Article de méthode

Identification, isolement et caractérisation des progéniteurs fibro-adipogéniques (PAF) et des progéniteurs myogéniques (MP) dans le muscle squelettique chez le rat

DOI :

10.3791/61750

⸱

9 juin 2021

 ,  ,  , 
1Keenan Research Center for Biomedical Science, St Michaels Hospital, Unity Health Toronto, 2Department of Medicine and Interdepartmental Division of Critical Care Medicine, University of Toronto

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

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Ce protocole décrit une méthode pour isoler les progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) et les progéniteurs myogéniques (MP) du muscle squelettique du rat. L’utilisation du rat dans les modèles de lésions musculaires offre une disponibilité accrue des tissus du muscle atrophique pour l’analyse et un plus grand répertoire de méthodes validées pour évaluer la force musculaire et la démarche chez les animaux en mouvement libre.

Résumé

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Les progéniteurs fibro-adipogènes (PAP) sont des cellules interstitielles résidentes dans le muscle squelettique qui, avec les progéniteurs myogéniques (MP), jouent un rôle clé dans l’homéostasie musculaire, les blessures et la réparation. Les protocoles actuels d’identification et d’isolement des PAF utilisent la cytométrie en flux / tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et des études évaluant leur fonction in vivo à ce jour ont été entreprises exclusivement chez la souris. La plus grande taille inhérente du rat permet une analyse plus complète des PAF dans les modèles de lésions musculaires squelettiques, en particulier dans les muscles gravement atrophiques ou lorsque les chercheurs ont besoin d’une masse tissulaire importante pour effectuer plusieurs essais en aval. Le rat fournit en outre une plus grande sélection de tests fonctionnels musculaires qui ne nécessitent pas de sédation ou de sacrifice animal, minimisant ainsi la morbidité et l’utilisation des animaux en permettant des évaluations en série. Les protocoles de cytométrie en flux/FACS optimisés pour les souris sont spécifiques à l’espèce, notamment limités par les caractéristiques des anticorps disponibles dans le commerce. Ils n’ont pas été optimisés pour séparer les PAF des muscles rat ou hautement fibrotiques. Un protocole de cytométrie en flux / FACS pour l’identification et l’isolement des PAF et des MP du muscle squelettique de rat sain et dénervé a été développé, en s’appuyant sur l’expression différentielle des marqueurs de surface CD31, CD45, Sca-1 et VCAM-1. Comme les anticorps primaires spécifiques au rat et validés par cytométrie en flux sont sévèrement limités, une conjugaison interne de l’anticorps ciblant Sca-1 a été effectuée. À l’aide de ce protocole, la conjugaison Sca-1 réussie a été confirmée et l’identification cytométrique en flux des PAP et des MP a été validée par culture cellulaire et immunocoloration des PAP et des MSP isolés du FACS. Enfin, nous rapportons un nouveau cours temporel des PAF dans un modèle de dénervation prolongée (14 semaines) du rat. Cette méthode permet aux chercheurs d’étudier les PAF dans un nouveau modèle animal.

Introduction

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Les cellules progénitrices fibro-adipogènes (MAP) sont une population de cellules progénitrices multipotentes résidentes dans le muscle squelettique qui jouent un rôle essentiel dans l’homéostasie, la réparation et la régénération musculaires et, inversement, interviennent également dans les réponses pathologiques aux lésions musculaires. Comme leur nom l’indique, les PAF ont été identifiés à l’origine comme une population progénitrice ayant le potentiel de se différencier en fibroblastes et adipocytes1 et étaient censés être les principaux médiateurs de l’infiltration fibro-graisseuse du muscle squelettique dans les blessures et les maladies chroniques. Une étude plus approfondie a révélé que les PAF sont en outre capables d’ostéogenèse et de chondrogenèse2,3,4. Ainsi, ils sont plus largement notés dans la littérature comme des progéniteurs mésenchymateux oustromaux 3,5,6,7,8. Dans les lésions musculaires squelettiques aiguës, les PAF aident indirectement à la myogenèse régénérative en proliférant transitoirement pour fournir un environnement favorable aux cellules satellites musculaires activées et à leurs homologues progéniteurs myogéniques (MP) en aval1,9,10. Parallèlement à une régénération réussie, les PAF subissent une apoptose, ramenant leur nombre aux niveaux de base1,9,10,11. En revanche, dans les lésions musculaires chroniques, les FAP remplacent les signaux pro-apoptotiques, ce qui entraîne leur persistance9,10,11 et une réparation musculaire anormale.

Des études in vivo évaluant les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels les PAF interviennent dans les réponses musculaires ont utilisé des modèles animaux murins à ce jour1,7,9,10, 11,12,13,14. Bien que les souris génétiquement modifiées soient des outils puissants à utiliser dans ces analyses, la petite taille de l’animal limite la disponibilité des tissus pour l’étude dans des modèles de lésions localisées à long terme où l’atrophie musculaire peut être profonde, comme la dénervation traumatique. En outre, la mesure de la force musculaire et de la fonction physique nécessite des mesures ex vivo ou in situ qui nécessitent l’arrêt de la souris, ou des méthodes in vivo qui nécessitent une intervention chirurgicale et / ou une anesthésie générale pour permettre l’évaluation de la performance contractile musculaire15,16,17,18,19,20 . Chez le rat, il existe des analyses fonctionnelles musculaires bien validées et utilisées à l’échelle mondiale, en plus des analyses de comportements moteurs plus complexes tels que l’analyse de la démarche (par exemple, indice de la fonction sciatique, analyse CatWalk) et sont effectuées chez des animaux éveillés et en mouvement spontané21,22,23,24 . Cela optimise en outre les principes de morbidité minimale dans l’expérimentation animale et le nombre d’animaux de recherche utilisés. Le rat offre ainsi à l’investigateur des PAF la flexibilité supplémentaire d’un plus grand volume musculaire blessé pour les analyses protéiques et cellulaires et la capacité d’entreprendre des évaluations en série de l’activité et des comportements fonctionnels statiques et dynamiques complexes musculaires chez l’animal alerte.

