Flux de travail de tomographie en réseau pour l’acquisition ciblée d’informations de volume à l’aide de la microscopie électronique à balayage

Summary

Nous décrivons la préparation de rubans de sections série et leur collecte sur un grand support de transfert pour une utilisation en tant qu’échantillons de tomographie en réseau, ainsi que des procédures d’imagerie automatisées dans un microscope électronique à balayage. Le protocole permet le dépistage, la récupération et l’imagerie ciblée d’événements locaux rares, ainsi que l’acquisition de grands volumes de données.

Abstract

La microscopie électronique est appliquée en biologie et en médecine pour l’imagerie des détails cellulaires et structurels à une résolution nanométrique. Historiquement, la microscopie électronique à transmission (TEM) a fourni un aperçu de l’ultrastructure cellulaire, mais au cours de la dernière décennie, le développement des microscopes électroniques à balayage (MEB) modernes a changé la façon de regarder à l’intérieur des cellules. Même si la résolution de la TEM est supérieure lorsque des détails structurels au niveau de la protéine sont nécessaires, la résolution SEM est suffisante pour la majorité des questions liées à la biologie cellulaire au niveau de l’organite. Les progrès technologiques ont permis des solutions d’acquisition automatique de volume telles que l’imagerie série de la face de bloc (SBF-SEM) et le SEM à faisceau d’ions focalisé (FIB-SEM). Néanmoins, à ce jour, ces méthodes restent inefficaces lorsque l’identification et la navigation vers les zones d’intérêt sont cruciales. Sans les moyens de localisation précise des zones cibles avant l’imagerie, les opérateurs doivent acquérir beaucoup plus de données qu’ils n’en ont besoin (en SBF-SEM), ou, pire encore, préparer de nombreuses grilles et les imager toutes (en TEM). Nous proposons la stratégie de « criblage latéral » à l’aide de la tomographie par réseau en SEM, qui facilite la localisation des zones d’intérêt, suivie d’une imagerie automatisée de la fraction pertinente du volume total de l’échantillon. Les échantillons de tomographie en réseau sont conservés pendant l’imagerie et peuvent être organisés en bibliothèques de sections prêtes pour l’imagerie répétée. Plusieurs exemples sont montrés dans lesquels le criblage latéral nous permet d’analyser des détails structurels incroyablement difficiles d’accès avec toute autre méthode.

Introduction

Malgré l’importance des techniques liées aux EM, l’effort requis pour les maîtriser limite l’ensemble du domaine à un petit nombre de spécialistes. Une difficulté importante est l’identification et la récupération d’une région d’intérêt (ROI) dans les échantillons conservés pour EM. L’apparence d’un même échantillon diffère considérablement lorsqu’il est analysé par microscopie optique et après traitement pour l’observation EM. Les changements pour les échantillons préparés chimiquement comprennent le retrait anisotrope de l’échantillon après les étapes de déshydratation (~ 10% dans chaque dimension) et la perte de fluorescence lors de l’utilisation de l’osmium dans le protocole de fixation et de coloration(Figure 1A). Pour la section ultramince, les échantillons sont incorporés dans des résines époxy ou acryliques en utilisant différentes stratégies(Figure 1B). Pour que cette préparation soit efficace, l’échantillon entier doit être fractionné en morceaux ne dépassant pas 1 mm x 1 mm. Pour répondre aux exigences des conditions d’observation standard de la microscopie électronique à transmission (TEM), cette minuscule partie de l’échantillon est en outre découpée en tranches de 50 à 150 nm d’épaisseur. Les images en niveaux de gris qui en résultent montrent l’organisation tissulaire et la structure des organites d’une fraction infime de l’échantillon entier avec plus de détails que toute autre technique de microscopie(Figure 1C). Un ensemble de données TEM typique fournit des informations 2D, théoriquement extrapolées pour comprendre les processus qui se produisent naturellement dans un espace 3D dans les cellules et les tissus. La figure 1D présente le défi de l’acquisition de volumes ultrastructuraux : si un cube de côté de 1 000 μm est sectionné à 50 nm d’épaisseur, 20 000 sections seront nécessaires pour couvrir tout le volume ; pour un cube latéral de 500 μm, il s’agira de 10 000 sections. Pour couvrir un volume de 50 μm x 50 μm x 50 μm, 1 000 sections « seulement » peuvent être nécessaires. Obtenir ce volume manuellement est pratiquement impossible et extrêmement difficile à effectuer avec l’automatisation. Si, en plus de la profondeur de l’échantillon, nous devons couvrir toute la surface de ces cubes hypothétiques, la couverture de 1 μm² de surface à une résolution raisonnable devient un problème logistique grave(Figure 1E). Alors que pour les projets extraordinaires à grande échelle, tels que les approches connectomiques, le grand nombre de sections est crucial, pour la majorité des projets EM « banals », générer plus de sections nécessaires à l’observation présente un inconvénient important.

