Article de méthode

Préparation d’échantillons en un seul pot assistée par support pour l’analyse protéomique ciblée d’un petit nombre de cellules humaines

DOI :

10.3791/61797

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6 novembre 2020

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1Biological Sciences Division, Pacific Northwest National Laboratory, 2NHC Key Laboratory of Cancer Proteomics, Department of Oncology, Xiangya Hospital, Central South University, 3Environmental Molecular Sciences Laboratory, Pacific Northwest National Laboratory, 4Department of Critical Care Medicine, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

Dans cet article

Résumé

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Une préparation d’échantillon en un seul pot assistée par transporteur de protéines couplée à la surveillance de la réaction sélectionnée (SRM) par chromatographie liquide (LC) appelée cLC-SRM est une méthode pratique pour l’analyse protéomique ciblée multiplexée d’un petit nombre de cellules, y compris des cellules uniques. Il tire parti de l’utilisation d’un excès de protéines exogènes comme support et d’une LC-SRM à haute spécificité pour une quantification ciblée.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’analyse des protéines d’un petit nombre de cellules humaines est principalement réalisée par protéomique ciblée avec des immunoessais basés sur des anticorps, qui ont des limites inhérentes (par exemple, un faible multiplex et l’indisponibilité des anticorps pour les nouvelles protéines). La protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse (MS) est apparue comme une alternative car elle est sans anticorps, à multiplexage élevé et présente une spécificité et une précision de quantification élevées. Les progrès récents de l’instrumentation de la spectrométrie de masse rendent possible la protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse pour la quantification multiplexée de protéines très abondantes dans les cellules individuelles. Cependant, il existe un défi technique pour le traitement efficace des cellules uniques avec une perte d’échantillon minimale pour l’analyse MS. Pour résoudre ce problème, nous avons récemment mis au point une préparation d’échantillon en un seul pot assistée par transporteur de protéines, couplée à une surveillance de réaction sélectionnée (LC) par chromatographie liquide (LC) appelée cLC-SRM pour l’analyse protéomique ciblée de petits nombres de cellules humaines. Cette méthode tire parti de l’utilisation de la protéine exogène excessive combinée comme support et du traitement en un seul pot à faible volume pour réduire considérablement les pertes d’adsorption de surface, ainsi que du LC-SRM à haute spécificité pour répondre efficacement à l’augmentation de la plage de concentration dynamique due à l’ajout de protéine porteuse exogène. Son utilité a été démontrée par la quantification précise des protéines les plus modérément abondantes dans un petit nombre de cellules (par exemple, 10 à 100 cellules) et des protéines très abondantes dans les cellules individuelles. Les fonctionnalités faciles à mettre en œuvre et l’absence d’appareils spécifiques rendent cette méthode facilement accessible à la plupart des laboratoires de protéomique. Nous avons fourni ici un protocole détaillé pour l’analyse cLC-SRM de petits nombres de cellules humaines, y compris le tri cellulaire, la lyse et la digestion cellulaires, l’analyse LC-SRM et l’analyse des données. D’autres améliorations de la sensibilité de détection et du débit d’échantillons sont nécessaires pour une analyse protéomique ciblée sur cellule unique. Nous prévoyons que le cLC-SRM sera largement appliqué à la recherche biomédicale et à la biologie des systèmes, avec le potentiel de faciliter la médecine de précision.

Introduction

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Les progrès technologiques récents en génomique (transcriptomique) permettent une analyse complète et précise du génome (transcriptome) dans les cellules uniques 1,2,3. Cependant, les technologies de protéomique unicellulaire sont loin derrière, mais elles sont tout aussi importantes que les technologies génomiques (transcriptomique) 4,5,6,7,8. De plus, l’abondance des protéines ne peut pas nécessairement être déduite de l’abondance de l’ARNm9, et le protéome est plus complexe et dynamique que le transcriptome10. Compte tenu de ces défis, un grand nombre de populations mixtes de cellules (c’est-à-dire des cellules en vrac) sont généralement utilisées pour générer des données complètes sur le protéome 11,12,13. Cependant, ces mesures globales permettent de compenser les variations stochastiques des cellules individuelles, masquant ainsi une importante variabilité d’une cellule à l’autre (c’est-à-dire l’hétérogénéité cellulaire)4,14. Les limites de ces mesures en vrac deviennent encore plus graves lorsque les cellules d’intérêt ne représentent qu’une petite partie des populations totales de cellules (par exemple, les cellules souches cancéreuses dans les tumeurs à un stade précoce du cancer). Par conséquent, il existe un énorme manque de connaissances entre la protéomique unicellulaire et la génomique (transcriptomique).