Les PAF ont principalement été identifiés et isolés à partir d’échantillons de muscles entiers à l’aide de la cytométrie en flux et du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) respectivement. Il s’agit de tests laser capables d’identifier plusieurs populations cellulaires spécifiques en fonction de caractéristiques telles que la taille, la granularité et une combinaison spécifique de marqueurs de surface cellulaire ou intracellulaires25. Ceci est très avantageux dans l’étude d’un système d’organes tel que le muscle squelettique, car l’homéostasie et la régénération sont des processus complexes et multifactoriels coordonnés par une pléthore de types de cellules. Une étude séminale a identifié des PAF, ainsi que des MP, en utilisant des méthodes de cytométrie en flux dans le muscle squelettique de souris1. Ils ont démontré que les PAF sont de nature mésenchymateuse, car ils manquaient d’antigènes de surface spécifiques aux cellules d’origine endothéliale (CD31), hématopoïétique (CD45) ou myogénique (Intégrine-α7 [ITGA7]), mais ont exprimé le marqueur de cellules souches mésenchymateuses Sca-1 (antigène de cellules souches 1)1 et différenciés en cellules fibrogéniques et adipogéniques en culture. D’autres études ont démontré l’isolement réussi des progéniteurs mésenchymateux dans les muscles sur la base de l’expression d’un marqueur alternatif de cellules souches, le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRα)2,7,8 et une analyse plus approfondie a révélé qu’il s’agissait probablement de la même population cellulaire que les FAPs3. Les PAF sont maintenant couramment identifiés en cytométrie en flux en utilisant Sca-1 ou PDGFRα comme marqueur de sélection positif1,9,10,11,12,13,14,26,27,28,29,30,31 . L’utilisation de PDGFRα est préférentielle pour les tissus humains cependant, car un homologue humain direct de Sca-1 murin n’a pas encore été identifié32. En outre, d’autres protéines de surface cellulaire ont été rapportées comme marqueurs des MP (par exemple, VCAM-1), offrant une alternative potentielle à ITGA7 comme indicateur des cellules de lignée myogénique pendant l’isolement des PAF33.

Alors que la cytométrie en flux / FACS est une méthodologie puissante pour étudier le rôle et le potentiel pathogène des FAP dans le muscle squelettique1,9,10,11,13,29, elle est limitée techniquement par la spécificité et l’optimisation de ses réactifs requis. Étant donné que l’identification cytométrique en flux et l’isolement des PAP ont été développés et menés dans des modèles animaux murins1,9, 10,11,29, cela pose des défis aux chercheurs qui souhaitent étudier les PAE dans d’autres organismes modèles. De nombreux facteurs - tels que la taille optimale des tissus à traiter, ainsi que la spécificité et la disponibilité des réactifs et / ou des anticorps - diffèrent selon les espèces utilisées.

En plus des obstacles techniques à l’étude des PAP dans un nouveau modèle animal, ils ont été largement étudiés dans un contexte aigu et toxique - généralement par injection chimique intramusculaire ou cardiotoxine. L’évaluation de la dynamique à long terme des PAF se limite principalement à l’évaluation de la dystrophie musculaire de Duchenne, à l’aide du modèle de souris mdx9,10,11, et de modèles de lésions musculaires combinées telles que la déchirure massive de la coiffe des rotateurs où la transsection et la dénervation simultanées du tendon sont effectuées sur la musculature del’épaule26,27,28 . La réponse des PAF à la seule insulte de dénervation traumatique chronique, un phénomène fréquent dans les accidents du travail dans l’industrie lourde, l’agriculture et dans les traumatismes à la naissance (lésion du plexus brachial)34,35,36,37 avec une morbidité significative, n’a pas été aussi bien caractérisée, souvent limitée à une période de courte durée11,38.

Nous décrivons une méthode pour identifier et isoler les PAP et les MP des muscles squelettiques sains, sévèrement atrophiques et fibrotiques chez le rat. Tout d’abord, l’identification des MAP CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- et des MP CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+ à l’aide d’un protocole de digestion tissulaire et de coloration par cytométrie en flux est démontrée et la validation ultérieure de nos résultats est effectuée par culture et coloration immunocytochimique de cellules isolées du FACS. En utilisant cette méthode, nous rapportons également un nouveau cours temporel des PAF dans un modèle de lésion de dénervation isolée à long terme chez le rat.

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Protocole

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Les enquêteurs qui appliquent ce protocole doivent obtenir la permission de leur comité local d’éthique et de soins des animaux. Tous les travaux sur les animaux ont été approuvés par le Comité des soins aux animaux de Toronto unity de l’Hôpital St. Michael’s (ACC no 918) et ont été effectués conformément aux lignes directrices établies par le Conseil canadien des soins aux animaux (CCPA). Un schéma du protocole de cytométrie en flux est illustré à la figure 1. Si l’application en aval est FACS et la culture cellulaire ultérieure, toutes les étapes doivent être complétées avec une technique aseptique appropriée.