Il existe plusieurs méthodes pour acquérir des informations ultrastructurales 3D : la microscopie électronique à transmission à sectionnement en série (TEM), la tomographie TEM, la tomographie en réseau (AT), la microscopie électronique à balayage à balayage par imagerie de bloc de bloc série (SBF-SEM) et la microscopie électronique à balayage par faisceau d’ions focalisés (FIB-SEM). Les principales différences entre ces méthodes sont la stratégie de sectionnement et si l’acquisition d’image est couplée à la génération de section¹. Dans la section série TEM, les sections séquentielles sont collectées sur des grilles de fentes, les images TEM sont générées à partir de ces séquences et alignées^2,3,4,5. En tomographie TEM, les séries d’inclinaison à partir de sections de 150 à 300 nm sur une grille et, lorsqu’elles sont couplées à une section en série, fournissent une très haute résolution, bien que relativement petits volumes^6,7,8. L’approche AT utilise le sectionnement physique avec diverses manières manuelles et semi-automatiques de collecte de sections sur un support relativement grand, tel qu’un couvercle en verre, des plaquettes de silicium ou un ruban spécial. Pour l’acquisition d’images, le support est analysé en SEM, avec diverses stratégies d’acquisition d’images sont disponibles^9,10^{,11,12,13,14,15} . Pour SBF-SEM, le sectionnement physique est réalisé à l’aide d’un mini-microtome avec un couteau diamanté serti directement à l’intérieur de la chambre SEM, l’image SEM étant générée à partir de la surface du bloc de résine^16,17,18,19. Pour FIB-SEM, la source d’ions élimine les couches minces de l’échantillon, suivie de l’imagerie automatique de la surface exposée par le SEM^20,21. La tomographie TEM et l’AT génèrent des sections physiques, qui peuvent être ré-imagées si nécessaire, tandis que FSBF-SEM et FIB-SEM éliminent la section après imagerie. Une combinaison récente de sections physiques imagées par un SEM multifaisceaux fournit une combinaison de méthodes qui résout le problème du « goulot d’étranglement » de la vitesse d’acquisition d’image²². Chacune de ces techniques a révolutionné la façon dont les données EM peuvent être obtenues et analysées, et chaque approche a ses impacts pratiques liés à une question de recherche donnée.

Compte tenu de la nature de la préparation et de l’échelle des dimensions ultrastructurales, il n’est pas facile de prédire où se trouve une structure cible spécifique dans le bloc d’échantillon (Figure1D, E). Une solution pour la localisation du retour sur investissement consiste à enregistrer les images de l’ensemble du bloc à la résolution souhaitée dès le début. Les structures d’intérêt peuvent être dans le volume de données acquises lorsqu’elles sont éloignées du microscope. Le temps d’acquisition et le traitement des données associés à cette stratégie sont problématiques. Il est souhaitable de réduire la quantité de données enregistrées, en particulier si les ROI sont beaucoup plus petits que le bloc tissulaire, c’est-à-dire si les objets d’intérêt sont des types spécifiques de cellules (et non des organes entiers). Différentes techniques corrélatives de microscopie optique et électronique (CLEM) peuvent être couronnées de succès lorsque la fluorescence est préservée et localisée avant ou après préparation dans le même échantillon^{23,24,25,26,27,28,29}. Néanmoins, de nombreuses structures cellulaires sont reconnaissables même sans corrélation de fluorescence, uniquement sur la base de l’ultrastructure connue. Pour ces cas, nous pensons que la tomographie par réseau de criblage latéral fournit un compromis entre l’effort investi dans la localisation du retour sur investissement et la qualité de l’information ultrastructurale. En utilisant cette stratégie, un sous-ensemble de sections sur la plaquette est passé au crible à intervalles réguliers, qui peut être établi en fonction de la taille et de la nature du retour sur investissement. Une fois les retours sur investissement trouvés, l’acquisition de données est mise en place dans une série continue de sections commençant avant et se terminant après la section d’ancrage, recueillant les informations pertinentes de manière ciblée.