Les immunodosages à base d’anticorps (p. ex., cytométrie de flux ou de masse) sont principalement utilisés pour l’analyse protéomique ciblée de cellules uniques 6,7,15,16,17,18. Cependant, ils souffrent d’un faible multiplex, d’une spécificité limitée et d’une indisponibilité d’anticorps pour de nouvelles protéines d’intérêt. La protéomique ciblée basée sur la spectrométrie de masse (MS) est apparue comme une alternative pour la quantification précise des protéines en raison de son absence d’anticorps, de son multiplex élevé (≥150 protéines en une seule analyse)19), de sa grande précision de quantification (quantités ou concentrations absolues) et de sa spécificité et reproductibilité élevées (CV ≤10 %)20,21,22,23. Les progrès significatifs réalisés récemment dans la préparation des échantillons ont rendu possible la protéomique unicellulaire basée sur la spectrométrie de masse pour l’analyse quantitative de protéines très abondantes à partir de cellules humaines uniques. Cependant, la protéomique unicellulaire basée sur la SP n’en est encore qu’à ses débuts. Par exemple, la plate-forme MS la plus avancée, associée à des débits RPLC à très faible débit, ne peut permettre la détection et la quantification par MS sans marquage que de ~670 à 870 protéines sur un total de 12 000 ≥ dans des cellules HeLa uniques24,25.

À l’heure actuelle, il existe six approches de protéomique unicellulaire basées sur la spectrométrie de masse pour l’analyse de cellules de mammifères uniques, dont quatre pour la protéomique globale (nanoPOTS : Préparation dans un pot basé sur les nanopuits pour les échantillons de traces26 ; iPAD-1 : dispositif intégré d’analyse du protéome pour l’analyse de cellules uniques27 ; analyse protéomique unicellulaire sur puce OAD (huile-air-gouttelette)28 ; SCoPE-MS : protéomique unicellulaire par spectrométrie de masse29) et les deux autres sont destinés à la protéomique ciblée (cLC-SRM : chromatographie liquide assistée par support (LC) - surveillance de réaction sélectionnée (SRM)30 ; cPRISM-SRM : séparations haute pression et haute résolution assistées par support avec sélection intelligente et multiplexage couplées à SRM31). Cependant, toutes ces approches présentent des inconvénients techniques. nanoPOTS, iPAD-1 et OAD réduisent le volume de traitement des échantillons à 2-200 nL et ne sont pas prêts pour de vastes applications de paillasse 26,27,28. Pour SCoPE-MS, un support TMT (tandem mass tag) est ajouté après le traitement d’une seule cellule, de sorte qu’il ne peut pas empêcher efficacement les pertes d’adsorption de surface pendant le traitement d’échantillons lorsqu’un seul tube est utilisé pour le traitement d’une seule cellule29, ce qui entraîne une faible reproductibilité avec un coefficient de corrélation de seulement ~0,2-0,4 entre les répétitions32. Pour cLC-SRM et cPRISM-SRM, l’utilisation de protéines exogènes comme support est plus adaptée à la protéomique ciblée, car les peptides provenant de protéines exogènes excessives sont fréquemment séquencés par MS/MS, ce qui réduit considérablement le risque de séquençage de peptides endogènes peu abondants30,31. Contrairement à la protéomique globale pour la quantification relative, les deux approches protéomiques ciblées peuvent fournir une analyse protéique précise ou absolue d’un petit nombre de cellules avec une reproductibilité élevée à l’aide d’étalons internes marqués aux isotopes lourds à des concentrations connues. Par rapport au cPRISM-SRM qui nécessite au préalable un fractionnement PRISM à haute résolution, ce qui entraîne l’analyse de nombreux échantillons de fraction, le cLC-SRM présente un avantage significatif en termes de débit d’échantillons sans fractionnement et peut quantifier simultanément des centaines de protéines en une seule analyse, mais avec une sensibilité de détection relativement plusfaible30. Par conséquent, le cLC-SRM est plus accessible et devrait avoir des utilités plus larges pour l’analyse précise des protéines multiplexées d’un petit nombre de cellules ainsi que d’échantillons à masse limitée.

