Utilisation de l’analyse d’image informatisation pour améliorer la quantification des métastases pulmonaires dans le modèle 4T1 du cancer du sein

Summary

Nous décrivons une méthode plus cohérente et expéditieuse pour quantifier la métastase pulmonaire dans le modèle de cancer du sein 4T1 en utilisant Fiji-ImageJ.

Abstract

Le cancer du sein est une malignité dévastatrice, représentant 40 000 décès de femmes et 30 % des nouveaux diagnostics de cancer féminin aux États-Unis pour la seule année 2019. La principale cause de décès liés au cancer du sein est la charge métastatique. Par conséquent, les modèles précliniques pour le cancer du sein doivent analyser le fardeau métastatique pour être médicalement pertinents. Le modèle de cancer du sein 4T1 fournit un modèle de souris spontanément métastasante et quantifiable pour le cancer du sein humain de stade IV. Cependant, la plupart des protocoles 4T1 quantifient la charge métastatique en comptant manuellement les colonies tachées sur les plaques de culture tissulaire. Bien que cela soit suffisant pour les tissus ayant une charge métastatique inférieure, l’erreur humaine dans le comptage manuel provoque des résultats incohérents et variables lorsque les plaques sont confluentes et difficiles à compter. Cette méthode offre une solution informatique à l’erreur de comptage humain. Ici, nous évaluons le protocole à l’aide du poumon, un tissu hautement métastatique dans le modèle 4T1. Des images de plaques tachées de méthylène sont acquises et téléchargées pour analyse dans Fiji-ImageJ. Fiji-ImageJ détermine ensuite le pourcentage de la zone sélectionnée de l’image bleue, représentant le pourcentage de la plaque avec charge métastatique. Cette approche informatisée offre des résultats plus cohérents et rapides que le comptage manuel ou l’évaluation histopathologique pour les tissus hautement métastatiques. La cohérence des résultats fiji-imagej dépend de la qualité de l’image. De légères variations de résultats entre les images peuvent se produire, il est donc recommandé que plusieurs images soient prises et que les résultats soient en moyenne. Malgré ses limites minimales, cette méthode est une amélioration de la quantification du fardeau métastatique dans le poumon en offrant des résultats cohérents et rapides.

Introduction

Une femme sur huit recevra un diagnostic de cancer du sein au cours de sa vie, et pourtant, malgré de multiples options de traitement, le cancer du sein est la deuxième cause de décès liés au cancer chez les femmes^{américaines 1}. Ces femmes ne meurent pas de la tumeur primaire dans leur sein. Au lieu de cela, la charge métastatique est responsable de la mortalité de cette maladie car elle se propage généralement au poumon, à l’os, au cerveau, au foie, et aux ganglions lymphatiques^2. Pour cette raison, les modèles de cancer du sein doivent évaluer les métastases pour contribuer à réduire la mortalité de cette maladie. Le m....

Protocol

Toutes les méthodes décrites ici ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de Virginia Tech et conformément au National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. L’exécution de ce protocole exige la permission des institutions appropriées et le respect de toutes les lignes directrices appropriées.

1. Culture cellulaire

1. Faire des médias culturels complets (RPMI + 10% Sérum bovin fœtal +1% Pen Strep). Raviver les cellules 4T1 selon le protocole ATCC¹⁰ et incuber à 37 °C et 5 % de CO₂ dans un flacon T-25 jusqu’au confluent. Changez de m....

Results

Cette méthode contient des ajustements simples du protocole^{4T1 3} de Pulaski et Ostrand-Rosenberg et peut être visualisée dans la figure 1. Lorsque 3 chercheurs distincts ont compté manuellement les colonies métastatiques pour 12 plaques pulmonaires (dilution de 1:10), les résultats étaient très incohérents entre les différents compteurs (figure 2A). Tous les chercheurs ont été dirigés pour « compter les colonies métastatiques qui apparais.......