1. Récolte musculaire

  1. Anesthésier les rats à l’aide d’un anesthésique approprié et les sacrifier selon les directives locales du vivarium et du comité d’éthique animale. Ce protocole récolte le muscle gastrocnémien de rats Lewis femelles adultes (200-250 g), à titre d’exemple. Les rats ont été anesthésiés à l’aide de 2-3% d’isoflurane et ont été sacrifiés par injection intracardiaque de T61.
  2. Une fois que l’animal a été sacrifié, rasez tout le membre postérieur pour faciliter la localisation du muscle et minimiser la contamination de la fourrure du tissu récolté.
  3. À l’aide d’un scalpel stérile, faites deux incisions dans la peau: la première autour de la circonférence de l’articulation de la cheville et la seconde vers le haut de la ligne médiane de l’aspect médian du membre postérieur de la cheville à la hanche.
  4. Pelez la peau et les couches musculaires superficielles pour révéler le gastrocnémien sous-jacent, qui prend naissance aux condyles médiaux et latéraux du fémur et s’insère au tendon d’Achille.
  5. Utilisez une dissection contondante pour séparer le gastrocnémien du tissu environnant, en manipulant le muscle uniquement par le tendon pour éviter les blessures par écrasement.
  6. Séparez le gastrocnémien de son insertion en transectant le tendon d’Achille aussi distalement que possible avec des ciseaux tranchants. Une fois coupé, saisissez le tendon d’Achille avec une pince et pelez doucement le gastrocnémien de l’os sous-jacent. Toujours en tenant le muscle avec une pince dans une main, localisez les deux origines du gastrocnémien et coupez les condyles fémoraux médiaux et latéraux.
  7. Épongez doucement le gastrocnémien excisé contre un morceau de gaze stérile pour enlever autant de sang que possible. Coupez le muscle sur une surface stérile et enlevez tout excès de tissu conjonctif ainsi que le tendon d’Achille.
  8. Placez le muscle dans un bateau de pesage et pesez à l’aide d’une balance de précision. Ce protocole est optimisé pour digérer les muscles avec un poids humide allant de 200 à 600 mg. Les opérateurs peuvent subdiviser les tissus récoltés en excès pour d’autres essais en aval, s’ils le souhaitent.
  9. Divisez doucement le muscle récolté pour l’utiliser pour la cytométrie en flux en 3-4 petits morceaux (environ 1-2 cm3)et immergez-le dans 1x PBS glacé. Garder froid sur la glace jusqu’à ce que tous les échantillons aient été récoltés.

2. Digestion musculaire

  1. Retirer le muscle du PBS et le placer dans un plat stérile de culture cellulaire de 10 cm. Déchirez doucement et hachez le tissu avec une pince jusqu’à ce que les morceaux mesurent environ 3-4 mm 3 , en enlevantautantde tissu conjonctif que possible. Une fois bien haché, transférer dans un tube conique stérile de 50 mL contenant 6 mL de DMEM + 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S).
  2. Ajouter 10 μL de solution de CaCl2 de 300 mM à 365 μL de solution de collagénase II (concentration en stock de 4800 U/mL) pour activer l’enzyme collagénase. Ajouter la solution de collagénase II activée au tube conique de 50 mL contenant la boue tissulaire. La concentration finale de collagénase II est de 250 U/mL.
  3. Incuber les tubes dans un agitateur pendant 1 h à 37 °C, 240 x g, en veillant à tourbillonner manuellement toutes les 15 minutes pour déloger tout tissu qui a adhéré sur le côté du tube.
  4. Après 1 h, retirer les tubes de l’agitateur et ajouter ce qui suit par échantillon : 100 μL de collagénase II (4 800 U/mL) et 50 μL de Dispase (4,8 U/mL).
  5. Échantillons de pipette à l’aide d’une pipette sérologique 15 à 20 fois jusqu’à ce que la solution soit homogène. Si vous traitez plusieurs échantillons, utilisez une pipette stérile distincte pour chaque échantillon afin d’éviter la contamination croisée de l’échantillon.
  6. Incuber à nouveau dans un agitateur pendant 30 min à 37 °C et 240 x g. Après 15 min, secouez les échantillons à la main pour déloger le tissu adhérent du côté du tube.

3. Génération d’une suspension monocellulaire

  1. Cisaillez lentement les échantillons à travers une seringue de 10 mL avec une aiguille de 20 G pendant 10 cycles.
    REMARQUE: Un cycle consiste à prendre une solution musculaire dans une seringue et à la réinjecter dans un tube. Assurez-vous de minimiser les bulles en terminant le cisaillement lentement, car une mousse excessive peut entraîner une mort cellulaire supplémentaire39.
  2. Placez une passoire cellulaire de 40 μm sur un tube conique stérile de 50 mL et mouillez-la en pipetant 5 mL de DMEM + 10% FBS et 1% P / S.
  3. Pipette 1 mL de l’échantillon à la fois à travers la passoire cellulaire.
  4. Lavez la crépine à cellules en pipetant le DMEM avec 10% de FBS et 1% de P / S à travers la crépine pour porter le volume total dans le tube à 25 mL.
  5. Diviser 25 mL de l’échantillon également en deux tubes coniques de 15 mL et centrifuger à 15 °C, 400 x g pendant 15 min.
    REMARQUE: La division de la solution musculaire en deux tubes coniques de 15 mL assure une meilleure récupération cellulaire après centrifugation par rapport à un seul tube.
  6. Aspirer le surnageant et suspendre à nouveau la pastille dans 1 mL 1x tampon de lyse RBC (voir Fichier supplémentaire)à température ambiante pendant 7 min pour éliminer les érythrocytes.
  7. Porter le volume à 10 mL avec 9 mL de tampon de lavage (voir Fichier supplémentaire)et des tubes d’essorage à 400 x g,15 °C pendant 15 min.
  8. Aspirer le surnageant et recombiner les granulés en les remettant en suspension dans un tampon de lavage de 1 mL.
  9. Transférer un volume approprié de cellules dans un tube de microcentrifugation séparé de 1,5 mL et mélanger avec un colorant bleu trypan. Comptez les cellules vivantes au microscope optique à l’aide d’un hémocytomètre.

4. Coloration des anticorps pour la cytométrie en flux

REMARQUE: L’anticorps Sca-1 doit être conjugué à APC avant les expériences de cytométrie en flux / FACS, conformément aux instructions du fabricant. Les performances doivent être validées pour chaque lot de conjugués (Figure 2). Les conjugaisons finales peuvent être conservées dans des aliquotes de 20 μL à -20 °C et sont stables pendant trois semaines. Reportez-vous au dossier supplémentaire pour connaître le protocole de conjugaison complet.

