Profilage cellulaire à haut débit de composés de dégradation de protéines ciblés à l’aide de lignées cellulaires HiBiT CRISPR

La dégradation ciblée des protéines est devenue l’un des domaines à la croissance la plus rapide dans la découverte de médicaments à petites molécules, grandement renforcée par le succès thérapeutique des composés de colle moléculaire immunomodulateurs (par exemple, IMiD) pour le traitement du cancer, et les données prometteuses des premiers essais cliniques de Protéolyse ciblant les composés chimères 1,2,3,4,5,6,7,8^{, 9,10,11,12}. Les composés de dégradation des protéines ciblés fonctionnent en rapprochant une protéine cible des protéines de machinerie E3 ligase 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Ce recrutement induit par le composé de la protéine cible dans la ligase E3 conduit à l’ubiquitination et à la dégradation de la protéine cible via la voie protéasomale de l’ubiquitine (UPP)1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12 . Historiquement, les programmes de criblage de la découverte de médicaments à petites molécules se sont appuyés sur des tests biochimiques initiaux pour évaluer l’activité et classer les composés par ordre. Ceci, cependant, a présenté un défi important pour les dégradateurs de protéines ciblés dont l’activité ultime, la dégradation via le protéasome, dépend d’une cascade d’événements cellulaires 1,2,4,5,6,11,12,13,14,15,16,17^{, 18}. Les multiples voies et la complexité des complexes protéiques nécessaires à la dégradation réussie de la cible nécessitent des approches d’essai cellulaire pour le criblage précoce et le triage des composés initiaux. Actuellement, la disponibilité des technologies permettant de surveiller la dégradation des protéines cibles à haut débit dans le contexte de l’environnement cellulaire fait cruellement défaut¹⁴. Ici, nous présenterons des protocoles pour l’évaluation en temps réel de l’activité de dégradation lytique des cellules vivantes cinétiques ou des critères finaux à l’aide des lignées cellulaires cibles HiBiT marquées de manière endogène^CRISPR / Cas9 18,19,20 pour surveiller la perte de la protéine cible via une mesure luminescente après traitement avec des composés dégradateurs^10,11,18,19.

Pour réussir la dégradation des cibles thérapeutiques et étendre le protéome médicamentable, de nombreuses approches et types de dégradateurs ont émergé qui peuvent cibler un large éventail de protéines pour la destruction, y compris celles localisées au niveau ou dans la membrane plasmique, les lysosomes, les membranes mitochondriales, le cytoplasme et le noyau^21-57. Les deux principales classes de composés les plus étudiées sont les colles moléculaires et les protéines ciblant les cimères 2,4,5,6,7,12,26. Les colles moléculaires sont monovalentes, donc généralement de plus petite taille, et facilitent une nouvelle interface d’interaction protéine/protéine avec une protéine cible lors de la liaison à un composant de la ligase E3 ^2,12,26. Ce sont le plus souvent des dégradateurs qui se lient^{au composant} 2,12,26,55,56,57 du Cereblon (CRBN) E3. Récemment, de nouveaux exemples passionnants utilisant d’autres machines E3 ligase telles que DCAF15^58,59,60 et le recrutement CDK / Cyclin à DDB1⁴⁵ montrent le potentiel d’expansion de cette classe de composés. En revanche, les PROTACs sont des molécules bivalentes plus grosses, constituées d’un ligand de liaison cible, le plus souvent un inhibiteur, ponté via un agent de liaison chimique à une poignée de ligase E3 1,3,4,5,7,13. En tant que tels, ces composés sont capables de se lier directement à la fois à la ligase E3 et à la protéine cible 1,3,4,5,7,13. De nombreuses protéines se sont dégradées via ces molécules bivalentes, et les poignées de ligase E3 les plus utilisées recrutent soit CRBN, soit Von Hippel Lindau (VHL)1,3,4,5,7,13. Cependant, le nombre de poignées disponibles pour le recrutement de la ligase E3 chez les chimères ciblant la conception de la protéolyse augmente rapidement, élargissant les capacités de cette classe de composés ayant le potentiel de dégrader diverses classes cibles ainsi que d’améliorer la spécificité des types cellulaires ou tissulaires 24,48,61,62 . Combinés à l’exigence minimale d’engager une protéine cible, même avec une affinité marginale, les composés de dégradation sont prometteurs pour l’expansion du protéome médicamentable.

