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Article de méthode

Identification des inhibiteurs de l’EGFR et du SRA à l’aide de Caenorhabditis elegans

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DOI :

10.3791/61788

⸱

5 octobre 2020

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Diagnostic and Biomedical Sciences, School of Dentistry, University of Texas Health Science Center, 2Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, University of Texas Health Science Center

Dans cet article

Résumé

Le nématode génétiquement traitable Caenorhabditis elegans peut être utilisé comme modèle simple et peu coûteux pour la découverte de médicaments. Décrit ici est un protocole pour identifier les thérapies anticancéreux qui inhibent la signalisation en aval des protéines RAS et EGFR.

Résumé

Les changements dans la localisation de la membrane plasmique du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) et de son effecteur en aval RAS ont été impliqués dans plusieurs maladies, y compris le cancer. Le nématode libre C. elegans possède une cascade de signaux MAP EGFR-RAS-ERK évolutive et fonctionnellement conservée qui est centrale pour le développement de la vulve. Gain de mutations fonctionnelles dans l’homologue RAS LET-60 et l’homologue EGFR LET-23 induisent la génération de pseudovulva ectopique non fonctionnelle visible le long de la paroi ventrale du corps de ces vers. Auparavant, il a été démontré que le phénotype multivulval (Muv) de ces vers était inhibé par de petites molécules chimiques. Nous décrivons ici un protocole d’utilisation du ver dans un test à base de liquide pour identifier les inhibiteurs qui abolissent les activités des protéines EGFR et RAS. En utilisant ce test, nous montrons que la R-fendiline, un inhibiteur indirect de K-RAS, supprime le phénotype Muv exprimé dans les vers mutants let-60(n1046) et let-23(sa62). Le test est simple, peu coûteux, ne prend pas de temps à mettre en place et peut être utilisé comme plate-forme initiale pour la découverte de thérapies anticancéreux.

Introduction

Les voies cellulaires qui régulent les événements de développement au sein des organismes sont hautement conservées chez tous les métazoaires. L’une de ces voies est la cascade de signalisation de la protéine kinase activée par le mitogène EGFR-RAS-ERK (MAPK) qui est une voie critique qui régit la prolifération, la différenciation, la migration et la survie des cellules1,2. Les défauts de cette voie de signalisation peuvent conduire à des états pathologiques ou pathologiques tels que le cancer. Le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) s’est avéré être fortement exprimé dans les tumeurs humaines, y compris 50% des carcinomes épidermoïdes oraux, et contribue au développement de tumeurs malignes3,4,5. Alors que les mutations dans les trois isoformes RAS H-, K- et N-RAS sont des moteurs majeurs de la transformation maligne dans de multiples cancers humains. Parmi ces trois isoformes RAS, les mutations oncogènes dans K-RAS sont les plus répandues6,7,8. Pour que l’EGFR et le RAS fonctionnent, ils doivent se localiser dans la membrane plasmique (PM). Empêcher la localisation de ces molécules dans le PM peut complètement abroger l’activité biologique de cette voie designalisation 9,10. Par conséquent, l’inhibition de la localisation de ces protéines dans le PM est une stratégie thérapeutique pour bloquer la signalisation en aval et les résultats indésirables qui en résultent. À l’aide d’un test de dépistage à haute teneur, la fendiline, un inhibiteur des canaux calciques de type L, a été identifiée comme un inhibiteur de l’activitéK-RAS 11. Le nanograppement de K-RAS dans la feuille interne du PM est considérablement réduit en présence de fendiline. En outre, K-RAS est redistribué de la membrane plasmique au réticulum endoplasmique (RE), à l’appareil de Golgi, aux endosomes et au cytosol. Plus important encore, la prolifération des lignées cellulaires cancéreuses du pancréas, du côlon, du poumon et de l’endomètre exprimant le mutant oncogène K-RAS est bloquée par l’inhibition de la signalisation en aval par la fendiline11. Ces données suggèrent que la fendiline fonctionne comme un traitement anticancéreux K-RAS spécifique qui provoque la mauvaise localisation de la protéine RAS dans le PM.