  1. Pour la cytométrie en flux, transférer 1-2 x 106 cellules par échantillon expérimental dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL. Porter le volume jusqu’à 1 mL avec un tampon de lavage et placer sur de la glace.
  2. Pour chaque expérience, mettre en place les contrôles requis suivants : i) non colorés et ii) contrôles de viabilité pour sélectionner avec précision la population de cellules vivantes; iii) contrôles de fluorescence moins un (FMO) sur les suspensions à cellule unique afin de définir des portes précises pour les fractions CD31-/CD45-, les PAP et les MP; et iv) des billes de compensation à coloration unique pour corriger les débordements de fluorescence entre les canaux.
    1. Pour tous les contrôles cellulaires, aliquote 5 x 105 - 1 x 106 cellules dans 1 mL de tampon de lavage dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et placer sur la glace.
    2. Pour les témoins de perles, ajoutez 1 goutte de perles de compensation positive (~1,5 x 105 perles par goutte) à chaque tube de microcentrifugation de 1,5 mL étiqueté. L’ensemble des contrôles est répertorié dans le tableau 1.
      REMARQUE: Si l’expérience est réalisée pour la première fois, exécutez des témoins à coloration unique pour chaque anticorps conjugué sur des suspensions unicellulaires (en plus des témoins non colorés, viables, de compensation à coloration unique et FMO) afin d’évaluer la population colorée positive dans les cellules et de valider la coloration observée sur les perles de compensation. Validez chaque préparation Sca-1::APC fraîchement conjuguée en effectuant une coloration unique sur les billes de compensation et les suspensions à cellule unique. Reportez-vous au tableau 1 pour obtenir la liste complète des contrôles de coloration.
  3. Pour préparer le contrôle de viabilité, transférer la moitié du volume de cellules du tube de « viabilité » vers un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Étiquetez ce tube « Mort ».
  4. Incuber le tube « mort » à 65 °C pendant 2-3 min pour tuer les cellules, puis placer sur la glace. Après 2-3 min, re-combiner les cellules mortes avec les cellules vivantes restant dans le tube de contrôle de la viabilité. Cette population de cellules sera utilisée pour fixer des valeurs de compensation (si nécessaire) et définir correctement les portes du colorant de viabilité.
  5. Centrifuger les suspensions monocellulaires (échantillons expérimentaux et témoins) à 500 x g,4 °C pendant 5 min.
  6. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans un tampon de lavage de 100 μL.
  7. Ajouter des anticorps, selon l’échantillon expérimental ou le contrôle. Reportez-vous à la matrice de coloration (Tableau 2) pour obtenir des renseignements sur les combinaisons et les quantités d’anticorps.
  8. Faire glisser doucement chaque échantillon pour assurer un mélange complet et incuber sur de la glace dans l’obscurité pendant 15 min. Pour les perles de compensation, incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 15 min.
  9. Pour les échantillons expérimentaux et témoins de suspension à cellule unique, porter le volume à 1 mL en ajoutant un tampon de lavage de 900 μL. Pour les contrôles de billes de compensation, porter le volume à 1 mL avec 900 μL de 1x PBS.
  10. Centrifuger des échantillons de suspension monocellulaire à 500 x g,4 °C pendant 5 min. Le cordon de compensation de la centrifugeuse contrôle à 300 x g,4 °C pendant 5 min.
  11. Pour tous les échantillons de suspension à cellule unique, aspirer et jeter le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans un tampon de lavage de 300 μL. Pour les contrôles de perles de compensation, aspirer et jeter le surnageant, suspendre à nouveau la pastille dans 300 μL de 1x PBS, puis ajouter 1 goutte (~1,5 x 105) de perles de compensation négative.
  12. Conservez tous les échantillons de suspension monocellulaire sur de la glace sous du papier d’aluminium et procédez à l’acquisition cytométrique en flux. Les commandes de perles de compensation doivent également être protégées de la lumière, mais peuvent être maintenues à température ambiante.
    REMARQUE : Si le critère d’évaluation expérimental est l’identification des PAP par cytométrie en flux, veuillez suivre les étapes 5.1.1 à 5.1.11. Si le point final est l’isolement cellulaire via FACS pour la culture et la coloration, veuillez suivre les étapes 5.2.1 à 5.2.9 et les sections 6 à 7.

