Ce protocole démontre l’étude des effets pathophysiologiques de la fumée de cigarette (CS) avec un système d’exposition de l’inhalation du corps entier (WBI) (WBIS) construit en interne. Ce système peut exposer les animaux au CS dans des conditions reproductibles contrôlées pour la recherche des effets médiés par le CS sur l’emphysème pulmonaire et l’hématopoïèse.
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Article de méthode
Exposition à la fumée de cigarette chez les souris utilisant un système d’inhalation du corps entier
Dans cet article
Résumé
Résumé
Près de 14 % des adultes aux États-Unis auraient fumé des cigarettes en 2018. Les effets de la fumée de cigarette (CS) sur les poumons et les maladies cardio-vasculaires ont été largement étudiés, cependant, l’impact de CS dans d’autres tissus et organes tels que le sang et la moelle osseuse restent incomplètement définis. Trouver le système approprié pour étudier les effets du CS chez les rongeurs peut être prohibitif et nécessiter l’achat de systèmes disponibles dans le commerce. Ainsi, nous avons entrepris de construire un système abordable, fiable et polyvalent pour étudier les effets pathologiques du CS chez la souris. Ce système d’exposition par inhalation du corps entier (WBIS) imite la respiration et la bouffée des cigarettes en alternant l’exposition au CS et à l’air pur. Ici, nous montrons que ce système de bricolage induit une inflammation des voies respiratoires et un emphysème pulmonaire chez la souris après 4 mois d’exposition à la fumée de cigarette. Les effets de l’inhalation du corps entier (WBI) de CS sur les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPCs) dans la moelle osseuse à l’aide de cet appareil sont également montrés.
Introduction
Le tabagisme reste l’une des principales causes de maladies évitables aux États-Unis malgré la baisse constante du nombre d’adultes fumeurs de cigarettes au cours des 50 à 60 dernières années1. Il est largement connu que le tabagisme est lié à de multiples maladies des poumons et du sang, y compris la maladie pulmonaire obstructive chronique (MPOC), un groupe de maladies qui comprend l’emphysème et la bronchite chronique2,3,4. Selon le Center for Disease Control (CDC), en 2014, la MPOC était la troisième cause de décès aux États-Unis avec plus de 15 millions d’Américains souffrant de cette maladie5.
CS a également été récemment associé à un risque plus élevé de développer l’hématopoïèse clonale (CH)6,7, une condition dans laquelle une seule cellule souche hématopoïétique produit de manière disproportionnée un grand pourcentage du sang périphérique d’une personne. Ce résultat indique un lien potentiel entre le tabagisme et la fonction de moelle osseuse. Compte tenu des répercussions répandues et très importantes du CS sur la santé et du fait que les modèles murins de maladies sont la pierre angulaire des progrès de la recherche biomédicale, il est utile de développer des systèmes efficaces et abordables pour modéliser le CS chez la souris.
Ici, nous fournissons un guide étape par étape pour la construction d’un système abordable pour le traitement et l’étude des effets in vivo du CS sur l’emphysème pulmonaire et l’homéostasie de la moelle osseuse. L’assemblage de cet équipement ne nécessite pas que l’utilisateur ait des connaissances spécialisées et permet donc l’assemblage de bricolage.
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Protocole
Tous les animaux impliqués dans les expériences et le développement de cette technique ont été sous notre protocole d’utilisation animale approuvé par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (IACUC) et sous Baylor College of Medicine et MD Anderson institutions qui sont accrédités par l’Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AAALAC).
1. Construction de l’appareil
- Assemblage du compresseur d’air avec le système de vannes.
- Connectez les débitmètres (deux 15 L/min avec barre Y et 2 décollages de puissance) au régulateur de pression miniature à l’aide d’un raccord de mamelon d’adaptateur mâle fileté de 1/8 de pouce. Assurez-vous d’utiliser le ruban adhésif de joint de filetage dans toutes les extrémités filetées.