La caractérisation de la dynamique cellulaire de la perte de protéines, ainsi que la récupération potentielle des protéines après le traitement, est essentielle pour comprendre la fonction et l’efficacité des composés de dégradation. Bien qu’il soit possible d’étudier les changements de niveau de protéines endogènes dans les systèmes cellulaires pertinents à l’aide de tests d’anticorps Western blot ou de spectrométrie de masse, ces approches sont difficiles à adapter aux formats de criblage à haut débit, ont une capacité de quantification limitée ou la capacité de mesurer les changements cinétiques à de nombreux points temporels¹⁴. Pour relever ces défis, nous avons développé un système luminescent cellulaire à base de plaques pour surveiller les changements dans les niveaux de protéines endogènes, qui utilise l’insertion génomique via CRISPR / Cas9 de l’étiquette de 11 acides aminés, HiBiT, aux loci de toutes les cibles de dégradation clés^18,19,20. Ce peptide complète avec une grande affinité avec son partenaire de liaison, LgBiT, pour produire une luminescence brillante en présence de son substrat 18,19,20,63, rendant ainsi ces protéines endogènes marquées luminescentes dans les cellules ou les lysats 18,19,20,63 . Les unités de lumière relative (RLU) mesurées avec un instrument luminomètre sont directement proportionnelles aux niveaux de protéines cibles marquées 18,19,20,63. Avec le développement de substrats stabilisés de luciférase, des mesures en temps réel du niveau de protéines cinétiques sur des périodes de 24 à 48 heures sont possibles 18,53,64. Cela permet de déterminer un profil de dégradation complet pour une cible donnée à une concentration de composé donnée, y compris une analyse quantitative du taux de dégradation initial, du maximum de dégradation (Dmax) et de la récupération après traitement du composé^18,53. Cependant, si vous criblez de grandes banques de composés de dégradation, l’analyse des paramètres peut également être facilement effectuée au format 384 puits à diverses concentrations de médicaments et à des moments désignés.

Les protocoles présentés dans ce manuscrit représentent des stratégies de criblage cellulaire pour les composés de dégradation des protéines ciblés, applicables à tous les types de dégradateurs. L’utilisation de lignées cellulaires HiBiT CRISPR avec ces protocoles ne se limite cependant pas à la dégradation des protéines, mais plutôt à des outils généraux pour surveiller tout niveau de protéine cible endogène qui pourrait être modulé post-traitement pour étudier l’impact des composés ou même des mécanismes de résistance 20,65,66. Une condition préalable à ces méthodes de détection luminescentes est une lignée cellulaire cible HiBiT marquée de manière endogène CRISPR, ce qui est essentiel car elle permet une détection luminescente sensible, tout en maintenant l’expression de la cible endogène et la régulation du promoteur natif^18,19,20. Des progrès significatifs ont été réalisés dans l’utilisation de CRISRP / Cas9 pour l’insertion de balises génomiques, en particulier dans l’évolutivité 20 et avec la haute sensibilité de détection, dans divers formats, y compris les pools CRISPR ou les clones avec insertions alléliques hétérozygotes ou homozygotes^18,19,20. L’utilisation d’une expression exogène de HiBiT ou d’autres fusions rapporteures dans les cellules au lieu d’un marquage endogène est possible, mais des précautions importantes doivent être prises en utilisant des systèmes présentant une surexpression protéique^14,18. Ceux-ci peuvent conduire à des artefacts dans la compréhension de la véritable puissance des composés et de la dynamique de récupération des protéines^14,18, y compris des boucles de rétroaction transcriptionnelles potentielles activées après la dégradation de la cible. En outre, les composés à un stade précoce à faible puissance pourraient être manqués et se présenter comme des faux négatifs lors du dépistage. Comme la perte de protéines pourrait résulter d’une toxicité induite par un composé et de la mort cellulaire, les protocoles décrits ici contiennent des tests luminescents ou fluorescents hautement recommandés, mais facultatifs, associés au protocole de dégradation. Le protocole comporte deux sections principales, le critère d’évaluation lytique et le criblage cinétique des cellules vivantes. Dans chacune de ces sections, des options sont incluses pour les mesures de viabilité des cellules multiplexées dans les formats final ou cinétique. La surveillance des changements de la protéine endogène marquée nécessite une complémentation avec LgBiT dans les cellules. Par conséquent, la section de criblage cinétique fait référence à des protocoles importants pour l’introduction de celui-ci, qui peut être réalisé par expression transitoire ou stable et est essentiel pour effectuer les mesures luminescentes sur cellules vivantes. Toutes les approches présentées ici permettent un classement rapide et une évaluation de l’activité des composés, ce qui permet des efforts de criblage précoce des composés et une identification plus rapide des dégradateurs de plomb.