5. Cytométrie en flux et tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)

  1. Cytométrie en flux
    REMARQUE: Ce protocole utilise un cytomètre de flux de paillasse équipé de lasers de 405 nm, 488 nm et 640 nm capables de distinguer simultanément 10 couleurs différentes. Les filtres passe-bande et leurs fluorochromes associés utilisés dans ce protocole sont les suivants : 450/50 (SYTOX Blue), 530/30 (FITC), 575/25 (PE) et 670/30 (APC). Les tensions pour chaque détecteur sont les suivantes: FSC 700; SPC 475; FITC 360; PE 460; PE-Cy7 600; SYTOX Bleu 360; APC 570. Assurez-vous d’être formé au bon fonctionnement du cytomètre en flux ou du trieur de cellules avant utilisation.
    1. Assurez-vous que le cytomètre a été allumé pendant 10 à 20 minutes avant utilisation et qu’il a été amorcé en nettoyant séquentiellement avec des solutions de liquide propre, rinçage et gaine pendant 30 à 45 s chacune. Terminer par un rinçage avec dH2O. S’assurer qu’un volume adéquat de liquide de gaine a été ajouté au récipient de stockage pour maintenir un débit d’échantillon approprié tout au long de l’acquisition.
    2. Mettre en place la stratégie de contrôle pour identifier les PAP et les MP comme indiqué à la figure 3.
      REMARQUE : Les PAF et les MP sont identifiés par la stratégie de contrôle hiérarchique suivante : i) SSC-A vs FSC-A (zone de dispersion des cellules latérales par rapport à la zone de dispersion des cellules avant pour séparer les cellules par rapport aux débris), ii) FSC-W vs FSC-H (largeur de diffusion des cellules avant par rapport à la hauteur de dispersion des cellules avant pour distinguer les singlets des doublets dans le paramètre FSC), iii) SSC-W vs SSC-H (largeur de diffusion des cellules latérales par rapport à la hauteur de dispersion des cellules latérales pour distinguer les singlets des doublets dans le paramètre SSC), iv) SSC-A vs SYTOX Blue (pour distinguer les singlets vivants des singlets morts), v) SSC-A vs CD31/45::FITC (pour exclure les cellules CD31+ et CD45+ d’une analyse plus approfondie), et vi) Sca-1::APC vs VCAM-1::P E du CD31-/CD45- (Lignée; Lin-) population (identification des PAF et des députés). Les PAP sont identifiés comme des événements CD31-/CD45-/Sca-1+/VCAM-1- et les MP sont identifiés comme des événements CD31-/CD45-/Sca-1-/VCAM-1+.
    3. Exécutez d’abord chaque contrôle de bille de compensation à simple coloration à travers le cytomètre à basse vitesse pour générer des valeurs de compensation utilisées pour corriger tout débordement de fluorescence entre les canaux. Évaluez la compensation en comparant le signal fluorescent de chaque contrôle dans son propre détecteur (par exemple, SSC-A vs APC pour les billes à coloration unique Sca-1::APC) ainsi que tous les autres détecteurs. Il devrait y avoir deux populations distinctes (une avec un signal négatif et une avec un signal positif) dans le détecteur approprié et seulement une population négative dans tous les autres détecteurs. Réglez la porte d’arrêt sur 10 000 événements de perles de compensation et enregistrez les données.
      REMARQUE: Entre l’acquisition de chaque échantillon, assurez-vous de faire passer dH2O à travers le cytomètre pendant 10 à 20 secondes pour éviter toute contamination d’échantillon à échantillon.
    4. Ensuite, traitez les échantillons de contrôle non colorés et de viabilité pour qu’ils s’appuient correctement sur des cellules individuelles vivantes. Définissez la porte d’arrêt sur 10 000 événements singlet et enregistrez les données.
      REMARQUE : Environ 5 minutes avant l’acquisition de chaque échantillon de suspension à cellule unique, à l’exception de l’échantillon non coloré, ajouter 1 μL de colorant de viabilité SYTOX Blue (concentration de travail de 300 μM diluée à partir de 1 mM de solution mère) à chaque échantillon et faire glisser doucement pour mélanger (concentration finale de 1 μM).
    5. Ensuite, acquérez les échantillons de contrôle de suspension à cellule unique restants. Évaluer chaque contrôle FMO avec son tracé approprié dans la stratégie de contrôle (Figure 3). Par exemple, évaluez le signal FITC du FMO CD31+CD45 pour vous assurer d’une grille CD31-/CD45- précise. Un exemple optimal est illustré à la figure 3G. Si le protocole est exécuté pour la première fois, des contrôles à coloration unique sur les cellules doivent être exécutés avant l’acquisition des contrôles FMO.
    6. Évaluer le signal fluorescent de chaque échantillon de cellule colorée dans son détecteur approprié ainsi que dans tous les autres détecteurs pour valider la compensation appropriée. Réglez la porte d’arrêt sur 10 000 événements singlet en direct et enregistrez-les sur le logiciel.
    7. Une fois que tous les témoins (suspensions à cellule unique et billes) ont été traités, préparez tous les échantillons expérimentaux en mesurant et en enregistrant d’abord le volume de chaque échantillon. Ces mesures seront utilisées pour quantifier avec précision les PAF et les MP, comme décrit à l’étape 5.1.11. Ensuite, ajoutez 50 μL de billes de comptage de précision et mélangez doucement en pipetant de haut en bas 2-3 fois.
    8. Exécutez brièvement le premier échantillon expérimental pour valider l’identification de la population de billes de comptage. Cette population apparaît comme un petit groupe distinct distinct de la population cellulaire générale sur le diagramme FSC-A vs SSC-A(Figure 3A,encadré rouge). Créez une porte autour de la population de perles de comptage. Ensuite, acquérez des données pour chaque échantillon expérimental en les traitant à travers le cytomètre à basse vitesse. Réglez la porte d’arrêt sur 10 000 événements de perles de comptage et enregistrez.
      REMARQUE : Les enquêteurs peuvent également identifier les billes de comptage en mettant en place une placette supplémentaire évaluant la SSC-A par rapport à l’un des détecteurs, car les perles de comptage sont fluorescentes dans tous les détecteurs.
    9. Une fois que tous les échantillons ont été traités, nettoyez le cytomètre en utilisant les protocoles appropriés. Exportez toutes les données à des fins d’analyse.
    10. Ouvrez tous les fichiers de données sur un logiciel d’analyse de cytométrie en flux approprié. Définissez la stratégie de contrôle utilisée pour l’acquisition de données, comme décrit à l’étape 5.1.2. Examinez les contrôles dans le même ordre que dans l’acquisition de données (p. ex., non taché, viabilité, tache unique, puis contrôles FMO) pour revalider la stratégie de contrôle. Une fois que des portes précises ont été définies à l’aide de commandes FMO, appliquez les portes à tous les échantillons expérimentaux. Exportez les données brutes sous forme de feuille de calcul à des fins de quantification.
    11. Calculer le nombre de PAF et de MSP dans chaque échantillon expérimental à l’aide des perles de comptage :
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      où le nombre de cellules acquises est le nombre d’événements enregistrés de la population cellulaire pertinente (p. ex. PAF ou MP) sur le logiciel d’acquisition; Le nombre de perles acquises est le nombre d’événements enregistrés de comptage des perles sur le logiciel d’acquisition; Le volume de perles de comptage est le volume de solution de billes de comptage ajouté à l’étape 5.1.7; Le volume de l’échantillon est le volume de chaque échantillon expérimental coloré avant l’ajout de perles de comptage. La concentration de billes est le nombre de billes par solution μL; cette valeur se trouve sur la fiche technique du produit.
  2. FACS - tri pour la culture cellulaire
    REMARQUE: Ce protocole effectue FACS sur un trieur de cellules équipé de 4 lasers (UV, Violet, Bleu, Rouge) capable de distinguer simultanément 11-14 couleurs. Suivez le protocole expérimental de coloration de l’échantillon (section 4) et de cytométrie en flux, à l’exception des étapes 1 à 3 décrites ci-dessous, pour optimiser le flux de travail FACS :
    1. Augmenter la concentration de cellules dans les échantillons expérimentaux à trier à 7 x 106 cellules/mL pour générer des rendements robustes de PAE et de MSP.
    2. Pour tenir compte de cette augmentation significative de la concentration cellulaire, doubler toutes les concentrations d’anticorps dans les échantillons expérimentaux à trier.
    3. Traiter les échantillons finaux de cellules colorées à travers un bouchon de crépine cellulaire de 40 μM fixé à un tube de polystyrène de 5 mL immédiatement avant le tri afin de réduire l’agglutination des cellules et d’augmenter les rendements de tri.
    4. Collectez les PAP et les MP de rats vivants directement à partir du trieur de cellules dans un tube de collecte de polypropylène de 5 mL contenant 1 mL de sérum bovin stérile à 100 % fœtal (FBS). Gardez les cellules sur la glace jusqu’à ce que le tri soit terminé.
      REMARQUE : Si vous effectuez un FACS à un endroit hors site, transférez toutes les cellules triées sur de la glace et dans un conteneur sécurisé et couvert.
    5. En travaillant dans une armoire de biosécurité stérile (ESB), porter le volume de cellules triées jusqu’à 7 mL avec des milieux de croissance appropriés (p. ex., milieux de croissance FAP (FAP GM) pour les PAP triés et milieux de croissance MP (MP GM) pour les MP triés; voir Fichier supplémentaire pour les recettes) et centrifuger à 500 x g, 4 °C pendant 7 min pour éliminer autant de tampon de lavage résiduel que possible.
    6. Remettre en suspension les granulés dans 1 mL de milieu de croissance et de plaque appropriés dans une plaque de 12 puits contenant un couvercle/puits en verre stérile recouvert de collagène de 12 mm pour une immunocoloration ultérieure (voir rubrique 6).
      REMARQUE: Si la coloration immunocytochimique pour le collagène, plaque trier les cellules dans une plaque de 12 puits contenant un couvercle / puits stérile en verre recouvert de laminine de 12 mm, au lieu d’un revêtement en collagène. Si des expériences d’immunocytochimie de progéniteurs immédiatement isolés sont nécessaires, ensemencez les PAP et les MSP à une densité de 15 000 cellules par cm2 et passez directement à l’étape 6.1. Pour les cultures à long terme induisant la différenciation des progéniteurs, semer des FAP à une densité de 5 000 cellules par cm2,et des MPs à une densité de 7 500 cellules par cm2.
    7. Incuber des cellules à 37 °C et 5 % deCO2 dans un incubateur de culture cellulaire. Après 72 h dans la culture, changez la moitié des médias. Changez complètement le média tous les 2-4 j après.
    8. Pour induire le développement des myocytes, passez les cultures de MP au milieu de différenciation MP (MD) au jour 9 de la culture. Pour induire des adipocytes, passez les cultures de FAP à un milieu de différenciation adipogénique (MA) FAP au jour 10 de la culture.
    9. Pour induire la fibrogenèse, les PAP peuvent être basculés vers des milieux de différenciation fibrogénique (FD) à des moments variables pendant la culture, ou bien, peuvent être ensemencés directement dans des milieux FD après isolement (étape 5.2.6) (Voir fichier supplémentaire pour toutes les recettes de milieux).

