RÉSEAUX D’ANTIGÈNES FLUORESCENTS TÉTRAMÈRES POUR L’IDENTIFICATION EN UNE SEULE ÉTAPE DE LYMPHOCYTES B SPÉCIFIQUES À L’ANTIGÈNE

Résumé

Ce protocole détaille la production et l’utilisation personnalisables de sondes fluorescentes pour le marquage des lymphocytes B spécifiques de l’antigène.

Résumé

La production d’antigènes fluorescents est une étape critique dans l’identification des lymphocytes B spécifiques de l’antigène. Ici, nous avons détaillé la préparation, la purification et l’utilisation de conjugués fluorescents de l’antigène PEG à quatre bras pour identifier sélectivement les lymphocytes B spécifiques de l’antigène grâce à un engagement avide avec les récepteurs des lymphocytes B apparentés. À l’aide de la chimie click modulaire et des chimies de kits de fluorophores disponibles dans le commerce, nous avons démontré la polyvalence de la préparation de conjugués PEG fluorescents personnalisés en créant des réseaux distincts pour la protéine protéolipide (PLP_139-151) et l’insuline, qui sont des auto-antigènes importants dans les modèles murins de sclérose en plaques et de diabète de type 1, respectivement. Des tests ont été mis au point pour chaque conjugué fluorescent dans son modèle de maladie respectif à l’aide de la cytométrie en flux. Les réseaux d’antigènes ont été comparés à l’auto-antigène monovalent afin de quantifier les avantages de la multimérisation sur les squelettes PEG. Enfin, nous avons illustré l’utilité de cette plateforme en isolant et en évaluant les réponses des lymphocytes B anti-insuline après stimulation de l’antigène ex vivo. Le marquage des lymphocytes B spécifiques de l’insuline a permis de détecter de manière amplifiée les changements de co-stimulation (CD86) qui étaient autrement atténués dans l’analyse globale des lymphocytes B. L’ensemble de ce rapport permet la production et l’utilisation de réseaux d’antigènes fluorescents en tant qu’outil robuste pour sonder les populations de lymphocytes B.

Introduction

Le système immunitaire adaptatif joue un rôle essentiel dans la progression ou la régression de nombreux états pathologiques, notamment l’auto-immunité, le cancer et les maladies infectieuses¹. Pour de vastes applications, y compris l’étude de l’immunopathologie ou le développement de nouveaux traitements de précision, il est souvent essentiel d’évaluer les réponses des lymphocytes B et T spécifiques à l’antigène sous-jacentes à la progression de la maladie ^2,3,4. Les tétramères du principal complexe d’histocompatibilité (CMH) sont largement et commercialement disponibles pour identifier les clones de lymphocytes T spécifiques de l’antigène⁵. Ces constructions marquées au fluorophore présentent des complexes peptide-CMH quadrivalents pour s’engager avidement avec les récepteurs des lymphocytes T apparentés pour des applications de marquage telles que la microscopie et la cytométrie en flux.

Les antigènes pour l’interrogation des lymphocytes B peuvent présenter des poids moléculaires, des charges et des solubilités très variés ^6,7. Lors de l’utilisation d’un antigène monomère comme sondes de lymphocytes B solubles, les propriétés physicochimiques de l’antigène peuvent ne pas être stabilisées par complexation avec la molécule de streptavidine soluble dans l’eau, beaucoup plus grande, ou présenter des problèmes de solubilité en tant que réactifs monomères avant la conjugaison. Ainsi, certaines protéines présentent des difficultés de bioconjugaison et des résultats inattendus en pratique ^7,8. La conjugaison directe des colorants fluorescents peut parfois rendre les constructions insolubles dans l’eau et lipophiles. Ces composés antigéniques directs sont susceptibles d’être intégrés de manière non spécifique dans les membranes cellulaires, ce qui fausse les analyses spécifiques de l’antigène ^7,8,9. Certaines stratégies ont permis de surmonter les problèmes de solubilité en couplant l’antigène et les fluorophores avec d’autres groupes fonctionnels. Cambier et al., par exemple, ont utilisé de l’insuline biotinylée dans sa forme native pour interagir avec les récepteurs des lymphocytes B spécifiques de l’insuline (BCR) avant d’ajouter de la streptavidine marquée au fluorophore de manière progressive¹⁰. Bien que cette approche ait permis d’évaluer les lymphocytes B qui se lient à l’insuline monomère avec une haute résolution, deux étapes de marquage ont été nécessaires. Un protocole généralisable pour la préparation de sondes de lymphocytes B à base de polymères prêtes à l’emploi, facilement intégré aux procédures courantes de marquage des anticorps fluorescents, serait bénéfique pour faire avancer l’étude des lymphocytes B dans la maladie.