Nous présentons des protocoles pour AT qui simplifient et accélèrent l’acquisition de régions ou d’événements d’intérêt dans de nombreuses sections et produisent des volumes d’images mieux alignés. Le criblage latéral et l’acquisition en plusieurs étapes produisent des données à très haute résolution dans des régions ciblées avec précision. La procédure que nous décrivons répond à plusieurs défis de l’acquisition de données EM 3D, car elle prévoit: la compatibilité avec un large éventail d’échantillons sans modifier fondamentalement le flux de travail de préparation des échantillons; localisation ciblée pour le sectionnement et les acquisitions SEM; réduction du temps et des efforts lors de l’installation; imagerie de régions en plusieurs sections avec un meilleur alignement des volumes résultants; et une procédure d’assemblage et d’alignement lisse pour compiler différentes images dans une image en mosaïque cousue. Nous avons choisi de démontrer la force de notre méthode avec plusieurs échantillons de projets publiés et en cours. Nous croyons que cette approche peut faciliter considérablement la production et l’acquisition de données ciblées sur la GU, même pour les chercheurs ayant une expérience limitée en matière de GU.

Protocol

NOTE: Les méthodes de préparation des échantillons sont décrites^{ailleurs 14,30,31}et ne sont pas couvertes dans cette publication. En bref, les exemples montrés ont été chimiquement fixés avecdu glutaraldéhyde, post-fixés avec 1% d’OsO4, puis traités avec de l’acétate d’uranyle aqueux à 1% avant d’être incorporés dans la résine incorporée. Alternativement, les échantillons peuvent être préparés en utilisant la congélation à haute pression, congeler remplacé par 0,1% d’acétate d’uranyle dans l’acétone et incorporé dans de la résine acrylique. Les blocs d’échantillons ont été préparés à l’aide d’une méthode d’intégration plate qui permet une vue claire de l’échantillon, facilitant ainsi son orientation pour la section (Figure 1B).

1. Procédure de génération de baie

1. Orientation et rognage d’échantillons incorporés
   1. À l’aide de la jumelle / microscope, identifiez et marquez le retour sur investissement sur la surface du bloc intégré en grattant légèrement la surface du bloc avec une lame de rasoir. Cela aidera à orienter l’échantillon à l’intérieur de l’ultramicrotome et réduira la surface de sectionnement.
   2. Serrez l’échantillon sur le support ultramicrotome (Figure 2A).
   3. Coupez la résine autour de l’échantillon, d’abord avec la lame de rasoir (rognage brut) et continuez avec l’outil de coupe en diamant (rognage fin; Figure 2A). Utilisez des couteaux avec une inclinaison de bord de 20 ° ou 90 ° pour vous assurer que les surfaces supérieure et inférieure du bloc sont parallèles au bord de coupe du couteau.
      REMARQUE : cette étape est essentielle pour la sectionnement en série et l’acquisition de rubans droits.
   4. Mélanger le xylène et la colle dans une proportion de 3:1. Avec un cil attaché à un cure-dent, appliquez ce mélange sur les bords supérieur et inférieur du bloc coupé. Laissez-le sécher à fond.
2. Préparez le support de montage de la baie A (c’est-à-dire les plaquettes de silicium).
   1. Coupez la pièce de plaquette à l’aide d’un outil de clivage de plaquette (EMS), en ajustant sa taille à l’objectif du projet. 2 cm x 4 cm est pratique pour les observations en microscopie optique et électronique.
   2. Nettoyez la plaquette dans de l’eau distillée pour vous débarrasser des débris.
   3. La décharge incandescente / plasma nettoie la surface à l’aide d’un équipement standard. Les paramètres précis dépendront de la machine utilisée. Commencez par les paramètres de décharge des grilles et ajustez empiriquement l’heure. Cette étape est cruciale pour une bonne répartition des sections sur le support pendant le séchage des sections et ne doit pas être omise.
3. Préparez le support de montage B des matrices (c.-à-d. couvercle en verre)
   1. Si vous planifiez des expériences d’immuno-marquage multiplex, transférez les échantillons sur un couvercle pour mieux détecter le signal de fluorescence. Pour améliorer l’adhérence du couvercle, utilisez une procédure détaillée de revêtement à la gélatine décrite précédemment⁹.
   2. Augmenter la conductivité en recouvrant les lames d’oxyde d’indium-étain (ITO) ou d’or par évaporation. Conservez les couvercles préparés dans un environnement propre. Décharge incandescente des échantillons comme décrit au point 1.2.3.