6. Immunocytochimie des PAP et des MP en culture

  1. Pour valider le tri cellulaire et démontrer la pureté des cultures de FAPs et de MPs, l’immunocoloration avec des marqueurs spécifiques au type cellulaire, y compris PDGFRα (marqueur FAPs), Pax-7 (marqueur cellulaire souche musculaire [satellite]), Protéine spécifique des fibroblastes (FSP-1, marqueur fibroblastique), Perilipin-1 (Plin-1, marqueur adipocytaire), Collagène de type 1 (Col1a1, indicateur de fibrose), Chaîne lourde de myosine (CMH, marqueur myocytaire mature).
    1. Pour l’immunocoloration des cellules fraîchement triées, centrifuger la plaque de 12 puits à 200 x g pendant 3 min à température ambiante pour faciliter l’adhérence des cellules au couvercle/puits. Cette étape n’est pas nécessaire pour les cultures à long terme. Supprimer les milieux de culture.
    2. Pour l’immunocoloration avec FSP-1, fixez les cellules avec 1 mL de méthanol à 100 % (MeOH) pendant 2 min à 4 °C. En cas d’immunocoloration pour PDGFRα, Plin-1, Pax7 ou Col1a1, fixer des cultures cellulaires avec 1 mL 4% PFA dans 1x PBS pendant 15 min à température ambiante. L’immunocoloration du CMH tolère l’un ou l’autre fixateur.
      REMARQUE: Pour les cellules fixées au méthanol, sautez l’étape 6.2 et passez à l’étape 6.3.
  2. Aspirer 4% de PFA et laver rapidement les cultures cellulaires 3-4 fois avec 1x PBS. Ajouter 1 mL de glycine 100 mM dans 1x PBS et incuber pendant 10 min à température ambiante pour inactiver le PFA résiduel. Aspirer et laver 1-2 fois avec 1x PBS.
    REMARQUE: Les cellules peuvent être laissées à ce stade dans 2 mL de 1x PBS, enveloppées dans un film alimentaire et stockées à 4 ° C pendant 7 à 10 jours maximum.
  3. Après le lavage, ajouter 1 mL de Triton-X à 0,1 % dans 1x PBS et incuber pendant 20 min pour perméabiliser les membranes cellulaires.
  4. Lavez les puits 2-3 fois avec 1-2 mL de 1x PBS puis bloquez les cellules avec 1 mL de 1x PBS + 3% BSA par puits pendant 1 h à température ambiante.
  5. Pipette 80 μL d’anticorps primaire dilué dans 1x PBS + 3% BSA (PDGFRα 1:100, Pax7 neat, FSP-1 1:50, Plin-1 1:400, Col1a1 1:250, MHC 3 μg/mL) sur un morceau de parafilm scotché à un récipient mobile. À l’aide de pinces fines stériles, soulevez soigneusement le couvercle hors du puits et inversez la goutte de solution d’anticorps. Incuber le couvercle avec deux morceaux humides d’essuie-tout et de couvrir le récipient dans un film plastique pour éviter l’évaporation de la solution d’anticorps. Incuber toute la nuit à 4 °C.
    REMARQUE: La coloration des couvertures à l’extérieur du puits utilise moins d’anticorps (~ 80 μL) que la coloration à l’intérieur du puits (500 μL minimum).
  6. Le jour 2, laissez les couvercles à température ambiante pendant 30 minutes pour les réchauffer. En utilisant soigneusement les pinces à droite et transférer les couvercles vers leurs puits respectifs (cellules tournées vers le haut) et laver 2-3 fois avec 1-2 mL de 1x PBS pendant 2 min chacun pour enlever autant d’anticorps primaires que possible.
  7. En utilisant la même technique de coloration qu’avec la coloration des anticorps primaires, les cellules de coloration avec l’anticorps secondaire Alexa Fluor 488 anti-lapin de chèvre (1:400) pour détecter FSP-1, Plin-1, Col1a1 ou PDGFRα et l’anticorps secondaire alexa Fluor 555 anti-souris de chèvre (1:300) pour détecter le CMH ou Pax-7. Incuber les cellules pendant 1 h à température ambiante et protéger les cellules de la lumière.
  8. Renvoyer les cellules au puits et incuber les cellules avec Hoechst (1:10 000) pendant 2 à 4 minutes à température ambiante. Lavez les cellules encore 2-3 fois avec 1x PBS pendant 2 minutes chacune pour éliminer l’excès de Hoechst.
  9. Montez les couvercles sur des lames de verre à l’aide d’un support de montage fluorescent anti-décoloration et laissez les glissières sécher pendant la nuit dans l’obscurité à température ambiante. Rangez les couvercles montés à 4 °C dans l’obscurité.