Dans ce protocole, nous détaillons la production et l’utilisation de réseaux d’antigènes fluorescents (FAA) pour le marquage généralisable et en une seule étape de cellules B spécifiques de l’antigène pour des expériences de microscopie et de cytométrie en flux (Figure 1). Les puces d’antigènes solubles (SAgAs) ont été utilisées au cours de la dernière décennie comme immunothérapies spécifiques à l’antigène ciblant les lymphocytes B contre les maladies auto-immunes 11,12,13,14,15,16,17,18,19,20,21,22 . Les SAgA exploitent l’affichage de l’antigène multivalent sur des squelettes polymères flexibles pour engager avidement les récepteurs des lymphocytes B et provoquer des effets immunomodulateurs, bien que leur spécificité antigénique offre une autre opportunité de sonder les lymphocytes B d’intérêt lorsqu’ils sont couplés à un fluorophore²³. Les squelettes polymères constituant les SAgAs confèrent une solubilité dans l’eau à la biomacromolécule globale et peuvent atténuer les caractéristiques antigéniques parfois extrêmes qui confondent la génération de sondes et la spécificité de coloration ^6,24. Nous avons greffé de nombreux antigènes de taille et de complexité variées sur la plateforme SAgA en utilisant la chimie click modulaire, ce qui est propice à l’utilisation de petits épitopes peptidiques et de protéines complètes^14,18. Ici, nous démontrons que les FAA sont des outils robustes de marquage des lymphocytes B spécifiques à l’antigène qui peuvent être utilisés en parallèle avec le marquage typique des anticorps fluorescents. Nous avons préparé et évalué des AAG constitués d’insuline humaine pour le marquage des lymphocytes B dans un modèle murin transgénique de diabète de type 1 (VH125), ainsi que des AAP incorporant la protéine protéolipide 139-151 (PLP), un épitope peptidique pour l’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), le modèle murin de la sclérose en plaques. Notre intention en utilisant ces modèles de maladies était de démontrer la polyvalence de cette plateforme, à la fois pour la substitution modulaire des antigènes utilisés, ainsi que la viabilité de l’utilisation avec des épitopes peptidiques (PLP) et des protéines complètes (insuline). Ce protocole est présenté dans un but d’accessibilité, sans qu’une expertise approfondie en bioconjugaison ne soit requise. Les réactifs, ainsi que les méthodes de synthèse et de purification, sont conçus pour être polyvalents et facilement mis en œuvre dans la plupart des laboratoires de recherche axés sur la chimie, la biologie moléculaire ou l’immunologie.

Protocole

Toutes les procédures animales représentées dans ce travail ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université du Kansas.