Ce protocole est conçu pour l’étude des composés de dégradation en conjonction avec une lignée cellulaire HiBiT CRISPR. Les protocoles de génération d’insertions HiBiT CRISPR pour de nombreuses cibles ont été décrits dans plusieurs publications récentes^18,19,20.

1. Études de dégradation des critères d’évaluation avec des protéines cibles HiBiT CRISPR au format lytique avec analyse de fluorescence de viabilité cellulaire facultative

1. Préparation et placage de lignée cellulaire adhérente ou en suspension de mammifères
   1. Ajuster la densité cellulaire à 2,22 x 10⁵/mL par dilution dans un milieu cellulaire approprié utilisé pour le passage et la croissance cellulaire.
   2. Distribuer les cellules dans des plaques avec un minimum de 3 puits par condition expérimentale et témoin. Distribuer 90 μL (20 000 cellules) par puits de suspension cellulaire dans des plaques blanches à 96 puits. Pour le format 384 puits, distribuer 36 μL (8 000 cellules) par puits de suspension cellulaire dans des plaques blanches de 384 puits.
2. Préparation et addition de composés
   1. Préparer des plaques PROTAC ou des plaques de composés d’essai de dégradateur diluées en série à une concentration finale de 1 000 fois dans du DMSO à 100 %. Ensuite, diluez-le à 10x la concentration finale dans le milieu de culture cellulaire. Ajouter un volume égal de DMSO au support, à utiliser comme contrôle DMSO non composé.
   2. Pour le format 96 puits, ajouter 10 μL de 10x composés et solutions témoins à 90 μL de cellules. Pour un format 384 puits, ajoutez 4 μL de solutions composées et témoins 10x à 36 μL de cellules.
   3. Incuber les plaques dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO₂ pendant la durée souhaitée ou dans des conditions optimales pour leur croissance.
      NOTA: Comme il s’agit d’un essai sur les paramètres finaux, l’essai de plusieurs points temporels nécessitera la préparation de plaques de dégradation distinctes pour chaque point temporel, comme décrit à l’étape 1.1.2 ci-dessus. Les temps d’incubation pour détecter la dégradation médiée par les composés sont très variables et dépendent probablement de la concentration du composé. Les points de temps initiaux suggérés seraient 6 h et 24 h.
   4. Si vous mesurez la détection luminescente du point final sans la mesure facultative de la viabilité de la cellule, passez directement à l’étape 1.3 ci-dessous. Si vous effectuez un multiplexage avec mesure de viabilité de cellule, passez à la section 1.4 suivante ci-dessous.
3. Mesure lytique des cellules
   1. Immédiatement avant les mesures lytiques HiBiT, préparer 2x réactif de détection lytique en ajoutant 20 μL de substrat lytique et 10 μL de protéine LgBiT par 1 mL de tampon lytique. Préparer suffisamment de réactif de détection 2x pour le nombre de puits à analyser, y compris un volume supplémentaire pour tenir compte de l’erreur de pipetage (c.-à-d. nombre de puits + 10%).
   2. Ajouter un réactif de détection lytique préparé aux cellules. Pour le format à 96 puits, ajouter 100 μL de 2x réactif de détection lytique à chaque puits contenant 100 μL de cellules. Pour un format à 384 puits, ajouter 40 μL de 2x réactif de détection lytique à chaque puits contenant 40 μL de cellules. Mélanger la plaque sur un mélangeur vortex à microplaques pendant 10-20 min à 350 tr / min.
   3. Mesurer la luminescence sur un luminomètre capable de lire la luminescence dans une plaque de 96 ou 384 puits.