- Raccorder le régulateur de pression assemblé avec le débitmètre à l’instrument du compresseur d’air médical à l’aide de ce qui suit : un mamelon hexagone de 1/8 de pouce sur la sortie d’air du compresseur, un raccord d’accouplement fileté de 1/8 de pouce et un raccord de mamelon d’adaptateur mâle fileté de 1/8 de pouce qui se connecte au régulateur de pression.
- Installez le connecteur barbelé pivotant à l’oxygène sur chaque (4) débitmètre.
- Installez un adaptateur mâle sur la sortie d’air supérieure du compresseur d’air (pièce incluse avec l’instrument du compresseur d’air médical).
- Assemblage de chambres d’exposition (faire 4 unités)
- Couper un tuyau de chlorure de polyvinyle chloré (CPVC) de 3/4 de pouce en huit segments de 4 pouces.
- Insérez chaque segment dans un raccord CPVC de coude de 3/4 de pouce à 90° et fixez le côté du raccord du coude à un adaptateur mâle CPVC de 3/4 de pouce de diamètre. Il devrait y avoir huit segments CPVC, chacun fixé à un raccord de coude CPVC et un adaptateur mâle CPVC.
- Percer deux trous (1 1/4 de pouce de diamètre) sur les côtés opposés les plus éloignés les uns des autres d’un contenant hermétique de 8,5 L (11,25 x 7,75 x 6 pouces) avec un couvercle (voir la figure 1 chambre d’exposition). Le positionnement des trous doit être centré de haut en bas et de gauche à droite.
- Insérez les côtés filetés de l’adaptateur mâle CPVC assemblés avant dans chaque trou dans les récipients.
- De l’intérieur du conteneur, fixez un capuchon CPVC de 3/4 de pouce de l’autre côté (entrée de fumée de chambre) et un adaptateur femelle d’irrigation goutte à goutte CPVC de 3/4 de pouce d’un côté (sortie de fumée de chambre).
- Percez cinq trous de 3 mm sur le dessus du capuchon CPVC de la sortie de fumée de la chambre dans un motif quinconce (pomme de douche). Cela permettra à la fumée de cigarette d’entrer dans la chambre avec une vitesse plus élevée et garantit qu’elle se propage uniformément à l’intérieur de la chambre dans toutes les directions.
- Assemblage de chambres à cigarettes (représente jusqu’à 4 unités d’exposition murine)
- Prenez un bouchon en caoutchouc à un trou (taille du fabricant 8.5) et insérez un connecteur en Y barbelé de 1/4 de pouce sur le côté plus large et un raccord barbelé droit (ouverture de 8 mm) sur le côté plus étroit. La cigarette sera placée ici pendant la procédure de fumage (piédestal de cigarette).
- Connectez une extrémité d’un tuyau en vinyle de qualité médicale de 12 pouces de long à l’un des connecteurs barbelés du connecteur en Y fixé au bouchon en caoutchouc et l’autre extrémité à un raccord de 1/4 de pouce et insérez le côté opposé de ce raccord sur un bouchon en caoutchouc à un trou (taille du fabricant 1).
- Sur un autre bouchon en caoutchouc (taille du fabricant 8.5), insérez un connecteur de tube droit de 1/4 de pouce sur le côté plus large du bouchon et connectez l’extrémité extérieure du raccord à un tuyau en vinyle de qualité médicale de 7 pieds.
- Raccorder les deux structures de bouchon en caoutchouc assemblées auparavant aux étapes 1.3.1 à 1.3.3 à un cylindre en verre de 8 pouces x 1,75 pouce à partir d’un tube de vidange en verre de laboratoire.
- Système de commande de vanne
- Le système est contrôlé par une ouverture et une fermeture rythmiques des électrovannes qui simulent l’inhalation (bouffée) de fumée de cigarette et d’air pur. Le système qui contrôle les électrovannes a été conçu commercialement (voir la table des matériaux).