1. Synthèse d’une puce d’antigènes (4 à 6 jours)

1. Fonctionnaliser l’antigène non modifié à l’aide d’une poignée d’alcyne (1 h). Ajouter 1 insuline équivalente (100 mg, 17,4 μmol) dans un flacon en verre de 20 mL avec un agitateur et dissoudre dans du diméthylsulfoxyde anhydre (DMSO) (2 mL) en chauffant doucement à 40-50 °C à l’aide d’un pistolet thermique ou d’un bain-marie.
   1. Ajouter la 1,1,3,3-tétraméthylguanidine (40,2 mg, 348,8 μmol) et 1,35 équivalents d’une solution mère d’ester de N-hydroxysuccinimide de propargyle (NHS-ester) fraîchement préparée dans du DMSO anhydre (0,3 mL, 5,3 mg, 23,6 μmol).
   2. Remuez pendant 30 min à température ambiante puis trempez la réaction avec 0,05 % HCl (12 ml).
2. Purifier l’insuline-alcyne modifiée individuellement par chromatographie liquide en phase inverse (4 h). Utiliser une colonne préparative en C18 (19 mm x 250 mm, pores de 300 A, taille des particules de 5 μm) avec un gradient de 30 à 40 % B (A, eau avec 0,05 % d’acide trifluoroacétique (TFA) ; B, acétonitrile avec 0,05 % d’AFT) et un débit de 14 mL/min. Le produit souhaité élue immédiatement après l’insuline non modifiée.
   1. Évaporer l’acétonitrile et le TFA par flux d’azote gazeux ou par évaporation rotative sous pression réduite (650 Pascals) et tournant à 150 tr/min. Congelez la solution aqueuse et lyophilisez jusqu’à ce qu’elle soit sèche. Conserver l’insuline fonctionnalisée à -20 °C sous atmosphère sèche.
      REMARQUE : L’insuline fonctionnalisée est stable jusqu’à un an dans ces conditions de stockage.
3. Synthétiser le réseau d’antigènes par cycloaddition d’azotures-alcynes (CuAAC) catalysée par le cuivre (2,5 h)²². Ajouter 6 équivalents d’insuline-alcyne (38 mg, 6,3 μmol) dans un flacon en verre de 10 mL avec un agitateur et dissoudre dans du DMSO (1,2 mL) en chauffant doucement.
   1. Ajouter 50 mM de tampon de phosphate de sodium (1,8 mL) pH 7,4, 1 équivalent de 20 kDa d’azoture PEG à 4 bras (21 mg, 1,05 μmol), de sulfate de cuivre (II) pentahydraté (3,15 mg, 12,6 μmol), de tris(3-hydroxypropyltriazolylméthyl)amine (27,37 mg, 63 μmol) et d’ascorbate de sodium (50,34 mg, 254 μmol).
   2. Remuer pendant 2 h à température ambiante puis ajouter du DMSO (3 mL) pour solubiliser les précipités et acidifier la solution avec 0,05 % de HCl (4 mL).
4. Purifier le réseau d’antigènes par chromatographie liquide en phase inverse (3 h). Utiliser une colonne préparative en C18 (19 mm x 250 mm, pores de 300 A, taille des particules de 5 μm) avec un gradient de 20 à 60 % B de 10 min (A, eau avec 0,05 % d’AGT ; B, acétonitrile avec 0,05 % d’AFT) et un débit de 14 ml/min. Le produit souhaité élue immédiatement après l’insuline-alcyne.
   1. Évaporer l’acétonitrile par flux d’azote gazeux ou par évaporation rotative sous pression réduite. Congelez la solution aqueuse et lyophilisez jusqu’à ce qu’elle soit sèche. Conserver à -20 °C sous atmosphère sèche.
      REMARQUE : La matrice d’antigènes de l’insuline est très hygroscopique. Les fibres lyophilisées peuvent se fondre en une pastille dense après une exposition répétée à l’atmosphère. Les propriétés de la FAA peuvent différer en fonction de l’antigène spécifique à l’application utilisé. Le réseau d’antigènes de l’insuline est stable pendant plusieurs mois dans ces conditions de stockage.

2. Conjugaison des fluorophores (1 à 2 jours)

1. Conjuguer le fluorophore à la matrice d’antigènes (2,5 h). Ajouter 1 insuline tétravalente équivalente (21,7 mg, 0,5 μmol) dans un flacon en verre de 20 mL avec barre d’agitation et dissoudre dans du DMSO (1,75 mL) en chauffant doucement. Ajouter un tampon carbonaté de 100 mM (8 mL) de pH 9,0 et 5 équivalents d’isothiocyanate de fluorescéine fraîchement préparé dans une solution mère de 10 mM de DMSO (0,25 ml, 0,97 mg, 2,5 μmol). Remuer pendant 2 h dans l’obscurité à température ambiante.
2. Purifier le produit par dialyse (24 h). Utilisez un tube de dialyse de coupure de poids moléculaire de 3,5 kDa dans un seau de 5 L agité avec de l’eau distillée dans l’obscurité à température ambiante. Dialysez pendant 24 h et changez la solution de dialyse toutes les 6 à 12 h.
3. Congelez la solution dialysée et lyophilisez jusqu’à ce qu’elle soit sèche pour obtenir le FAA. Conserver dans l’obscurité sous une atmosphère sèche à -20 °C.
   REMARQUE : Le FAA est stable pendant plusieurs mois dans ces conditions de stockage.