4. Multiplexage de viabilité cellulaire en option
   REMARQUE: Cette étape est effectuée à l’aide d’un kit CellTiter-Fluor (CTF) disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
   1. 30 à 40 minutes avant la mesure souhaitée, préparer une solution de réactif de détection de viabilité cellulaire 6x en ajoutant 10 μL du substrat à 2 mL du tampon de dosage. Préparer suffisamment de réactif 6x pour chaque puits à analyser, y compris le volume supplémentaire pour l’erreur de pipetage (c.-à-d. nombre de puits + 10%).
   2. Ajouter le réactif préparé aux puits. Pour le format 96 puits, ajoutez 20 μL de réactif 6x à chaque puits contenant déjà un volume de 100 μL. Pour un format 384 puits, ajoutez 8 μL de réactif 6x à chaque puits contenant 40 μL de cellules. Mélanger brièvement sur un mélangeur vortex à microplaques, puis incuber la plaque pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C.
   3. Au point de terminaison souhaité de la mesure (c.-à-d. 6 ou 24 heures après le traitement, étape 1.2.3), mesurer la fluorescence sur un instrument capable de lire la fluorescence (380-400 nm_Ex/505 nm_Em) au format 96 ou 384 puits.
   4. Préparer 2x réactif de détection lytique en ajoutant 20 μL de substrat lytique et 10 μL de protéine LgBiT par 1 mL de tampon lytique. Préparer suffisamment de réactif de détection 2x pour le nombre de puits à analyser, y compris le volume supplémentaire pour tenir compte de l’erreur de pipetage (p. ex., nombre de puits + 10 %).
   5. Ajouter le réactif de détection lytique préparé aux puits. Pour le format 96 puits, ajouter 120 μL de 2x réactif de détection lytique à chaque puits contenant déjà un volume de 120 μL. Pour un format 384 puits, ajoutez 48 μL de 2x réactif de détection lytique à chaque puits contenant déjà un volume de 48 μL. Mélanger la plaque sur un mélangeur vortex à microplaques pendant 10-20 min.
   6. Mesurer la luminescence sur un luminomètre capable de lire la luminescence dans des plaques de 96 ou 384 puits.
5. Quantification de la dégradation et de la viabilité cellulaire
   1. Faites la moyenne des unités d’éclairage relatif (RLU) du contrôle DMSO au point de temps mesuré. Utilisez cette valeur comme niveau protéique de base de la cible pour calculer la dégradation fractionnée en normalisant tous les autres traitements testés au même moment indiquent cette valeur. Par exemple, si le RLU moyen pour les puits témoins de DMSO à 6 h était de 10 000 et que le RLU pour un traitement composé donné à 6 h était de 5 000, la dégradation fractionnelle serait calculée comme suit : 5 000 ÷ 10 000 = 0,5 (équation 1).
      Équation 1 :
   2. Déterminez le pourcentage de dégradation à partir de la RLU fractionnaire :
      Équation 2 :
   3. Tracer l’UFR fractionnaire ou le % de dégradation à des moments précis pour classer l’activité des composés.
   4. Vous pouvez éventuellement analyser les données de l’unité de fluorescence relative (UFR) pour la mesure du test de viabilité cellulaire en comparant les valeurs de tous les traitements au contrôle DMSO. Si une baisse significative de l’UFR est observée pour tout traitement relatif au contrôle du DMSO, les données de dégradation peuvent également être normalisées aux données de l’essai de viabilité cellulaire pour déterminer les changements dans le niveau de protéines par rapport aux pertes de viabilité cellulaire.