- Assemblage de tous les composants ensemble (voir figure 1)
- Montez quatre électrovannes sur les côtés du système de commande de vanne à l’aide de fixations de 1 pouce.
- Connectez les électrovannes au système de commande des vannes en suivant les instructions du fabricant.
- Fixez un connecteur droit fileté de 10 à 32 (M) à la connexion d’échappement (« EXH ») de l’électrovanne et un adaptateur d’orifice fileté sur les connexions « IN » et « OUT » du même électrovanne.
- Connectez le débitmètre fixé au compresseur à l’électrovanne via la connexion « OUT » à l’aide d’un tube en vinyle de qualité médicale de 7 pieds.
- Connectez le tube vinyle de 7 pieds assemblé avec le bouchon en caoutchouc à l’étape 1.3.3. sur le connecteur « IN » de l’électrovanne.
- Insérez le petit bouchon en caoutchouc de la chambre à cigarettes sur l’entrée de fumée de la chambre.
- Raccorder l’électrovanne à la deuxième connexion du connecteur en Y barbelé sur le socle de cigarette assemblé à l’étape 1.3.1.
Figure 1 : Schéma des connexions de notre WBIS pour l’exposition au CS. Cette figure montre comment tous les composants sont assemblés pour former un appareil de travail. La figure ne montre qu’une seule chambre à fumer assemblée sur les quatre que la machine est capable de faire fonctionner. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
2. Exposition à la fumée de cigarette
ATTENTION : Évitez l’exposition de seconde et de troisième main à la fumée de cigarette. Les chambres de cigarette et d’exposition doivent être utilisées dans des armoires de sécurité biologique à flux laminaire de type B2 de classe II. Un EPI approprié devrait être porté pendant les expériences d’exposition à la fumée (c.-à-d. masques, gants, filet à cheveux, blouse).
-
Réglage de la pression et du flux d’air
- Une fois que tous les composants sont assemblés comme le montre la figure 1,allumez le compresseur d’air et attendez que l’alarme de sécurité s’éteigne d’elle-même.
- Réglez la pression du compresseur d’air à 40–50 psi en tournant le bouton sur le régulateur de pression.
- Réglez le débit d’air du compresseur d’air à 5 L à l’aide du débitmètre.
- Allumez le contrôleur de vanne.
- Réglez la minuterie numérique du contrôleur de soupape sur le mode de fonctionnement PULSE-C (affiché dans l’écran comme « Pu-c ») en appuyant sur la touche SET / LOCK tout en maintenant la touche HAUT enfoncée au premier chiffre de la minuterie. Ensuite, appuyez sur la touche HAUT jusqu’à ce que le mode Pu-c soit atteint. Appuyez sur la touche RESET pour définir le mode de fonctionnement affiché (c’est-à-dire Pu-C) comme mode de travail.
- Appuyez sur set/lock pour changer le minuteur 1 (affiché dans l’affichage comme « T1 »).
- Appuyez sur les touches HAUT ou BAS pour régler T1 sur 20 s.
- Appuyez sur set/lock pour changer le minuteur 2 (affiché dans l’affichage comme « T2 »).
- Appuyez sur les touches HAUT ou BAS pour régler T2 sur 3 s.
REMARQUE: Les étapes 2.1.5 à 2.1.9 sont conçues pour être utilisées avec la minuterie spécifique (voir la table des matériaux). Pour plus d’instructions sur les autres utilisations de ce produit, voir son manuel d’utilisation correspondant.
-
Traitement de la fumée de cigarette
REMARQUE: Ce système permet l’utilisation de 1 à 4 chambres d’exposition murines en même temps.- Allumez le compresseur d’air et attendez que l’alarme de sécurité s’éteigne toute seule.
- Allumez le contrôleur de vanne.