3. Caractérisation de la FAA (2 à 4 h)

1. Analyser les produits des étapes 1 et 2 par électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium-polyacrylamide selon Laemmli²⁵ (2 h). Préparez des échantillons contenant 5 g d’antigène monovalent purifié, 20 kDa d’azoture PEG à 4 bras, une puce d’antigènes et du FAA.
   1. Visualisez le marquage au fluorophore dans les échantillons de la FAA par imagerie de fluorescence dans un imageur gel.
   2. Effectuez la coloration au bleu de Coomassie²⁶ pour visualiser l’antigène.
   3. Effectuer une coloration à l’iode²⁷ pour visualiser le squelette PEG. Rincer le gel à l’eau distillée (3 x 2 min), incuber dans une solution de chlorure de baryum à 5 % (20 mL) pendant 10 min, rincer à l’eau distillée (3 x 2 min), incuber dans une solution d’iode 0,1 N (20 mL) pendant 1 min, puis rincer à l’eau distillée (3 x 2 min) pour éliminer les taches de fond avant la visualisation.
      REMARQUE : Pour préparer une solution d’iode à 0,1 N, ajoutez de l’iodure de potassium (2,0 g, 12 mmol) et de l’iode (1,27 g, 5 mmol) à 100 mL d’eau distillée.
2. Calculer le degré de marquage par spectroscopie UV-Vis (1 h). Dissoudre une petite quantité de FAA à 0,1 mg/mL et noter l’absorbance à 280 nm et la longueur d’onde d’absorption maximale du colorant. Obtenir les coefficients d’extinction molaire de l’antigène et du colorant.
   REMARQUE : Certains colorants sont sensibles au pH. Assurez-vous d’utiliser une solution tamponnée appropriée, comme un tampon carbonaté de 100 mM avec un pH de 8,3, lors de la mesure de l’absorbance de la FAA pour vous assurer que le coefficient d’extinction du colorant rapporté est exact.
   1. Effectuez le calcul suivant²⁸ où A_{Dye, maxλ} est l’absorbance FAA à la longueur d’onde d’absorption maximale du colorant, E_{Dye, maxλ} est le coefficient d’extinction molaire à la longueur d’onde d’absorption maximale du colorant, et E_{antigène, 280 nm} est le coefficient d’extinction molaire de l’antigène monovalent à 280 nm. :
      Facteur de correction (CF) = Colorant A_{, 280 nm} /_{Colorant A, maxλ} 0,25 * (_{Colorant A, maxλ} /_{Colorant E, maxλ}) * (_{Antigène E, 280 nm} / (A_{280 nm} – (Colorant A_{, maxλ} * CF))) = colorant/FAA
3. Analyser la FAA pour les colorants libres ou les produits de dégradation potentiels par RP-HPLC (1 h).
   1. Dissoudre une petite quantité de FAA à 1,0 mg/mL et analyser à l’aide d’une colonne analytique en C18 (4,6 mm x 150 mm, pores de 300 A, taille des particules de 2,5 μm) en utilisant un gradient de 5 à 95 % B de 10 minutes (A, eau contenant 0,05 % d’acide trifluoroacétique : B, acétonitrile contenant 0,05 % d’acide trifluoroacétique) avec un débit de 1 mL/min. Réglez le détecteur UV-Vis pour surveiller la longueur d’onde d’absorbance maximale du colorant (437 nm pour FITC).
      REMARQUE : Pour les colorants sensibles au pH, l’analyse HPLC dans les solvants acidifiés peut nécessiter un décalage de la longueur d’onde surveillée par rapport à la longueur d’onde d’absorption maximale du colorant dans des conditions aqueuses neutres. Dans le TFA à 0,05 %, le pH est d’environ 3 et l’absorption maximale du FITC s’est déplacée.