7. Coloration à l’huile rouge O (ORO) des PAP et des MP cultivés

  1. Effectuer une coloration ORO sur des cellules non perméabilisées, car la perméabilisation de la membrane cellulaire peut entraîner une coloration non spécifique / indésirable des types de cellules non adipogènes. Avant de commencer la coloration, préparez un stock de travail ORO (voir le dossier supplémentaire pour la recette) et incubez à température ambiante pendant 20 min.
  2. Après 20 min, filtrer la solution à l’aide d’un filtre de 0,2 μm afin d’éliminer les agrégats non dissous.
  3. Aspirer le milieu du puits et ajouter 1 mL de formol tamponné neutre à 10 % (FBN à 10 %). Incuber pendant 5 min à température ambiante.
    REMARQUE: La confluence des cellules peut entraîner une levée du puits / couvercle. Faites attention lorsque vous aspirez/ajoutez des solutions.
  4. Aspirer et ajouter 1 mL de FBN frais à 10 % et incuber pendant au moins 1 h à température ambiante.
    REMARQUE: Le protocole peut être arrêté à ce stade, car les cellules peuvent être laissées dans 10% NBF pendant la nuit.
  5. Lavez rapidement les puits une fois avec 1 mL d’isopropanol à 60%, puis aspirez et laissez les puits sécher complètement (environ 2 min).
  6. Ajouter 400 μL de stock de travail Oil Red O par puits et incuber pendant 10 min à température ambiante, en veillant à éviter de pipeter tout ORO sur les parois de la plaque.
  7. Retirez tout le Oil Red O et lavez rapidement le puits 4 fois avec dH2O.
    REMARQUE: Si les puits colorés contiennent des couvercles, montez en utilisant la même technique que celle décrite à l’étape 6.9.
  8. Image soit monté sur des couvercles, soit le puits taché à l’aide d’un microscope à fond clair.