Nous décrivons ici un protocole détaillé pour effectuer des cLC-SRM pour une analyse protéomique ciblée pratique d’un petit nombre de cellules humaines, y compris des cellules uniques. Le protocole comprend les principales étapes suivantes : le tri cellulaire par FACS (tri cellulaire activé par fluorescence), la lyse et la digestion cellulaires traitées dans des tubes d’amplification en chaîne par polymérase (PCR) uniques à faible volume, la collecte de données LC-SRM et l’analyse des données SRM à l’aide du logiciel Skyline accessible au public (Figure 1). Sa large utilité a été démontrée en même temps que nos tests SRM précédemment bien établis par la quantification ciblée absolue des protéines de la voie EGFR/MAPK dans les cellules 1-100 MCF7 ou MCF10A et la détermination des copies de protéines de la voie par cellule à une large gamme dynamique de concentrations30. Nous prévoyons qu’avec le protocole détaillé, la plupart des chercheurs en protéomique peuvent facilement mettre en œuvre cLC-SRM dans leurs laboratoires pour une analyse précise des protéines d’échantillons ultra-petits (par exemple, des cellules tumorales rares) afin de répondre aux besoins de leur projet.

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Figure 1 : Vue d’ensemble de toutes les étapes de la cLC-SRM (préparation d’échantillons en un seul pot assistée par ordinateur, couplée à l’hromatographie sélective).Les digestats de lysat de cellules non humaines (par exemple, Shewanella oneidensis) sont utilisés pour prétraiter les tubes PCR afin de revêtir la surface du tube. Un petit nombre de cellules humaines ou de cellules uniques triées par FACS sont collectées dans des tubes PCR prétraités. Le support de la protéine BSA (ou protéome de lysat cellulaire non humain), l’étalon interne lourd (IS) et le TFE (ou DDM) sont ajoutés séquentiellement dans les tubes d’échantillon pour faciliter la lyse cellulaire et réduire les pertes d’adsorption de surface. Conceptuellement, le support combiné du DDM et du protéome de lysat de cellules non humaines fonctionnera bien pour le cLC-SRM. La lyse cellulaire est réalisée par sonication, et la dénaturation des protéines est obtenue par chauffage à haute température. Les réactifs DTT et IAA sont utilisés pour la réduction et l’alkylation, respectivement (cette étape est facultative). La trypsine est ajoutée pour la digestion avec des rapports beaucoup plus élevés de trypsine sur la quantité de protéines que pour la digestion standard de la trypsine. Le capuchon du tube d’échantillon est retiré, puis le tube PCR est inséré dans le flacon LC pour une analyse LC-SRM directe. Les données SRM collectées sont analysées à l’aide du logiciel Skyline accessible au public. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Protocole

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REMARQUE : L’analyse cLC-SRM étape par étape est illustrée à la figure 1.

1. Prétraitement des tubes PCR

  1. Ajouter 100 μL de lysats cellulaires non humains (p. ex., Shewanella oneidensis) à 0,2 μg/μL dans des tubes de PCR. Incuber à température ambiante pendant une nuit pour enduire la surface du tube PCR.
  2. Retirez les digestats de lysat cellulaire par pipetage, rincez 3 fois les tubes PCR avec de l’eau de qualité HPLC, puis séchez les tubes PCR à l’air libre dans une hotte.
  3. Conservez les tubes PCR revêtus dans un congélateur à 4 °C jusqu’à nouvel ordre.