4. Développement du test par titrage FAA (3 à 5 h)

REMARQUE : L’utilisation de la FAA pour la cytométrie en flux est présentée, mais les mêmes étapes peuvent être modifiées pour être utilisées dans d’autres formats tels que l’immunohistochimie ou la microscopie fluorescente. Lors de l’application de FAA pour un nouveau format, un nouveau test d’optimisation doit être effectué. Des populations cellulaires mixtes ou isolées peuvent être obtenues par des méthodes de traitement du sang ou des organes lymphoïdes^23,29. La récolte par digestion enzymatique des tissus n’est pas recommandée, car les marqueurs de surface des cellules peuvent être éliminés.

1. Suspendre le stock de FAA à 1 mg/mL dans un tampon FACS (1 x PBS + 5 % de sérum de veau fœtal et 0,1 % d’azoture de sodium). Jusqu’à 10 % de DMSO peuvent être incorporés pour accélérer la dissolution.
2. Obtenez des cellules positives pour les lymphocytes B spécifiques de l’antigène d’intérêt et distribuez-les dans des tubes de microcentrifugation. Environ 1 x 10⁷ cellules au total seront nécessaires.
   REMARQUE : Les splénocytes ont été prélevés sur des souris VH125 et EAE selon les protocoles approuvés par l’IACUC à l’Université du Kansas pour la présente démonstration. Les chercheurs peuvent utiliser les méthodes décrites dans le présent document pour des échantillons de cellules spécifiques à leur propre application et à la préparation de la FAA.
   1. Distribuer 5 x 10⁵ cellules pour le titrage : marquage des réplicats (au moins 3 réplicats par titrage).
   2. Distribuer 1 x 10⁵ cellules pour des contrôles à coloration unique ainsi qu’un contrôle non coloré.
      REMARQUE : Les isotypes des anticorps et la fluorescence moins un témoin peuvent également être utilisés pour valider pleinement le dosage.
3. Lavez les cellules en ajoutant 1 mL de tampon FACS dans chaque tube. Centrifugeuse à 200 x g pendant 5 min.
4. Aspirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 50 μL de tampon FACS.
5. Ajouter des anticorps fluorescents CD3 et CD19 à chaque échantillon aux concentrations recommandées par le fabricant, ainsi qu’aux doses titrées de FAA.
   REMARQUE : Les concentrations fonctionnelles d’anticorps fluorescents peuvent être titrées indépendamment pour confirmer l’intégrité du lot. Les gammes de doses appropriées de la FAA varient selon l’application, mais un bon point de départ est de 50, 25, 10, 5 et 1 μg par échantillon. 1 μL de solution mère de FAA équivaut à 1 μg de dose.
6. Bien mélanger chaque échantillon et incuber à l’abri de la lumière, sur de la glace pendant 30 min.
7. Après l’incubation, laver les cellules en ajoutant 1 mL de tampon FACS dans chaque tube. Centrifuger les échantillons à 200 x g pendant 5 min.
8. Aspirez le surnageant et répétez le lavage en ajoutant 1 mL de tampon FACS dans chaque tube. Centrifuger les échantillons à 200 x g pendant 5 min.
9. Aspirer le surnageant et remettre les échantillons en suspension dans 200 μL de tampon FACS frais. Placez les échantillons sur de la glace et dirigez-vous vers le cytomètre.
10. Analysez les échantillons sur le cytomètre et collectez au moins 50 000 événements.

5. Analyse de titrage FAA et optimisation de la dose d’étiquetage (1 à 2 h)

1. À l’aide d’un logiciel d’analyse par cytométrie en flux, porte pour cellules uniques.
2. Sur les cellules individuelles, placez des portes pour les CD19+ (lymphocytes B) et CD3+ (lymphocytes T).
3. Dans les populations parentales CD19+ et CD3+, détecter les événements FAA+ dans le canal fluorochrome approprié.
4. Consigner le pourcentage d’événements de FAA+ au sein des populations parentales CD19+ et CD3+.
5. Calculer un rapport de spécificité en divisant la proportion d’événements FAA+ dans la population CD19+ (spécifiques) par la proportion d’événements FAA+ dans la population CD3+ (non spécifiques). Le rapport de spécificité doit être maximisé pour une utilisation réussie par la FAA.
6. Utiliser la dose de marquage correspondant au rapport de spécificité le plus élevé pour les expériences futures.