8. Coloration tissulaire des sections gastrocnémiennes controlatérales et dénervées du rat

  1. Picrosirius Rouge (PSR)
    1. Effectuer la coloration PSR sur des sections histologiques de rat gastrocnémien de 5 μm d’épaisseur, fixées au formol et incorporées dans la paraffine fixée au formol (FFPE), comme décrit précédemment40.
  2. Huile Rouge O (ORO)
    1. Fixer des coupes histologiques gastrocnémiennes de rat congelées à l’isopentane de 5 μm d’épaisseur dans du PFA à 4 % pendant 10 min, incuber dans de l’alcool isopropylique à 60 % pendant 1 min.
    2. Tache avec stock de travail ORO pendant 12 min. Incuber dans de l’alcool isopropylique à 60% pendant 1 min, laver pendant 10 min en dH2O. Monter sur des couvercles à l’aide d’un support de montage soluble dans l’eau.
  3. Sca-1 et immunohistochimie fluorescente des tissus de laminine (IHC)
    1. Effectuer un IHC fluorescent sur des coupes histologiques gastrocnémiennes congelées à l’isopentane de 5 μm d’épaisseur.
    2. Hydrater les échantillons dans 1x PBS pendant 5 min, fixer dans 4% PFA pendant 10 min puis incuber les échantillons dans une solution de blocage IF tissulaire (voir Fichier supplémentaire)pendant 90 min.
    3. Incuber avec un anticorps primaire anti-Sca-1 (1:500) dilué dans 1x PBS + 0,05% Tween à 4 °C pendant la nuit.
    4. Le jour 2, laver trois fois dans 1x PBS + 0,05% Tween pendant 5 min chacun, puis incuber dans l’anti-lapin de chèvre Alexa Fluor 555 (1:500) pendant 1 h.
    5. Laver à nouveau (comme précédemment), incuber avec une solution bloquante pendant 1 h, puis ajouter l’anticorps primaire anti-laminine (1:500) dilué dans 1x PBS + 0,05% Tween pendant 1 h.
    6. Laver à nouveau (comme précédemment), puis incuber dans de la chèvre anti-lapin Alexa Fluor 488 (1:500) pendant 1 h (pour la laminine).
    7. Laver à nouveau (comme précédemment) puis incuber dans DAPI (1:10 000) pendant 4 min. Lavez et montez sur les couvercles à l’aide d’un support de montage anti-décoloration.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Identification des PAP et des MP par cytométrie en flux à l’aide d’un nouveau panel d’anticorps comprenant Sca-1 et VCAM-1
La stratégie de contrôle pour identifier les PAF dans le muscle du rat est basée sur les protocoles de cytométrie en flux chez la souris29, qui portent sur les cellules positives CD31 (endothéliales) et CD45 (hématopoïétiques) (appelées lignée [Lin]) et examine le profil fluorescent du marqueur FAPs Sca-1 ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un protocole d’isolement des PAP optimisé et validé pour le muscle du rat est essentiel pour les chercheurs qui souhaitent étudier des modèles de blessures qui ne sont pas réalisables chez la souris pour des raisons biologiques ou techniques. Par exemple, les souris ne sont pas un modèle animal optimal pour étudier les lésions chroniques locales ou neurodégénératives telles que la dénervation à long terme. Biologiquement, la courte durée de vie et le vieillissement rapide des souris rendent difficile la délimitation préc...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier les installations de base de cytométrie en flux de l’Université d’Ottawa et le Keenan Research Centre for Biomedical Sciences (KRC) de l’Hôpital St Michaels Unity Health Toronto pour leur expertise et leurs conseils en matière d’optimisation du protocole de cytométrie en flux/FACS présenté dans ce manuscrit. Ce travail a été financé par Medicine by Design New Ideas 2018 Fund (MbDNI-2018-01) à JB.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube à fond rond en polypropylène de 5 mLFalcon352063
Tube à fond rond en polystyrène de 5 mL avec capuchon de filtrecellulaire Falcon352235
Boîtes de culture cellulaire de 10 cmSarstedt83.3902
Plaque de culture cellulaire à 12 puitsThermoFisher130185
lamelles en verre de 12 mm, n° 2VWR89015-724
Seringue 10 mLBeckton Dickenson302995
tubes à centrifuger 15 mLFroggaBio91014
Aiguille de calibre 20Beckton Dickenson305176
25mL Pipette sérologiqueSarstedt86.1685.001
40µ ; Filtre à cellules mFisher Scientific22363547
50mL tubes à centrifugerFroggaBioTB50
AbC Total Antibody Compensation Beads  ;ThermoFisherA10497
Chlorure d’ammonium, qualité réactifBioshopAMC303.500
Kit de conjugaison APC, 50-100µ ; gBiotium92307
Aquatex Milieu de montage aqueuxMerck108562
Biolaminin 411 LNBiolaminaLN411
Albumine sérique bovine (BSA)BioshopALB001
Chlorure de calciumBioshopCCL444.500
Collagénase Type IIGibco17101015
CountBright Plus Absolute Counting BeadsThermoFisherC36995
DexaméthasoneMillipore SigmaD4902
DispaseGibco17105041
Dulbecco' s Eagle Medium modifié (DMEM) (1X)Gibco11995-065(+)4,5 g/L D-Glucose
(+)L-Glutamine
(+)110 mg/L Pyruvate de sodium
EDTAFisherScientificS311
FACSClean SolutionBeckton Dickenson340345
FACSDiva SoftwareBeckton Dickenson--
SolutionBeckton Dickenson
Sérum fœtal bovinSigmaF1051
Cytométrie en flux Fluide de gaineBeckton Dickenson342003
Logiciel FlowJo BecktonDickenson--Fluorescent
Montage MediumDakoS302380-2
Chèvre anti-souris Alexa Fluor 555 Anticorps secondaireInvitrogenA21424
Anticorps secondaire anti-lapin Alexa Fluor 488InvitrogenA11008
Anticorps secondaire anti-lapin Alexa Fluor 555InvitrogenA21429
Sérum de chèvreGibco16210-064
Média F10 de jambonThermoFisher  ;11550043(+) Rouge de phénol
(+) L-glutamine
(-) HEPES
Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS) (1X)Multicell311-513-CL
Sérum de cheval inactivé par la chaleurGibco26050-088
HémocytomètreReichertN/A
HEPES, titrage minimum de 99,5SigmaH3375
Sérum de chevalThermoFisher16050130
Facteur de croissance transformant l’homme &beta ; 1 (hTGF-&beta ; 1)Signalisation cellulaire8915LF
Humulin RLillyHI0210
IBMXMillipore SigmaI5879Aussi connu sous le nom de 3-Isobutyl-1-méthylxanthine
IsopropanolSigmaI9516Aussi connu sous le nom de 2-propanol
Lewis Rat, femelleCharles River Kingston004 (Code de souche)200-250 grammes utilisés
LSRFortessa X-20 Cytomètre de paillasseBeckton Dickenson--Microcentrifugeuse
EppendorfEP-5417R
MoFlo XDP Trieur de cellulesBeckman Coulter--
 ::FITC AnticorpsAbcamab33858Clone TLD-3A12
Souris Anti-CD45 ::FITC AnticorpsBiolegend202205Clone OX-1
Souris Anti-CD106 ::P E Antibody Biolegend200403Aussi connu sous le nom de VCAM-1
Mouse Anti-MHCDevelopmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/AAussi connu sous le nom de MF20
Mouse Anti-Pax7Developmental Studies Hybridoma Bank (DSHB)N/A
Neutral Buffered Formalin, 10 %SigmaHT501128
Oil Red OMillipore SigmaO0625
Kit de conjugaison PE-Cy7Abcamab102903
Pénicilline-StreptomycineSigma  ;P4333
Solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4 (1X)Gibco10010-023(-)Chlorure de calcium
(-)Chlorure de magnésium
Bicarbonate de potassium, qualité réactifBioshopPBC401.250
Anticorps anti-fibroblaste spécifique de lapin 1 (FSP-1)InvitrogenMA5-32347FSP-1 également connu sous le nom de S100A4
Anticorpsanti-intégrine-a7 de lapinAbcamab203254
Anticorps anti-laminine de lapinSigmaL9393
Anticorps anti-périlipine-1 de lapinAbcamab3526
Anticorps anti-Sca-1 de lapinMillipore SigmaAB4336
Anticorps anti-collagène de type I de lapinAbcamab260043Également connu sous le nom de Col1a1
Lapin recombinant anti-PDGFR Anticorps alphaAbcamab203491
Homme recombinant FGF-basicGibcoPHG0266
Sodium AzideSigmaS2002
Triton-X-100Fisher ScientificBP151
TroglitazoneMillipore SigmaT2573
Tween-20BioshopTWN510
FACSRinse 340346 % souris Anti-CD31

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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