2. Dégradation cinétique en temps réel des protéines cibles HiBiT CRISPR et test de luminescence optionnel de viabilité cellulaire

NOTE: La capacité d’effectuer le criblage cinétique et la dégradation nécessite une co-expression de la protéine LgBiT dans la cellule, qui a été décrite précédemment^18,19,63. Cela peut être réalisé par transfection transitoire d’un vecteur LgBiT, utilisation de BacMam LgBiT, ou en effectuant l’insertion de HiBiT CRISPR dans une lignée cellulaire stable LgBiT.

1. Placage de lignées cellulaires adhérentes.
   1. Retirer le milieu de la fiole cellulaire par aspiration, laver les cellules avec du DPBS, dissocier les cellules avec 0,05% de trypsine-EDTA et permettre aux cellules de se dissocier du fond de la fiole. Pour les lignées cellulaires en suspension, passez à la section 2.2.
   2. Neutraliser la trypsine à l’aide d’un milieu de culture cellulaire contenant du sérum, mélanger pour recueillir et remettre en suspension les cellules et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique.
   3. Faites tourner les cellules à 125 x g pendant 5 min. Jeter le milieu de culture cellulaire et remettre en suspension dans un volume égal de milieu de culture cellulaire frais.
   4. Cellules en plaques dans des plaques d’essai avec un minimum de puits triples par condition expérimentale et témoin. Pour le dénombrement du format de 96 puits afin d’estimer la densité cellulaire, ajuster la densité à 2 x 10⁵ cellules/ml dans le milieu d’essai et distribuer 100 μL (20 000 cellules) par puits dans une plaque de 96 puits. Pour le dénombrement du format de 384 puits afin d’estimer la densité cellulaire, ajuster la densité à 4,44 x 10⁵ cellules/ml dans le milieu d’essai et distribuer 18 μL (8 000 cellules) par puits.
   5. Incuber les plaques à 37 °C, 5% de CO₂ pendant la nuit ou dans des conditions optimales pour leur croissance.
2. Placage de cellules en suspension
   1. Ajuster la densité cellulaire à 2,22 x 10⁵ cellules/ml dans un milieu indépendant du CO₂ supplémenté avec 10 % de FBS et 1 x endurazine (dilution de 1:100 du réactif mère).
   2. Cellules de plaque dans des plaques d’essai avec un minimum de 3 puits par condition expérimentale et témoin. Pour le format 96 puits, distribuer 90 μL (20 000 cellules) par puits. Pour le format 384 puits, distribuer 36 μL (8 000 cellules) par puits.
      REMARQUE: Pour les lignées cellulaires en suspension qui ont une faible luminescence du signal au fond (S: B), par exemple, lorsque vous travaillez avec des pools CRISPR plutôt que des clones, il est possible d’augmenter la luminescence en augmentant le nombre de cellules plaquées, jusqu’à 100 000 cellules / puits au format 96 puits, ou 40 000 cellules / puits au format 384 puits.
3. Tests de dégradation cinétique utilisant des cellules HiBiT CRISPR exprimant LgBiT
   1. Pour les cellules en suspension contenant déjà de l’endurazine, qui a été incluse à l’étape de placage au point 2.2., passer directement à l’étape 2.3.3. Pour les lignées cellulaires adhérentes, préparez la solution d’endurazine Nano-Glo. Pour le format 96 puits, préparer une solution 1x d’endurazine en diluant le réactif mère 1:100 dans un milieu indépendant du CO₂ complété par 10% de FBS. Pour le format 384 puits, préparer une solution 2x d’endurazine en diluant le réactif mère 1:50 dans un milieu indépendant du CO₂ complété par 10% de FBS.