Résultats

Le rendement purifié en insuline-alcyne (figure 2, panneau supérieur), déterminé en poids, variait généralement de 50 à 65 %. Les rendements inférieurs à 40 % ont probablement été causés par la contamination de l’eau dans le DMSO anhydre et/ou par l’hydrolyse de l’ester NHS de propargyle. Pour la multimérisation de l’antigène (figure 1B), le rendement purifié de la puce d’antigène de l’insuline (figure 2, panneau du milieu) variait ...

Discussion

Nous avons développé un protocole (Figure 1) pour construire des FAA personnalisés pour identifier les lymphocytes B spécifiques de l’antigène, simplifiant ainsi la génération de sondes de lymphocytes B pour les cibles antigéniques difficiles. Nous avons sélectionné des polymères PEG à 4 bras avec des groupes azides terminaux comme substrat facile pour la construction de FAA, car le PEG confère une solubilité dans l’eau tandis que les poignées azides fonctio...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1,1,3,3-tétraméthylguanidine	Alfa Aesar	AAA12314AC
12 M acide chlorhydrique	Fisher Chemical	A508-4
12 % Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10 puits, 30 ul	Bio-Rad	4561043
20 kDa 4 bras PEG	azide Jenkem USA	A7185-1
3,5 kDa Tube de dialyse MWCO (cellulose régénérée)	Fisher Scientific	25-152-10
Acétonitrile, grade HPLC	Fisher Chemical	A998-4
Alexa Fluor 647 anti-souris CD19 Anticorps	BioLegend	115522
diméthylsulfoxyde anhydre	ACROS Organics	AC610420010
chlorure de baryum	ACROS Organics	203135000
Brilliant Blue G-250	Dye Fisher BioReagents	BP100-50
Cell Prime r-insuline	EMD Millipore	4512-01	Insuline humaine recombinante pour la synthèse de l’insuline FAA
Sulfate de cuivre (II) pentahydraté	ACROS Organics	AC197722500
diméthylsulfoxyde Fisher	Chemical	S67496
isothiocyanate de fluorescéine (FITC) isomère 1	Sigma-Aldrich	F7250-1G
Acide acétique glacial	Fisher Chemical	A38-212
Glycérol	ACROS Organics	15892-0010
Glycine	Fisher Chemical	G46-500
homopropargyl-PLP	Biomatik	NA	em>Synthèse personnalisée (séquence : homopropargyl-HSLGKWLGHPDKF ; pureté : 97,29 %)
iode	Sigma-Aldrich	207772-100G
Méthanol, grade HPLC	Fisher Chemical	A452-4
NHS-Rhodamine (5/6-carboxy-tétraméthyl-rhodamine succimidyl ester), mélange d’isomères	Thermo Scientific	46406	A analogue disponible dans le commerce de l’ester Rhodamine-B NHS utilisé dans l’anti-CD3 de souris Paper
PE/Cyanine7	BioLegend	100220
iodure de potassium	Sigma-Aldrich	30315
ester de N-hydroxysuccinimide de propargyle	Sigma-Aldrich	764221
ascorbate de sodium	Sigma-Aldrich	A7631
biocarbonate de sodium	Sigma-Aldrich Sigma-Aldrich	S5761-1KG
dodécylsulfate de sodium	Fisher BioReagents	BP166-100
Sodium phosphate monobasique monohydraté	Fisher Chemical	S468-500
acide trifluoroacétique	Sigma-Aldrich	302031-10x1mL
Base Tris	BioReagents	BP152-500
Tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine	ClickChemTools	1010-1000
xBridge BEH C18 3,5 um, 4,6 x 150 mm	colonne Waters	186003034
Colonne de préparation OBD xBridge BEH C18 5um, 19 x 250 mm	186004021		d’eau