2. Sectionnement de l’échantillon

1. Préparation du couteau AT
   REMARQUE: Pour générer les tableaux, utilisez un couteau modifié (ATS), conçu pour faciliter l’acquisition de longs rubans. Les couteaux Histo-Jumbo ou des couteaux similaires conçus pour la génération des sections sur de grands supports peuvent également servir pour le sectionnement AT.
   1. Fixez l’aiguille au fond du couteau à l’aide du ruban adhésif mousseux et percez-la(Figure 2B). Placez le couteau ATS dans le support ultramicrotome à 0°. Ajustez le bord du couteau parallèlement à la surface du bloc à l’aide de la procédure standard.
   2. Amenez le bloc coupé sur le bord du couteau dans une position prête pour le sectionnement.
   3. Placez la plaquette / couvercle à l’intérieur du bassin du couteau et remplissez-le d’eau au même niveau que le bord du couteau. Laissez le bord en diamant du couteau humidifier correctement et, si nécessaire, retirez l’eau à l’aide de la seringue attachée (Figure 2C).
2. Sectionnement et transfert de baies
   1. Réglez le microtome sur les paramètres de coupe souhaités. Avec le couteau ATS, la plage de 50-100 nm et une vitesse de coupe de 0,6-1 mm/s sont conseillées. Commencer le sectionnement (Figure 2Di).
   2. Obtenez un ruban de la longueur qui couvrira un volume z ciblé et arrêtera la collection. Selon la taille du bloc, l’homogénéité du tissu et le type de résine, le ruban sera relativement droit (Figure 2D-ii). De nombreux échantillons ne produiront pas de rubans droits, malgré l’effort investi et le type de couteau utilisé.
   3. Selon l’objectif final, faites un ou plusieurs rubans courts alignés côte à côte. Un support de 2 cm x 4 cm peut facilement contenir 100 à 1 000 sections. La disposition du ruban sur la marche de support est une étape qui nécessite de la dextérité et des mains fermes. Cependant, la courbe d’apprentissage de cette compétence est rapidement acquise.
   4. Détachez le ruban du bord du couteau à l’aide d’une pointe propre et non collante d’un cil collé sur le cure-dent (Figure 2Diii).
   5. À l’aide des cils, déplacez doucement le ruban au-dessus du centre du support. À ce stade, utilisez du chloroforme ou un stylo chauffant pour étirer les sections si nécessaire. Cependant, rappelez-vous que cette manipulation peut induire une rupture et une déformation du ruban.
   6. Commencez à drainer l’eau en tirant sur la seringue. Pour des rubans plus délicats ou une rétraction de l’eau plus lente, laissez couler l’eau en détachant la seringue du tuyau. Lorsque le niveau d’eau descend au niveau de la plaquette, contrôlez le ruban et repositionnez-le si nécessaire, en poussant doucement le ruban vers le centre. Après avoir déposé les rubans sur la surface de la plaquette, continuez à drainer jusqu’à ce que l’eau restante soit complètement rétractée du bassin.
      REMARQUE: Si vous n’utilisez pas le couteau ATS à rétraction d’eau de fond, réduisez soigneusement l’eau des côtés du couteau ATS pour ne pas induire de turbulence.
   7. Laissez les sections sur le support à l’intérieur du bain pour laisser sécher complètement. Selon l’hydrophobicité du support et le niveau d’humidité ambiante, l’eau s’évapore à un rythme différent(Figure 2Div). Il est important de laisser l’échantillon sécher lentement pour diminuer ou éviter complètement tous les plis de l’échantillon.
   8. Transférer l’échantillon sec dans une boîte bien fermée pour le protéger de la contamination par la saleté et le placer dans un four à 60 °C pendant au moins 30 min. Si nécessaire, contre-taches en utilisant des métaux lourds pour améliorer le contraste global.
   9. À la fin de la procédure, nettoyez prudemment le couteau en suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE: Le transfert de sections multiples ou série sur une plaquette (Figure 2E) par rapport au transfert sur une grille de fentes (Figure 2F) modifie complètement l’expérience de préparation EM. La section et la collecte ininterrompues des sections sur un support unique réduisent la quantité d’erreurs liées à la section et à la collection de sections fréquemment commises dans la section série. L’équivalent de 100 sections de 1000 μm x 500 μm collectées sur une plaquette correspond à 33 grilles de fentes (Figure 2G).