- Transférer 5 souris dans chacune des quatre chambres d’exposition avec des couvercles amovibles étanches à l’air d’un volume de 8,5 L. Placez les quatre chambres d’exposition avec des souris dans des armoires de sécurité biologique à flux laminaire de classe II type B2.
- À l’intérieur de l’armoire de sécurité biologique à flux laminaire, allumez une cigarette et insérez la cigarette à l’intérieur de la chambre à cigarettes. Utilisez des cigarettes disponibles dans le commerce qui contiennent 15 mg/goudron cig et 1,1 mg/cig nicotine8 par rapport aux cigarettes de recherche Kentucky 3RF4 (9,5 mg/goudron cig et 0,73 mg/cig nicotine)9.
- Allumez les vannes du contrôleur de vanne qui correspondent aux chambres actuellement utilisées. L’exposition est divisée en 2 phases: (T1) l’air pur est pompé dans la chambre d’exposition pendant 20 s et (T2) le flux d’air provoque la combustion de la cigarette et la fumée de la chambre à cigarettes est pompée dans la chambre d’exposition pendant 3 s. Laissez la cigarette brûler complètement jusqu’à ce qu’elle atteigne le filtre.
- Ajustez les paramètres de la minuterie pour effectuer une moyenne de ~ 10 bouffées / cigarette sur une période d’environ 4 minutes. Notez que la minuterie et le système sont facilement personnalisables pour améliorer ou abaisser le schéma posologique du CS en fonction des besoins de recherche des chercheurs.
- Retirez le filtre à cigarette et jetez-le en plaçant le mégot de cigarette dans un bécher en verre avec de l’eau pour éteindre la flamme et atténuer l’odeur.
- Assurez-vous que la chambre de la cigarette est fermée à nouveau et sans cigarette. Laissez la machine pomper de l’air pur pendant 10 min. Il est de la plus haute importance de maintenir une surveillance constante des animaux vertébrés qui sont exposés au CS. Ce régime d’exposition est optimisé pour 5 souris femelles âgées de plus de 9 semaines par chambre d’exposition.
- Répéter les étapes 2.3.4 à 2.3.7 trois fois pour un total de 4 cigarettes par chambre et par jour. Cette procédure est répétée 5 jours par semaine aussi longtemps que le chercheur a besoin pour leurs expériences.
- Retirez les souris des chambres d’exposition dans leurs cages correspondantes.
- Éteignez le contrôleur de soupape et le compresseur d’air.
- Retirez les chambres d’exposition et de cigarette et lavez-les à l’eau et au savon pour éliminer tout résidu de goudron.
- Laissez les chambres sécher complètement avant de les utiliser à nouveau.
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Résultats
L’une des principales caractéristiques de l’exposition au SC est l’emphysème caractérisé par les dommages et la destruction des sacs aériens (alvéoles) dans les poumons. Ainsi, les expériences initiales se sont concentrées sur la capacité du système de bricolage à provoquer des changements emphysémateux dans les poumons des souris femelles lors d’une exposition répétée du corps entier au CS. Le schéma posologique du CS a été choisi sur la base de nos publications antérieures dans lesquelles nous avons utilisé le système ...