   2. Ajouter la solution d’endurazine à chaque puits de cellules adhérentes. Pour le milieu d’aspiration au format 96 puits, ajouter 90 μL de 1x solution d’endurazine. Pour un format à 384 puits, ajouter 18 μL de solution d’endurazine 2x à 18 μL de cellules. Ne pas aspirer le milieu car l’essai de dégradation est effectué dans un mélange 50:50 de milieu de culture et de milieu indépendant du CO₂ dans un format 384 puits.
   3. Incuber des plaques cellulaires en suspension ou adhérentes contenant de l’endurazine pendant 2,5 h dans un incubateur à 37 °C et 5% de CO₂ pour permettre à la luminescence de s’équilibrer.
   4. Préparer une concentration de 10x de titrage PROTAC d’essai dans un milieu indépendant du CO₂ et ajouter 10 μL à chaque puits de plaque de 96 puits ou 4 μL pour une plaque de 384 puits. Pour les composés dont l’efficacité est inconnue, une concentration finale de 1 à 10 μM au point le plus élevé est recommandée comme point de départ.
   5. Recueillir des mesures cinétiques de la luminescence dans un luminomètre prééquilibré à 37 °C pendant une période comprise entre 0 et 48 h. Les incréments de temps de mesure peuvent être personnalisés pour chaque expérience, mais une expérience initiale recommandée serait des mesures de luminescence toutes les 5-15 minutes pendant 24 h ou la durée souhaitée.
4. Analyse multiplex de même puits sur la viabilité cellulaire en option après la mesure cinétique finale
   REMARQUE : Ce test est effectué avec un kit CellTiter-Glo (CTG) disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux).
   1. Équilibrer le réactif CTG à température ambiante.
   2. Après la mesure de la dégradation au dernier point temporel de l’analyse cinétique, ajouter 100 μL (plaque de 96 puits) ou 40 μL (plaque de 384 puits) de réactif par puits de la plaque, et mélanger sur un agitateur à plaque à 500-700 tr/min (plaque de 96 puits) ou un mélangeur vortex à microplaques (plaque de 384 puits) pendant 5 min.
   3. Incuber la plaque à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre la lyse cellulaire et l’extinction du signal HiBiT.
   4. Mesurer la luminescence totale sur un luminomètre en suivant les recommandations du fabricant.
5. Quantification des profils de dégradation cinétique
   1. À l’aide des mesures de luminescence cinétique recueillies, normaliser les RLU brutes pour chaque concentration de PROTAC à la condition moyenne de DMSO répliquée à chaque point temporel pour tenir compte des changements dans la concentration de furimazine libre au fil du temps. Calculez le RLU fractionnaire à l’aide de l’équation 1.
      Équation 1 :
   2. À partir des courbes de dégradation, ajustez un modèle de décroissance exponentielle à composante unique utilisant l’équation 2 à la partie de dégradation initiale de chaque courbe jusqu’au point où les données atteignent un plateau.
      NOTA: Il peut être utile d’exclure de l’ajustement les premiers points de données car il peut y avoir un bref décalage avant que la dégradation ne soit observée.
      Équation 2 :
   3. À partir de l’équation 2, déterminez le paramètre ƛ, qui représente la constante de vitesse de dégradation et le plateau, qui représente la plus faible quantité de protéines restantes.
   4. Calculez Dmax, qui est la quantité fractionnaire maximale de protéines dégradées et est calculée comme 1-Plateau.
   5. Tracer Dmax pour chaque concentration de PROTAC afin de déterminer une courbe de pouvoir de dégradation indépendante du temps.
   6. Déterminer la valeur Dmax₅₀ pour la parcelle en 2.3.5 pour analyser l’efficacité des composés.
      REMARQUE : Pour déterminer un courant continu₅₀ à un moment précis, tracez le pourcentage de dégradation calculé pour chaque concentration au moment choisi. Cela peut être spécifié comme DC 50 t = 4 h ou DC₅₀ t = 12 h.