Discussion

Comme démontré, compter manuellement les colonies métastatiques sur chaque plaque pulmonaire peut être une méthode inexacte et imprécise pour quantifier les métastases pulmonaires, démontrant la nécessité d’un meilleur moyen de quantification (figure 2). L’analyse histopathologique différait légèrement du comptage manuel et de l’analyse Fiji-ImageJ(figure 2B et 4D),probablement parce que les diapositives H&E ne sont pas un échantillon représenta.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chambre d’anesthésie	Voir les commentaires	Voir les commentaires	Utilisez des matériaux approuvés dans les politiques de votre établissement
Agent anesthésique	Voir les commentaires	Voir	les commentaires Utilisez des matériaux approuvés dans les politiques de votre établissement
BALB/c Souris femelles	The Jackson Laboratory	000651
Ciseaux Blunt	Roboz	RS-6700
Calculatrice	N’importe	quel Appareil
photo	N’importe Quel		Minimum de 8 mégapixels
Centrifugeuse	N’importe quel		Doit être capable d’une configuration d’euthanasie de 125 x g et 300 x g
CO2	Voir les commentaires Voir	les commentaires	Utilisez des matériaux approuvés dans les politiques de votre établissement
Chambre froide, réfrigérateur, entrepôt frigorifique	N’importe N’importe quoi
Ordinateur avec Fiji-ImageJ	N’importe quel	Doit	être capable de fonctionner Fidji-ImageJ Chambre de
comptage	Fisher Scientific	02-671-10
Ciseaux courbes	Roboz	RS-5859
Eau distillée	N’importe	quel Élastase
	MP Biomedicals	100617
Balance électronique	N’importe quel N’importe
Sérum fœtal bovin (FBS)	R& D Systems	S11150
Pince	Roboz	RS-8100
Ice	N/A	N/A
Incubateur	Voir les commentaires Voir	les commentaires	Doit être capable de 5 % de CO2 et 37 ° ; C
Méthanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Bleu de méthylène	Sigma-Aldrich	03978-250ML
Pénicilline Streptomycine	ATCC	30-2300
Épingles ou aiguilles	N’importe	quel	Pour immobiliser les souris lors d’une nécropsie
Étriers en plastique	VWR	25729-670
RMPI-1640 Moyen	ATCC	30-2001
Bascule ou roue rotative	N’importe quel
Ciseaux tranchants	Roboz	RS-6702
Filtre jetable stérile avec membrane PES	ThermoFisher Scientific	568-0010
T-150 Flacons	Fisher Scientific	08-772-48
T-25 Flacons	Fisher Scientific	10-126-10
T-75 Flacons	Fisher Scientific	13-680-65
Bécher triangulaire en plastique	Fisher Scientific	14-955-111F	Utilisé pour peser les souris
Trypan bleu	VWR	97063-702
Trypsine-EDTA	ATCC	30-2101
Collagénase de type IV	Sigma-Aldrich	C5138
Plaques de culture tissulaire de 3,5 cm	Nunclon	153066
seringue de 1 mL	BD	309659
1,7 mL microtubes à centrifuger	VWR	87003-294
10 cm Plaques de culture tissulaire	Fisher Scientific	08-772-22
Plaque 12 puits	Corning	3512
Tube à centrifuger 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C
1X Saline tamponnée au phhostphate de Dulbecco (DPBS)	Fisher Scientific	SH30028FS
1X Hank' s Solution saline équilibrée (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
27 g 1/2 po aiguilles	Fisher Scientific	14-826-48
4T1 (ATCC® ; CRL&timide ; 2539&commerce ;)	ATCC	CRL-2539
50 mL tube à centrifuger	Fisher Scientific	14-959-49A
6-Thioguanine	Sigma-Aldrich	A4882
70 &mu ; Filtre à cellules M	Fisher Scientific	22-363-548
70 % éthanol	Sigma Aldrich	E7023	Diluer à 70 % avec de l’eau DI