2. Tri FACS

  1. Alignez un trieur de cellules activées par fluorescence (FACS) (voir le tableau des matériaux) dans une plaque PCR à 96 puits à l’aide de billes fluorescentes avec des colorants qui peuvent être excités par la source laser pour fournir des signaux de référence fiables.
  2. Vérifiez que la machine FACS est bien conçue pour trier les cellules au fond des plaques PCR.
    1. Réglez l’angle du flux de tri au minimum possible pour maximiser le taux de réussite que les cellules seront triées dans le fond des puits plutôt que de frapper les côtés.
    2. Pour diriger la machine, utilisez le flux d’essai pour « trier » les gouttelettes de tampon PBS (par exemple, 100 gouttelettes) sur le puits d’une plaque vide pour vous assurer que les gouttelettes collectées sont au fond. Si les gouttelettes n’atterrissent pas dans la bonne position, recalibrez le trieur de cellules et répétez l’opération jusqu’à ce que les gouttelettes du flux de tri soient correctement collectées.
  3. Placez les tubes PCR revêtus dans un rack de tubes PCR à 96 puits.
  4. Triez le nombre souhaité de cellules mammaires humaines (MCF7 ou MCF10A) dans des tubes PCR pré-enrobés.
  5. Centrifuger immédiatement les cellules mammaires triées à 100 x g pendant 10 min à 4 °C pour les maintenir au fond du tube afin d’éviter une perte potentielle de cellules.
  6. Conservez les cellules triées dans un congélateur à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.

3. Ajout d’un support protéique, d’étalons internes lourds et de TFE

  1. Ajouter 4 μL de 25 mM de NH4HCO3 dans des tubes PCR contenant les cellules collectées.
  2. Ajouter 1 μL d’albumine sérique bovine (BSA) de 10 ng/μL dans 25 mM de NH4HCO3 dans des tubes d’échantillon.
  3. Ajouter 0,3 μL d’étalons de peptides lourds bruts de 100 fmol/μL (total 30 fmol) dans les tubes d’échantillon.
    REMARQUE : Les aliquotes des étalons de peptides lourds bruts pour les protéines de la voie EGFR/MAPK sont fabriquées à une concentration nominale de 100 fmol/μL dans 25 mM NH4HCO3. Versez le petit volume d’étalons de peptides lourds bruts à 100 fmol/μL au milieu de la solution et assurez-vous qu’il ne reste pas de liquide dans l’embout de la pipette.
  4. Ajouter 9 μL de TFE à 100 % dans des tubes d’échantillon avec une concentration finale de ~60 % de TFE.
  5. Centrifuger à 1500 x g pendant 5 min, puis tourbillonner doucement à 100 x g pendant 3 min.

4. Lyse cellulaire et dénaturation des protéines

  1. Sonicate les cellules mammaires triées par FACS sur de la glace pendant 1 min avec des intervalles de 1 minute pour un total de 5 cycles à l’amplitude de 70 % et à 0,5 Hz.
  2. Incuber les échantillons à 90 °C pendant 1 h pour la dénaturation des protéines à l’aide d’un thermocycleur PCR avec l’option de couvercle chauffant.
    REMARQUE : Le TFE est un solvant volatil dont le point d’ébullition est de 74 °C, et l’option du couvercle chauffant est donc sélectionnée pour éviter un séchage complet avec une perte d’échantillon importante.
  3. Refroidir les échantillons à température ambiante avec centrifugation à 1500 x g pendant 3 min.

5. Réduction et alkylation (facultatif)

  1. Ajouter 0,6 μL de DTT 50 mM pour une concentration finale de 2 mM.
    REMARQUE : La solution TNT doit être fraîchement préparée à chaque fois. Peser 77,5 mg de DTT, puis dissoudre dans 1 mL de 25 mM NH4HCO3 pour obtenir 500 mM de DTT. 10 μL de DTT 500 mM sont ensuite ajoutés à 90 μL de 25 mM NH4HCO3 pour obtenir 50 mM DTT.
  2. Centrifuger à 1500 x g pendant 5 min, puis mélanger doucement à 850 tr/min pendant 3 min.
  3. Incuber à 56°C pendant 1 h en secouant doucement à 100 x g.
  4. Refroidir les échantillons à température ambiante et centrifuger à 1500 x g pendant 3 min.
  5. Ajouter 0,5 μL de 60 mM d’IAA dans le tube RT-PCR avec la concentration finale de ~2 mM.
    REMARQUE : La solution IAA doit être fraîchement préparée à chaque fois. Peser 74,3 mg d’AIA, puis dissoudre dans 1 mL de 25 mM NH4HCO3 pour obtenir 400 mM d’AIA. 15 μL de 400 mM d’IAA sont ajoutés à 85 μL de 25 mM NH4HCO3 pour obtenir 60 mM d’IAA.
  6. Incuber à l’obscurité à température ambiante pendant 30 min en secouant doucement à 100 x g.
    REMARQUE : Les étapes de réduction et d’alkylation sont facultatives lorsqu’aucun peptide contenant de la cystéine n’est sélectionné pour les protéines cibles.