Pour démontrer l’analyse de la dégradation lytique à concentration unique, plusieurs protéines cibles CDK; CDK2, CDK4, CDK7 et CDK10 ont été marqués de manière endogène avec HiBiT à leur extrémité C dans des cellules HEK293 et traités avec une concentration de 1 μM du PROTAC pankinase à base de Cereblon, TL12-18654 (Figure 1A). Le niveau de protéine CDK a été mesuré à différents moments et le RLU fractionnaire par rapport au témoin DMSO a été déterminé (Figure 1A). Chaque protéine CDK a montré différents degrés de dégradation en réponse au traitement composé et aux différents points temporels (Figure 1A). Pour comprendre comment les protéines CDK se comparent directement les unes aux autres en termes de perte de protéines, les RLU fractionnaires de la figure 1A ont été calculées en % de dégradation totale et tracées pour chaque point temporel de la figure 1B. Cela montre que même à des points temporels précoces, 2 ou 4 h, certains membres de la famille CDK présentent des niveaux élevés de dégradation qui continuent à augmenter au fil du temps (Figure 1B).

Démontrer l’analyse de dégradation cinétique, chacune des protéines membres de la famille BET; BRD2, BRD3 et BRD4 ont été marqués de manière endogène avec HiBiT à leur extrémité N dans les cellules HEK293 exprimant de manière stable la protéine LgBiT18. Ceux-ci ont ensuite été traités avec trois concentrations différentes des PROTAC pan-BET; le dBET650 à base de Cereblon (Figure 2A) et l’ARV-77141 à base de VHL (Figure 2B). Les mesures cinétiques ont été recueillies sur une période de 24 heures et, à partir des profils à chaque concentration, les différences dans la réponse des membres de la famille BET sont évidentes. La capacité de BRD2 à amorcer une réponse de récupération plus rapide après un traitement composé de dégradation (figure 2A,B) a déjà été observée avec d’autres PROTAC pan-BET et est probablement due à une réponse de rétroaction transcriptionnelle compétitive au processus de dégradation18.

L’analyse des paramètres et de la cinétique peut être effectuée avec des traitements dose-réponse composés complets. La figure 3 présente les profils de dégradation de la relation dose-réponse cinétique du traitement des cellules Ikaros/IKZF1-HiBiT CRISPR Jurkat exprimant de manière stable la protéine LgBiT avec quatre composés moléculaires de colle 2,26,55,57; lénalidomide (figure 3A), iberdomide (CC-220) (figure 3B), thalidomide (figure 3C) et pomalidomide (figure 3D). Ces dégradateurs montrent des différences significatives dans la réponse à la dégradation entre les composés ainsi qu’entre les séries de concentrations (Figure 3).

Pour évaluer quantitativement la dégradation et classer les composés de la figure 3, les profils dose-réponse ont été utilisés pour calculer les principaux paramètres de dégradation, y compris le taux de dégradation (figure 4A), les valeurs Dmax (figure 4B) et Dmax50 (figure 4B). Ces analyses montrent que l’iberdomide (CC-220) et le pomalidomide ont des taux de dégradation initiale rapide très similaires (figure 4A), mais que l’iberdomide (CC-220) a la puissance la plus élevée comme on l’a déjà vu dans des études orthogonales55,57 (figure 4B). Étant donné que l’iberdomide présente une puissance élevée et que toutes les concentrations testées montrent une dégradation supérieure à 50%, la valeur Dmax50 obtenue pour l’iberdomide représente une estimation basée sur la limitation de l’ajustement précis des données. D’après les graphiques des figures 3C, D et 4B, ni le lénalidomide ni la thalidomide ne dégradent la cible d’Ikaros/IKZF1 jusqu’à son achèvement aux concentrations les plus élevées testées. En raison de la très faible dégradation observée avec la thalidomide, les traces de dégradation n’ont pas pu être ajustées avec précision à un modèle de désintégration exponentielle, par conséquent, le taux de dégradation n’a pas été quantifié pour ce traitement. Pour le dégradateur le plus puissant, l’iberdomide (CC-220)55,57 (figure 4B). Les essais multiplex de viabilité cellulaire n’ont montré aucune perte de viabilité cellulaire pour les concentrations testées (figure 4C).