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Discussion
Ici, nous fournissons les informations nécessaires à la construction d’un appareil pour WBIS de souris à CS. Après l’installation du système, il est extrêmement important que les chercheurs calibrent le système en fonction de la dose délivrée de nicotine ou de cotinine chez les animaux. L’appareil contient une minuterie et des manomètres qui peuvent être utilisés pour ajuster le volume de la bouffée de cigarette, la fréquence des bouffées, la période d’exposition combinée à la fumée et les intervalles de repos que les an...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
AR, XH et PE ont été soutenus par la subvention R01HL140398 des NIH et une subvention de la Fondation Gilson Longenbaugh. DEMM et KK ont été soutenus par les subventions R01HL1363333 et R01HL134880 (KYK) des NIH, ainsi que par une subvention de la Fondation Helis pour la recherche médicale. Demm est également soutenu par le Howard Hughes Medical Institute (HHMI) Gilliam Fellowship for Advanced Study. PE est également soutenu par le programme de bourses Formation en sciences de la santé environnementale de précision NIEHS T32 ES027801. JC et MF sont soutenus par le Tobacco Research Funds du Département d’épigénétique et de cancérogénèse moléculaire et par le Center for Epigenetics (Bourse de recherche à MF) de MD Anderson. FK et YZ sont soutenus par les subventions R01 ES029442-01 et R01 AI135803-01 des NIH ainsi que par la subvention VA Merit CX000104. Ce projet a été soutenu par le noyau de cytométrie et de tri cellulaire du Baylor College of Medicine grâce au financement du CPRIT Core Facility Support Award (CPRIT-RP180672), du NIH (CA125123 et RR024574) et de l’aide de Joel M. Sederstrom.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Attache de 1 po | Lowes | 756990 | |
| Connecteur en Y cannelé de 1/4 po | VWR | 89093-282 | |
| Connecteur de tube droit de 1/4 po | VWR | 62866-378 | |
| Mamelon hexagonal 1/8 | Lowes | 877221 | |
| Raccord d’accouplement fileté de 1/8 po Raccord de raccord | |||
| de | 1/8 poLowes | 877243 | |
| 10/32 (M) connecteur droit fileté | Bimba | EB60 | |
| 3/4 po coude à 90 degrés raccord CPVC | Lowes | 22643 | |
| 3/4 po tuyau en polychlorure de vinyle chloré (CPVC) | Lowes | 23814 | |
| 3/4 po capuchon en CPVC | Lowes | 23773 | |
| 3/4 po CPVC Adaptateur femelle d’irrigation goutte à goutte | Lowes | 194629 | |
| Adaptateur mâle CPVC de 3/4 po de diamètre | Lowes | 23766 | |
| Contenant hermétique de 8,5 L avec couvercle (11,25 po x 7,75 po x 6 po) | Komax | N/A | Répertorié comme "Komax Biokips Large Bread Box | (280 onces) Grand conteneur de stockage" |
| Tube de vidange en verre (1,75 po de diamètre x 8 po de longueur) | KIMAX | 6500 | |
| Isonic Solénoïdes | Bimba | V2A02-AW1 | |
| Marlboro Red 100's | Marlboro | N/A | |
| Oxygen swivel barbed connector | Global Medical Solutions | RES002 | |
| Panasonic Timer LT4H-W | Panasonic | LT4HW | L’article a été intégré dans le contrôleur de soupape par Shepherd Controls & Associates |
| Régulateur de pression | Allied Electronics and Automation | 70600552 | Aussi répertorié comme « Norgren R07-100-RGKA"Butée |
| en caoutchouc # 1 (un trou) | VWR | 59581-163 | |
| Bouchon en caoutchouc # 8.5 (un trou) | VWR | 59581-389 | |
| Scireq inExpose system | Scireq and Emka Technologies | N/A | Système commercial utilisé pour la comparaison avec notre DIY WBIS |
| Raccord barbelé droit (ouverture de 8 mm) | VWR | 10028-872 | |
| Ruban d’étanchéité pour filetage | Lowes | 1184243 | |
| Adaptateur de port fileté | Bimba | P1SA1 | |
| Minuterie Aridyne 2000 Compresseur d’air médical | MFI Medical | AHC-TE20 | |
| Débitmètre de minuterie | Allied Healthcare Products | 15006-03YP2 | Également répertorié comme « Puritan Air Meter" |
| Système de contrôle des soupapes | Shepherd Controls and Associates | N/A | Company a conçu sur mesure le système de commande de soupape pour ce modèle. |
| Tuyaux en vinyle | Vitality | Medical RES3007 |
Références
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Réimpressions et autorisations