6. Digestion de la trypsine

  1. Réduire le volume de l’échantillon à ~4 μL à l’aide d’un concentrateur SpeedVac.
    REMARQUE : Le TFE est un solvant volatil dont le point d’ébullition est de 74°C. Un pourcentage élevé de TFE inhibe la digestion de la trypsine.
  2. Ajouter 9 μL de 25 mM de NH4HCO3 et 1-3 μL de trypsine à 15 ng/μL pour la digestion avec une concentration finale de trypsine de 1-3 ng/μL.
    REMARQUE : Pour 10 cellules mammaires humaines triées par FACS (~1 ng), le rapport entre l’enzyme trypsine et les protéines est ≥15:1, 750 fois plus élevé que celui de la digestion standard de la trypsine (le rapport de 1:50).
  3. Mélanger doucement à 100 x g pendant 3 min et incuber toute la nuit (~16 heures) à 37 °C.
  4. Ajouter 0,5 μL d’acide formique à 5 % pour arrêter la réaction enzymatique.
  5. Centrifugeuse pendant 1 h à 1500 x g.
  6. Conserver au congélateur à -80 °C jusqu’à nouvel ordre jusqu’à une analyse LC-SRM ou au congélateur à 4 °C pour une analyse immédiate.

7. Préparation à l’analyse LC-SRM directe

  1. Retirez le capuchon du tube PCR qui a été utilisé pour le prélèvement (étape 2) et le traitement (étape 6) des cellules mammaires triées par FACS.
  2. Insérez le tube PCR dans le flacon LC.
  3. Fermez le flacon LC pour l’analyse LC-SRM.
    REMARQUE : Pour un petit nombre de cellules traitées dans une plaque de PCR à 96 puits, le couvercle du tapis sera ajouté pour sceller la plaque pour l’analyse LC-SRM directe.

8. Analyse LC-SRM

  1. Analysez des échantillons à l’aide d’un UPLC couplé à un spectromètre de masse triple quadripôle.
  2. Connectez des colonnes capillaires C18 (75 μm de diamètre intérieur × 20 cm pour un dégradé standard et 100 μm de diamètre intérieur × 10 cm pour un dégradé court) à un émetteur électronébuleux de silice fondue de 20 μm de diamètre intérieur gravé chimiquement via un raccord en métal inoxydable.
  3. Utilisez une boucle d’échantillonnage de 20 μL pour charger directement tout l’échantillon (~15 μL au total) dans la colonne LC afin de maximiser la sensibilité de détection.
  4. Utilisez de l’acide formique à 0,1 % dans l’eau et de l’acide formique à 0,1 % dans de l’acétonitrile à 90 % comme phases mobiles A et B pour la séparation capillaire RPLC.
  5. Utilisez le gradient binaire LC à des débits de 300 nL/min pour un gradient standard lorsque de grands nombres de protéines cibles (>10) sont mesurés. Gradient standard : 5-20 % B en 26 min, 20-25 % B en 10 min, 25-40 % B en 8 min, 40-95 % B en 1 min et à 95 % B pendant 7 min pour un total de 52 min et la colonne analytique rééquilibrée à 99,5 % A pendant 8 min.
  6. Utilisez le gradient binaire LC à des débits de 400 nL/min pour un gradient court lorsque de petits nombres de protéines cibles (≤10) sont mesurés. Gradient court pour une séparation rapide : 5-95 % B en 5 min et la colonne analytique rééquilibrée à 99,5 % A pendant 5 min avec une durée totale de 10 min de fonctionnement LC.
  7. Faites fonctionner le spectromètre de masse QQQ avec des tensions de pulvérisation d’ions de 2 400 ± 100 V, une tension de décalage capillaire de 35 V, une tension de décalage de skimmer de -5 V et une température d’entrée capillaire de 220° C.
  8. Obtenez les autres paramètres QQQ MS à partir du réglage et de l’étalonnage automatiques sans optimisation supplémentaire.
  9. Augmenter différentes concentrations d’étalons de peptides lourds bruts dans 20 à 50 ng/μL de digestats de lysat cellulaire non humain avant l’analyse LC-SRM des échantillons pour déterminer le temps de rétention (RT) du peptide LC pour la construction d’une méthode SRM programmée et les transitions d’interférence potentielles pour une quantification précise.
  10. Utilisez le mode SRM programmé RT pour la quantification multiplexée avec une fenêtre de balayage de ≥6 min.
    REMARQUE : La fenêtre de balayage sera ajustée en conséquence en fonction du nombre de transitions dans une certaine fenêtre de temps.
  11. Réglez la durée totale du cycle sur 1 s, et le temps d’arrêt de chaque transition est automatiquement ajusté en fonction du nombre de transitions analysées à différentes fenêtres de temps de rétention. Un temps d’arrêt minimal de 10 ms est nécessaire pour chaque transition SRM. Toutes les protéines cibles peuvent être surveillées simultanément dans une seule analyse LC-SRM