Le nématode Caenorhabditis elegans a fait l’objet d’études approfondies dans le contexte du développement. De nombreuses voies de signalisation qui régissent le développement du ver sont évolutives et fonctionnellement conservées. Par exemple, l’activation de RAS médiée par l’EGFR et l’activation ultérieure de la cascade de signaux ERK MAPK sont conservées dans le ver12. La cascade est représentée par les protéines suivantes : LET-23 > LET-60 > LIN-45 > MEK-2 > MPK-1. LET-60 est homologue à RAS, tandis que LET-23 est homologue à EGFR. Chez le ver, cette voie régule le développement de la vulve13. La vulve est une ouverture épithéliale sur la paroi ventrale du corps du ver qui permet la ponte d’œufs fécondés. La formation de la vulve dans le ver dépend de l’exposition des cellules précurseurs vulvaires (VPC) à un gradient d’activation de la cascade de signaux EGFR-RAS-MAPK. Au cours du développement normal, les VPC proximaux reçoivent des signaux forts des cellules d’ancrage gonadique pour se différencier en destins cellulaires de 1° et 2° qui donnent lieu à une vulve fonctionnelle12. Alors que les VPC distaux se différencient en destins cellulaires à 3° qui fusionnent avec le syncytium hypodermique et ne forment pas de vulve en raison de l’épuisement de la signalisation. En l’absence de signalisation, tous les VPC se différencient en destins cellulaires à 3°, ce qui entraîne la formation d’aucune vulve. Cependant, la signalisation constitutive conduit à la formation d’une ou plusieurs vulves non fonctionnelles en raison de l’induction de tous les VPC pour supposer des destins cellulaires de 1° et 2°.

Des mutations qui provoquent une induction vulvaire défectueuse ou excessive ont été identifiées pour de nombreux gènes qui codent pour les protéines représentant cette voie. Une induction vulvaire défectueuse entraîne un phénotype sans vulve (Vul), tandis qu’une induction vulvaire excessive entraîne un phénotype multivulve (Muv) qui est représenté par le développement de nombreuses pseudovulvaes ectopiques non fonctionnelles dans toute la paroi ventrale du corps. Le phénotype Muv exprimé par la souche let-60(n1046) est dû à un gain de mutation fonctionnelle dans RAS, tandis que dans la souche let-23(sa62) il est dû à une mutation activatrice dans EGFR14,15. Il a été démontré que le phénotype Muv fort dans ces souches mutantes est perturbé par des interventions pharmacologiques, comme l’a démontré le traitement des vers let-60 (n1046) avec l’inhibiteur MEK-1 U012616,17. Fait intéressant, nous avons montré que la R-fendiline et les inhibiteurs qui affectent le métabolisme de la sphingomyéline suppriment le phénotype Muv dans le ver18. Pour démontrer que ces inhibiteurs bloquent la signalisation let-60 au niveau du RAS, la souche nulle lin-1 a été utilisée17. Lin-1 est un facteur de transcription inhibiteur de type Ets qui fonctionne comme un répresseur dans le développement de la vulve19. Une forte réversion du phénotype Muv chez les vers let-60(n1046) et aucun effet sur les vers nuls lin-1 suggèrent que ces inhibitions se produisent au niveau du RAS.

Dans ce protocole, nous démontrons l’utilisation de C. elegans comme modèle pour identifier les inhibiteurs des protéines RAS et EGFR. À l’aide d’un test à base de liquide, nous démontrons les effets inhibiteurs de la R-fendiline en supprimant les phénotypes Muv dans les souches mutantes let-60(n1046) et let-23(sa62) de C. elegans. Ce test valide l’utilisation de C. elegans comme outil dans la phase initiale de la découverte de médicaments pour les thérapies anticancéreux.

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Protocole

1. Préparation de plaques de milieu de croissance des nématodes (NGM)

  1. Ajouter 2,5 g de peptone et 3 g de NaCl à 970 mL d’eau désionisée contenue dans une fiole d’Erlenmeyer de 2 L. Remuer le contenu à l’aide d’une barre d’agitation magnétique. Par la suite, ajouter 20 g de gélose à la fiole. Autoclaver le contenu de la fiole à 121 °C et une pression de 15 lb/po2 pendant 30 min. Après la stérilisation, placer la fiole sur une plaque d’agitation et laisser refroidir le milieu jusqu’à ce que la température atteigne 50 °C.
  2. Pour préparer les plaques NGM, ajoutez les réactifs suivants au milieu refroidi : 25 mL de tampon phosphate de potassium 1 M (pH = 6,0), 1 mL de 1 MMgSO4,1 mL de 1 M CaCl2,1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans l’éthanol à 95 %), 1 mL de nystatine (10 % v/p dans l’éthanol) et 1 mL de streptomycine 25 mg/mL.
  3. Sous un écoulement laminaire, verser le milieu refroidi dans des boîtes de Petri stériles de 60 mm x 15 mm. Laissez les plaques se solidifier pendant 2 h. Ces plaques peuvent être conservées pendant 1 mois à 4 °C.