3. Observation de l’échantillon

REMARQUE : cette section décrit les étapes du flux de travail telles qu’implémentées à l’aide d’un logiciel disponible dans le commerce (voir Tableau des matériaux). Tout logiciel d’acquisition d’images sur n’importe quel SEM équipé des détecteurs appropriés peut être utilisé, cependant, les actions spécifiques de l’utilisateur seront différentes et seront souvent plus manuelles.

1. Obtenez une carte d’ensemble des images SEM qui révèle l’emplacement des sections sur la plaquette. Une image de caméra optique intégrée aide à définir une mosaïque d’images SEM qui couvre un ruban de sections ou toutes les sections. Créez la mosaïque en cliquant avec la souris à droite sur l’image de la caméra de l’échantillon et démarrez l’acquisition automatique.
   REMARQUE: Les paramètres d’imagerie très grossiers, c’est-à-dire une taille de pixel de 1 à 2 μm et un temps de séjour de 1 μs suffisent. Ce processus est illustré dans les documents supplémentaires (pages 2 à 7).
2. Localisez les sections à l’aide de la fonction détection automatique du Localisateur de sections ou localisez-les manuellement. Les positions et les contours des sections sont récupérés automatiquement avec ce logiciel en fonction de la correspondance d’images. Pour une illustration de ce processus, voir Documents supplémentaires (pages 8 à 15).
3. Dans le cas où les images d’aperçu n’affichent pas clairement les retours sur investissement, acquérez des images de sections de plus haute résolution. Utilisez la fonction Aperçu de section pour créer et acquérir automatiquement des images. Ce processus est illustré dans les documents supplémentaires,pages 16-18. Les paramètres d’imagerie doivent être choisis en fonction de la nature et de la taille du retour sur investissement recherché par l’utilisateur.
   1. Pour trouver les paramètres optimaux, activez l’imagerie en direct dans le logiciel de contrôle du microscope et accédez à un retour sur investissement. Modifiez les paramètres d’imagerie jusqu’à ce que les images affichent clairement les retours sur investissement, mais l’acquisition d’images n’est pas excessivement longue.
4. Définir des régions d’imagerie
   NOTE : Plusieurs stratégies différentes sont proposées.
   1. Si seules quelques sections doivent être imagées, utilisez les images des sections créées jusqu’à présent pour accéder aux sections pertinentes et utilisez la visionneuse zoomable qui affiche toutes les images acquises dans leur emplacement relatif d’origine pour regarder toutes les sections. Une fois qu’une section doit être imagée en haute résolution est trouvée, créez une région d’imagerie en faisant glisser un clic. Choisissez les paramètres d’imagerie haute résolution et stockez-les dans un modèle. Réutilisez ce modèle pour d’autres sections.
   2. Pour trouver des événements rares particulièrement petits ou difficiles à détecter, utilisez l’approche de dépistage latéral. Créez manuellement une région d’imagerie avec des paramètres d’imagerie haute résolution sur dix sections ou sur une section par ruban et acquérez les images. Passez en revue les images et marquez les sections qui contiennent le retour sur investissement dans le logiciel ou prenez note.
      1. En partant des sections qui contiennent le retour sur investissement, naviguez vers l’avant et vers l’arrière dans l’ensemble de sections et créez des régions d’imagerie haute résolution dans les mêmes emplacements relatifs tant que la structure est toujours visible dans la section. Cela peut être fait manuellement ou en utilisant la procédure décrite dans les étapes suivantes.
   3. Acquérir des images dans plus de dix sections consécutives. Cliquez sur Affiner la position de départ après avoir zoomé sur l’image pour augmenter la précision des emplacements de section enregistrés, comme décrit dans le manuel. Cela réduit la variabilité de position des séries d’images. La procédure est illustrée et expliquée dans les pages 19 à 21 du Matériel supplémentaire.
   4. Cliquez sur n’importe quelle section pour définir une région d’imagerie tout en maintenant la touche Alt enfoncée et sélectionnez Créer un tableau de jeux de tuiles dans le menu contextuel qui s’ouvre lorsque le bouton de la souris est relâché. Le logiciel crée ensuite des régions d’imagerie au même emplacement relatif dans toutes les sections qui ont été trouvées ou marquées précédemment. Il est possible de limiter l’imagerie à une plage spécifique de sections à l’aide du curseur Portée de section.
      REMARQUE: Cette procédure peut être répétée avec n’importe quel nombre de régions d’imagerie et permet donc d’enregistrer de nombreuses petites images haute résolution au lieu d’enregistrer une seule image plus grande sur chaque section.
   5. Une fois créé, configurez le nombre de pixels, la taille des pixels, la disposition du carrelage, le temps de séjour des pixels, etc. dans chaque série d’images selon vos besoins. Une fois les séries d’imagerie créées et configurées, elles sont toutes répertoriées dans un repère de travail.
5. Configurer les fonctions automatiques et démarrer l’acquisition d’images
   1. Créez une série d’images distincte pour les fonctions automatiques en utilisant la même méthode que celle décrite à l’étape précédente. Déplacez la série d’images vers une position sur la section qui contient des structures à contraste élevé.
   2. Définissez la série d’images sur 1024 x 884 pixels et choisissez une taille de pixel correspondant à la résolution la plus élevée utilisée dans la série d’images configurée dans les étapes précédentes. Dans la liste des fonctions automatiques, cochez Auto Focus et Auto Stigmator.
   3. Sélectionnez Par section dans les contrôles de séquence d’acquisition et assurez-vous que l’image des fonctions automatiques est le premier élément de la liste. Démarrez l’acquisition d’image en cliquant sur le bouton Exécuter en regard du repère de tâche. Ces procédures sont illustrées dans les documents supplémentaires,pages 22-23.
      REMARQUE: Il n’est pas nécessaire de se pré-concentrer manuellement sur chaque section. Pendant la session d’enregistrement, chaque fois que le microscope avance vers une nouvelle section, les fonctions automatiques seront exécutées avant que toutes les autres images ne soient enregistrées dans cette section.