9. Analyse des données

  1. Importez des fichiers de données brutes dans le logiciel Skyline33 accessible au public pour visualiser les données de chaque peptide cible afin de déterminer leur détectabilité.
  2. Utilisez deux critères pour déterminer la détection et l’intégration des pics SRM : 1) même temps de rétention LC ; 2) à peu près les mêmes rapports relatifs d’intensité de pic SRM à travers de multiples transitions entre les peptides endogènes (légers) et leurs étalons internes de peptides correspondants (lourds) marqués par des isotopes.
  3. Inspectez manuellement toutes les données SRM pour vous assurer que l’attribution correcte des pics SRM et la limite de pic SRM permettent une quantification fiable à l’aide des deux critères ci-dessus.
  4. Utilisez la meilleure transition avec un signal SRM élevé mais sans interférence matricielle pour la quantification des protéines, et utilisez les autres transitions comme référence.
  5. Utilisez plusieurs répétitions pour obtenir l’écart-type (ET) et le coefficient de variation (CV).
  6. Calculez le rapport signal/bruit (S/B) en fonction de l’intensité maximale maximale sur le bruit de fond moyen dans une plage de temps de rétention de ±15 s pour un dégradé standard et de ±6 s pour un dégradé court. La limite de détection (LD) et la limite de quantification (LOQ) sont définies comme les points de concentration les plus bas où le rapport S/B est d’au moins 3 et 7, respectivement.
  7. Appliquez un critère supplémentaire pour déterminer de manière conservatrice les valeurs LOQ en plus du S/N ≥7 : la réponse peptidique de substitution contre différents numéros de cellules doit se situer dans la plage dynamique linéaire.
  8. Utilisez le logiciel Excel pour tracer toutes les courbes d’étalonnage. Chargez les données RAW de QQQ MS dans le logiciel Skyline accessible au public pour afficher des graphiques de chromatogrammes ioniques extraits (CIX) de plusieurs transitions de protéines cibles surveillées.