2. Propagation de C. elegans

  1. Repérez 100 μL d’E. coli OP50 cultivé pendant la nuit sur le centre de chaque plaque NGM et laissez les plaques sécher pendant 24 h dans une hotte laminaire. Par la suite, les plaques peuvent être stockées dans un récipient en polystyrène.
    REMARQUE: La culture E. coli OP50 est cultivée dans des milieux Luria-Bertani (LB) à 37 ° C avant l’ensemencement des plaques. La culture peut être conservée à 4 °C pendant 1 à 2 mois et utilisée pour l’ensemencement périodique des plaques.
  2. À l’aide d’un pic à ver stérile, rassemblez 10 à 12 vers adultes gravides d’une plaque précédemment cultivée sous un microscope à dissection. Transférer ces vers dans une plaque de NGM fraîche ensemencée avec E. coli OP50 et incuber la plaque pendant 24 h à 20 °C.
  3. Après 24 h, à l’aide d’un déché à vis stérile, retirez les vers adultes des plaques. Incuber les plaques à 20 °C pendant ~ 3 jours. Les embryons se développeront en vers adultes gravides.

3. Préparation d’une culture synchrone de C. elegans

  1. Recueillir les vers adultes gravides dans un tube conique de 15 mL en lavant 2 à 4 plaques avec du M9W.
    1. Préparation de M9W : Dissoudre 5 g de NaCl, 6 g de Na2HPO4et 3 g de KH2PO4 dans de l’eau désionisée dans un volume final de 1 L. Autoclaver la solution à 121 °C à une pression de 15 lb/po2 pendant 30 min. Ajouter 1 mL de 1 M MgSO4 à la solution refroidie.
  2. Aruffez les vers en centrifugant le tube à 450 x g pendant 1 min. Décantez le surnageant sans déranger la pastille de ver.
  3. Préparer la solution de lyse des vers en combinant 400 μL d’hypochlorite de sodium à 8,25 % (eau de Javel domestique) et 100 μL de NaOH à 5 N. Ajoutez cette solution à la pastille de ver et faites glisser le tube pour mélanger le contenu du tube. Empêchez le surbleachage des embryons dans le tube en observant la lyse des vers sous un microscope disséquant.
  4. Ajouter 10 mL de M9W au tube conique pour diluer le mélange de lyse lorsque 70% des vers adultes se sont lysés.
  5. Centrifuger le tube à 450 x g pendant 1 min. Remplacez le surnageant par 10 mL de M9W.
  6. Répétez l’étape 3.5 deux fois.
  7. Après avoir terminé les étapes de lavage, ajoutez 3 à 5 mL de M9W pour ressuspender la pastille d’œuf. Faites pivoter le tube pendant la nuit à une vitesse de 18 tr/min sur un rotateur à tube à température ambiante (RT).
  8. Après une incubation de nuit, retirez le tube du rotateur, a granulez les larves L1 en centrifugant le tube à 450 x g pendant 1 min. Aspirer le M9W jusqu’à ce qu’il reste 250 μL dans le tube.
  9. Secouez le tube pour ressuspender les larves. Ajouter trois gouttes de 5 μL contenant les larves sur un couvercle de boîte de Pétri. À l’aide d’un microscope à dissection, comptez le nombre de vers dans chaque goutte et déterminez le nombre de vers dans 1 μL.

4. Préparation des tests de médicaments

REMARQUE : Les étapes de ce test sont illustrées à la figure 1.