Figure 1 : Dégradation et toxicité du critère d’évaluation CDK avec la pankinase PROTAC, TL12-18654. (A) Sélectionner un panel de protéines cibles CDK endogènes fusionnées avec HiBiT sur l’extrémité C via CRISPR/Cas9 et évalué pour la dégradation avec 1 μM TL12-186 PROTAC 54 à 2 h, 4 h, 8 h et24 h de traitement. Les valeurs sont représentées sous forme de RLU fractionnaire par rapport à un contrôle DMSO mesuré à chaque point temporel. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne de 3 répétitions techniques. (B) Pourcentage de dégradation du panel de protéines cibles CDK calculé à partir de (A) représentant la quantité de dégradation de chaque membre de la famille observée à 2, 4, 8 et 24 h de temps. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne de 3 répétitions techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Profilage de la sélectivité de dégradation cinétique des membres de la famille BET avec des dégradateurs BET, dBET650 et ARV-77141. Profils de dégradation cinétique des membres endogènes de la famille BET, BRD2, BRD3 et BRD4, marqués avec HiBiT sur l’extrémité N via CRISPR / Cas9 avec traitement de concentrations uniques de 1 nM (gauche), 10 nM (milieu) ou 100 nM (droite) dBET650 (A) ou ARV-77141 (B) PROTACs. Les valeurs sont représentées sous forme de RLU fractionnaire calculée à partir d’un contrôle DMSO à chaque point de temps cinétique. Les barres d’erreur représentent l’écart-type de la moyenne de 4 répétitions techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Profils dose-réponse de dégradation cinétique des cellules vivantes d’Ikaros/IKZF1-HiBiT avec un panneau de colle moléculaire 2,26,55,57. Les cellules Jurkat exprimant de manière stable la protéine LgBiT ont été modifiées à l’aide de CRISPR / Cas9 pour marquer l’extrémité C d’Ikaros / IKZF1 avec le peptide HiBiT. Les cellules ont été traitées avec une série de concentrations dose-réponse de 8 points, y compris le DMSO, de quatre composés moléculaires de colle 2,26,55,57: (A) lénalidomide, (B) iberdomide (CC-220), (C) thalidomide ou (D) pomalidomide. La luminescence a été mesurée toutes les 5 minutes pour un total de 19,5 h. Les données relatives aux unités lumineuses (UGR) de (A-D) ont été converties en UFR fractionnelles comme décrit à l’étape 2.4.1 et représentées graphiquement en fonction du temps. Les barres d’erreur représentent SD de 3 répétitions techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Calcul du taux de dégradation et de Dmax50 pour Ikaros/IKZF1-HiBiT, et tests de santé cellulaire multiplexage. Les données de dégradation cinétique de la figure 3 ont été utilisées pour calculer les paramètres quantitatifs de dégradation. (A) Les taux de dégradation et (B) les valeurs maximales de dégradation (Dmax) sont représentés graphiquement à chaque concentration de médicament pour les composés de colle moléculaireindiqués 2,26,55,57. (B) Les valeurs Dmax50 pour chaque composé ont été calculées à l’aide d’un modèle dose-réponse avec une pente de Hill contrainte de 1, qui peut être utilisé pour classer les composés de dégradation par ordre pour une cible. (C) Des essais de viabilité cellulaire avec l’iberdomide(CC-220)55,57 dose-réponse à la dégradation de la figure 3B ont été effectués comme mesure du paramètre final une fois les mesures de dégradation cinétique terminées. Les barres d’erreur représentent SD de 3 répétitions techniques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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