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Résultats

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De petites quantités de lysats de cellules MCF7 (0,5 à 20 ng équivalant à 5 à 200 cellules) ont d’abord été utilisées pour évaluer la performance de cLC-SRM par quantification ciblée des protéines de la voie EGFR/MAPK, car elles sont plus uniformes avec moins de variations par rapport à de petits nombres de cellules triées par FACS. Comme le montre la figure 2A, XICs montre clairement la détection de transitions SRM pour ATADDELSFK dérivé de GRB2 présent à ~2...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cLC-SRM est une méthode de protéomique ciblée pratique qui permet une analyse précise et multiplexée des protéines d’un petit nombre de cellules, y compris des cellules uniques. Cette méthode tire parti de la préparation d’échantillons en un seul pot assistée par un transporteur de protéines, dans laquelle toutes les étapes, y compris la collecte de cellules, la lyse et la digestion cellulaires en plusieurs étapes, et le transfert des digestions peptidiques vers une colonne LC capilla...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Ce travail a été soutenu par les subventions R21CA223715 (TS) et UG3CA256967 (TS et HL) des NIH. Les travaux expérimentaux décrits dans le présent document ont été réalisés au Laboratoire des sciences moléculaires environnementales du Pacific Northwest National Laboratory, une installation nationale d’utilisateurs scientifiques parrainée par le département de l’Énergie des États-Unis d’Amérique dans le cadre du contrat DE-AC05-76RL0 1830.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Flacon LC en verre de 2 mLMicrosolv  ;9502S-WCVCuve pour tube PCR pour injection automatique d’échantillons
BSASigma-AldrichP0834-10× ; 1 mLProtéine porteuse pour réduire considérablement les pertes d’adsorption
de surface DTTThermo ScientificA39255Réactif pour la réduction
l’acide formiqueThermo Scientific28905Réactif pour arrêter la réaction enzymatique
IAAThermo ScientificA39271Réactif pour l’alkylation
Étalons internes du peptideNew EnglandQuantification ciblée des protéines de la voie EGFR/MAPK
tube RT-PCR.GeneMate BioexpressT-3035-1Tube PCR de 0,2 mL pour la préparation d’échantillons en un seul pot.
Logiciel SkylineUniversité de WashingtonAccessible au public pour l’analyse des données SRM
SonicateurHielscher Technologie d’échographieUTR200Sonication sur glace pour la lyse cellulaire
Concentrateur Speed VacThermo ScientificRéduction du pourcentage de TFE pour une digestion efficace de la trypsine
TFESigma-Aldrich18370-10× ; 1mL60 % TFE pour lyse cellulaire
Thermocycleur avec couvercle chauffantThermocycleur Peltier  ;PTC-200Chauffage pour la dénaturation des protéines
Trypsine GoldPromegaV528AEnzyme pour la digestion des protéines  ;
Colonne Waters BEH C18Colonne WatersC18 pour la séparation des peptides
de