  1. Faire pousser 30 mL d’E. coli OP50 dans un tube conique de 50 mL à 37 °C pendant la nuit dans un agitateur orbital à 150 tr/min.
  2. Faire tourner pendant la nuit la culture d’E. coli OP50 à 4 000 x g pendant 10 min pour granuler les cellules. Retirer le surnageant et ressuspender la pastille dans 3 mL de M9W pour concentrer la culture.
  3. Avant de préparer les solutions de travail pour le dosage du médicament, ajouter 0,1 mL de cholestérol (5 mg/mL dans de l’éthanol à 95 %) dans 100 mL de M9W.
  4. Préparer des solutions de travail de chaque médicament expérimental en diluant chaque médicament plus véhicule (sulfoxyde de diméthyle; DMSO) dans 4,8 mL de M9W complété par du cholestérol pour obtenir les concentrations appropriées. Dissoudre le DMSO dans 4,8 mL de M9W complété par du cholestérol pour préparer le contrôle du véhicule.
  5. Ajouter 200 μL de culture concentrée d’E. coli OP50 à chaque tube contenant le témoin du véhicule ou des médicaments et des tubes vortex pour s’assurer qu’ils sont mélangés.
  6. Pour effectuer l’expérience, ajoutez 2 mL de chaque solution médicamenteuse ou témoin de véhicule à chaque puits dans une plaque de culture tissulaire de 12 puits. Testez chaque concentration de médicament et le contrôle du véhicule en double.
  7. Ajouter environ 100 larves de L1 par puits (voir les étapes de culture synchrone de C. elegans) à l’aide d’une micropipette stérile. Limitez le volume de vers à 10 μL.
  8. Incuber les plaques à 20 °C.
  9. Complétez les puits avec 50 μL de 10x concentré E. coli OP50 au jour 3 du test si nécessaire.

5. Préparation du tampon d’agarose pour la microscopie

  1. Préparer une solution d’agarose à 2 % p/v en dissolvant 0,1 g d’agarose dans 5 mL d’eau désionisée. Chauffer le contenu dans un micro-ondes pour dissoudre l’agarose. 20 lames peuvent être préparées à partir de 5 mL de solution d’agarose.
  2. Placez des bandes de ruban adhésif de laboratoire le long de deux lames de verre. Le ruban agira comme des entretoises limitant l’épaisseur des tampons d’agarose. Par la suite, placez une troisième glissière en verre propre entre les glissières scotchées.
  3. Pour faire un tampon d’agarose, repérez 100 μL d’agarose fondu sur le centre de la lame propre. Placez une autre glissière en verre propre sur et sur le dessus de l’agarose et appuyez doucement vers le bas pour former un tampon. Retirez la glissière supérieure lorsque le tampon s’est solidifié.

6. Observation du phénotype Muv dans les souches let-60, let-23 et lin-1

REMARQUE: Seuls les médicaments candidats qui suppriment les phénotypes Muv dans les souches let-23 et let-60 seront analysés à l’aide de la souche lin-1 pour déterminer si l’inhibition se produit au niveau de RAS ou EGFR.

  1. Lorsque le stade approprié du cycle de vie est atteint (3 jours pour les souches let-60 et let-23, 5 jours pour la souche lin-1), retirez les plaques de l’incubateur. et recueillir les vers dans des tubes coniques de 15 mL à l’aide d’une pipette.
  2. Centrifuger les tubes à 450 x g pendant 1 min. Retirer M9W sans déranger la pastille de ver et ajouter 5 mL de M9W frais.
  3. Répétez l’étape 6.2 deux fois.
  4. Sans déranger la pastille de ver, retirez tout le M9W restant par aspiration. Par la suite, ajouter 500 μL d’azide de sodium de 2 mM ou de chlorhydrate de tétramisole de 2 mM. Laisser les tubes incuber à RT pendant 15 min. 2 mM d’azide de sodium ou 2 mM de chlorhydrate de tétramisole anesthésieront les vers pour l’imagerie.
    ATTENTION : Assurez-vous de porter un équipement de protection individuelle (EPI) lorsque vous manipulez de l’azode de sodium. La solution doit être préparée sous une hotte chimique.
  5. Ajouter 10 μL de la suspension anesthésisée du ver sur le centre d’un tampon d’agarose. Placez doucement un couvercle #1,5 sur la suspension du ver. Si nécessaire, fixez le couvercle avec du vernis à ongles pour éviter le dessèchement.
  6. Utilisez un microscope DIC pour observer les souches let-60(n1046), let-23(sa62) et lin-1(sy254). Imagez les vers aux grossissements 10x et 20x.
  7. Pour let-60(n1046) et let-23(sa62), notez les vers adultes en fonction de la présence ou de l’absence du phénotype Muv. Alors que pour la souche lin-1, comptez le nombre de VPC qui ont adopté des destins cellulaires de 1° ou 2° sur la face ventrale des larves L4 à l’aide d’un microscope DIC haute résolution.
  8. Après avoir noté les micrographies pour chaque souche et traitement médicamenteux, effectuez le test t-de Student pour déterminer les différences statistiques entre les traitements.

