrylate (CA)ZapPT29
Colle cyanoacrylate (CA)BSIIC-2000Cette colle s’est avérée plus forte que les autres
Ciment dentaireColteneH00322Matériau de réparation de permanente hygiénique Regarnissage Résine Autopolymérisation
Gel de colleLoctiteUltra Gel Control
HemostatWPI501242Tout hémostat d’environ 14 cm serait suffisant
Hypo-tube, paroi extra-mince 25GEntreprise de fourniture de composantsHTX-25X
Hypo-tube, paroi régulière 22GEntreprise de fourniture de composantsHTX-22R
Hypo-tube, paroi régulière 30GEntreprise de fourniture de composantsHTX-30R
Machine de pompe à perfusionNew Era Pump SystemsNE-1000
Mini-pompe osmotiqueALZET20011.0µ ; l par heure, 7 jours
Adhésif compatible PECEYSPlastiques spéciaux difficiles (adapté au PE)
Tube de cathéter PE-10ALZETPE-10ID = 0,28 mm, OD = 0,61 mm
Microseringue en verre de précision, 10µ ; lHamilton800651701 RNR 10µ ; l syr (22s/51/3)
Adhésif tissulaire3M1469Sb
Vetbond Adaptateur de tubeCMA3409500
Tube à micro-alésage Tygon, 0,02 pouce ID * 0,06 ODEntreprise de fourniture de composantsTND80-020
Fil 0,005 pouceEntreprise de fourniture de composantsGWX-0050
Fil 0,013 pouceEntreprise de fourniture de composantsGWX-0130

Références

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Mots-clés

Motor TicsBicuculline MicroinjectionStriatal DisinhibitionChronic Infusion ModelAcute Tic ModelCannula ImplantationMini Osmotic PumpCortico Basal GangliaElectrophysiological RecordingsBehavioral Analysis

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