Références

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  1. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nature Reviews Genetics. 10 (1), 57-63 (2009).
  2. Miyamoto, D. T., et al. RNA-Seq of single prostate CTCs implicates noncanonical Wnt signaling in antiandrogen resistance. Science. 349 (6254), 1351-1356 (2015).
  3. Wang, Y., Navin, N. E. Advances and applications of single-cell sequencing technologies. Molecular Cell. 58 (4), 598-609 (2015).
  4. Macaulay, I. C., Ponting, C. P., Voet, T. Single-Cell Multiomics: Multiple Measurements from Single Cells. Trends in Genetics. 33 (2), 155-168 (2017).
  5. Gavasso, S., Gullaksen, S. E., Skavland, J., Gjertsen, B. T. Single-cell proteomics: potential implications for cancer diagnostics. Expert Review of Molecular Diagnostics. 16 (5), 579-589 (2016).
  6. Wu, M., Singh, A. K. Single-cell protein analysis. Current Opinion in Biotechnology. 23 (1), 83-88 (2012).
  7. Hughes, A. J., et al. Single-cell western blotting. Nature Methods. 11 (7), 749-755 (2014).
  8. Peterson, V. M., et al. Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells. Nature Biotechnology. 35 (10), 936-939 (2017).
  9. Liu, Y., Beyer, A., Aebersold, R. On the Dependency of Cellular Protein Levels on mRNA Abundance. Cell. 165 (3), 535-550 (2016).
  10. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11 (6), 427-439 (2010).
  11. Mertins, P., et al. Proteogenomics connects somatic mutations to signalling in breast cancer. Nature. 534 (7605), 55-62 (2016).
  12. Zhang, H., et al. Integrated Proteogenomic Characterization of Human High-Grade Serous Ovarian Cancer. Cell. 166 (3), 755-765 (2016).
  13. Zhang, B., et al. Proteogenomic characterization of human colon and rectal cancer. Nature. 513 (7518), 382-387 (2014).
  14. Gaudet, S., Miller-Jensen, K. Redefining Signaling Pathways with an Expanding Single-Cell Toolbox. Trends in Biotechnology. 34 (6), 458-469 (2016).
  15. Giesen, C., et al. Highly multiplexed imaging of tumor tissues with subcellular resolution by mass cytometry. Nature Methods. 11 (4), 417-422 (2014).
  16. Di Palma, S., Bodenmiller, B. Unraveling cell populations in tumors by single-cell mass cytometry. Current Opinion in Biotechnology. 31, 122-129 (2015).
  17. Schulz, K. R., Danna, E. A., Krutzik, P. O., Nolan, G. P. Single-cell phospho-protein analysis by flow cytometry. Current Protocols in Immunology. , Chapter 8 Unit 8 11-20 (2012).
  18. Willison, K. R., Klug, D. R. Quantitative single cell and single molecule proteomics for clinical studies. Current Opinion in Biotechnology. 24 (4), 745-751 (2013).
  19. Lee, J. Y., et al. Detection of Head and Neck Cancer Based on Longitudinal Changes in Serum Protein Abundance. Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention. 29 (8), 1665-1672 (2020).
  20. Shi, T., et al. Advancing the sensitivity of selected reaction monitoring-based targeted quantitative proteomics. Proteomics. 12 (8), 1074-1092 (2012).
  21. Shi, T., et al. Advances in targeted proteomics and applications to biomedical research. Proteomics. 16 (15-16), 2160-2182 (2016).
  22. Lange, V., Picotti, P., Domon, B., Aebersold, R. Selected reaction monitoring for quantitative proteomics: a tutorial. Molecular Systems Biology. 4, 222(2008).
  23. Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nature Methods. 9 (6), 555-566 (2012).
  24. Zhu, Y., et al. Proteomic Analysis of Single Mammalian Cells Enabled by Microfluidic Nanodroplet Sample Preparation and Ultrasensitive NanoLC-MS. Angewandte Chemie International Edition. 57 (38), 12370-12374 (2018).
  25. Cong, Y., et al. Improved Single-Cell Proteome Coverage Using Narrow-Bore Packed NanoLC Columns and Ultrasensitive Mass Spectrometry. Analytical Chemistry. 92 (3), 2665-2671 (2020).
  26. Zhu, Y., et al. Nanodroplet processing platform for deep and quantitative proteome profiling of 10-100 mammalian cells. Nature Communications. 9 (1), 882(2018).
  27. Shao, X., et al. Integrated Proteome Analysis Device for Fast Single-Cell Protein Profiling. Analytical Chemistry. 90 (23), 14003-14010 (2018).
  28. Li, Z. Y., et al. Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis. Analytical Chemistry. 90 (8), 5430-5438 (2018).
  29. Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation. Genome Biology. 19 (1), 161(2018).
  30. Zhang, P., et al. Carrier-Assisted Single-Tube Processing Approach for Targeted Proteomics Analysis of Low Numbers of Mammalian Cells. Analytical Chemistry. 91 (2), 1441-1451 (2019).
  31. Shi, T., et al. Facile carrier-assisted targeted mass spectrometric approach for proteomic analysis of low numbers of mammalian cells. Communications Biology. 1, 103(2018).
  32. Vitrinel, B., Iannitelli, D. E., Mazzoni, E. O., Christiaen, L., Vogel, C. Simple Method to Quantify Protein Abundances from 1000 Cells. ACS Omega. 5 (25), 15537-15546 (2020).
  33. MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).
  34. Shi, T., et al. Conservation of protein abundance patterns reveals the regulatory architecture of the EGFR-MAPK pathway. Science Signaling. 9 (436), 6(2016).
  35. Addona, T. A., et al. Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma. Nature Biotechnology. 27 (7), 633-641 (2009).
  36. He, J., et al. Analytical platform evaluation for quantification of ERG in prostate cancer using protein and mRNA detection methods. Journal of Translational Medicine. 13, 54(2015).
  37. Shi, T., et al. Antibody-free, targeted mass-spectrometric approach for quantification of proteins at low picogram per milliliter levels in human plasma/serum. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15395-15400 (2012).
  38. Shi, T., et al. Targeted quantification of low ng/mL level proteins in human serum without immunoaffinity depletion. Journal of Proteome Research. 12 (7), 3353-3361 (2013).

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