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Résultats

Nous démontrons d’abord que la R-fendiline est capable de supprimer le phénotype Muv dans la souche mutante let-60(n1046) par rapport aux vers traités par DMSO. Nos données montrent que la R-fendiline est capable de bloquer le phénotype Muv dans le let-60(n1046) de manière dose-dépendante(Figure 2A,B). Cependant, une non-inversion du phénotype Muv a été observée dans la souche mutante nulle lin-1 en réponse à l’augmentation des concentrations de R-...

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Discussion

Les tests que nous décrivons à l’aide du ver sont simples et peu coûteux pour identifier les inhibiteurs de la fonction EGFR et RAS. C. elegans est un modèle attrayant pour la découverte de médicaments car il est facile à cultiver en laboratoire en raison du cycle de vie court (3 jours à 20 ° C) et de la capacité de générer un grand nombre de larves. Plus important encore, la voie EGFR-RAS-ERK MAPK est conservée de manière évolutionnaire et fonctionnelle avec des mammifères fournissant un système génétiquement t...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

Nous remercions le Dr Swathi Arur (MD Anderson Cancer Center) d’avoir fourni le let-60(n1046). Nous remercions également le Dr David Reiner (Texas A&M Health Science Center Institute of Biosciences & Technology à Houston) pour la souche lin-1. Enfin, nous remercions la Dre Danielle Garsin et son laboratoire (Université du Texas, McGovern Medical School) d’avoir fourni certains des réactifs. Certaines souches de vers ont été fournies par la CCG, qui est financée par le NiH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440). Cette recherche a été soutenue par la subvention RP200047 du Cancer Prevention and Research Institute of Texas (CPRIT) à JF Hancock.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
forts et produits chimiques
  ;Millipore Sigma  ;A9539-50G
Bacto Peptone  ;Fisher ScientificDF0118-17-0
BD Difco Agar  ;Fisher ScientificDF0145-17-0
BD Difco LB BouillonFisher ScientificDF0446-17-3
Chlorure de calciumFisher ScientificBP510-500
CholestérolFisher ScientificICN10138201 Sulfate de
magnésiumFisher ScientificBP213-1
NystatineAcros organics
Phosphate de potassium dibasiqueFisher ScientificBP363-500
Phosphate de potassium monobasiqueFisher ScientificBP362-500
R-Fendilinesynthétisé commercialement (qualité pharmaceutique)
Azoture de sodiumMillipore Sigma  ;S2002-25G
Chlorure de sodium  ;Fisher ScientificBP358-1
Hydroxyde de sodiumFisher ScientificSS266-1
Hypochlorite de sodium à 8,25 %  ;Eau de Javel
Phosphate de Sodium Dibasique  ;Fisher ScientificBP332-500
Sulfate de streptomycine  ;Fisher ScientificBP910-50
(&minus ;)-Chlorhydrate de tétramisoleMillipore Sigma  ;L9756
UO126 (inhibiteur de MEK)Millipore Sigma  ;19-147
Consommables  ;
15mL Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène  ;Fisher Scientific12-565-269
50 mlFisher Scientific12-565-271
Pipettes sérologiques jetables en polystyrène 10 mlFisher Scientific07-200-574
Pipettes sérologiques jetables en polystyrène 25 mlFisher Scientific07-200-575
n° 1,5 x 18 mmFisher Scientific12-541A
Boîte de Pétri avec couvercle transparent (60 x 15 mm)Boîtesde
avec couvercle transparent (100 x 15 mm)en verre ordinaire Fisher Scientific FB0875712
(75 x 25 mm)Fisher Scientific12-544-4
Plaques de culture tissulaire à 12 puitsFisher Scientific50-197-4804
fort  ;
PrismGraphpad
Souches bactériennes
E. coli OP50
Worm Strains
StrainGenotype TransgeneSource
MT2124   ;let-60(n1046) IV.CGC
MT7567lin-1(sy254) IV.CGC
PS1839let-23(sa62) II.CGC
forteAC455500050 Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène de Pétri FB0875713A Fisher ScientificLames de microscope

Références

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