4. Alignement et analyse des données

1. Exportation de données
   1. Assurez-vous que les données sont enregistrées dans .tif format, de sorte qu’il n’y a pas besoin d’une fonction d’exportation dédiée. Triez les données dans une structure de dossiers qui correspond directement aux couches et aux éléments de l’arborescence des couches.
   2. Une fois les mosaïques d’images enregistrées, utilisez la fonction StitchAll pour assembler automatiquement toutes les tuiles.
2. Alignement et recadrage des piles aux Fidji
   NOTE. De nombreux progiciels (gratuits et commerciaux) peuvent être utilisés pour travailler avec les données Array Tomography. Les étapes ci-dessous sont montrées avec le programme open-source Fiji³² car il est largement disponible et contient toutes les fonctions requises.
   1. Importez une pile d’images (ou d’images assemblées) dans Fidji en tant que pile virtuelle.
   2. Si le contraste/luminosité doit être normalisé, choisissez Contraste amélioré... dans le menu Processus. Définissez Pixels saturés sur 0,1 ou moins, puis cochez Traiter toutes les tranches.
   3. Dans le menu Plugins, choisissez Enregistrement | Alignement linéaire de la pile avec SIFT.
   4. Choisissez Rigide ou Affine dans le menu déroulant Transformation attendue. Sinon, conservez les paramètres par défaut. Démarrez l’alignement en cliquant sur OK.
      REMARQUE: Le chargement des données en tant que pile virtuelle permet à Fidji de gérer des piles de toute taille. La sortie de l’alignement est créée en RAM ; toutefois, cela peut limiter la taille maximale des piles pouvant être traitées. Dans ce cas, utilisez Register Virtual Stack Slices, qui est une implémentation de dossier à dossier du même algorithme d’enregistrement. Une fois l’enregistrement terminé, chargez les données de sortie en tant que pile virtuelle.
   5. Recadrez la pile d’images en cliquant sur Recadrer afin qu’elle ne contienne que le retour sur investissement.
   6. Enregistrez la pile en tant qu’image .tif unique ou série d’images .tif.
      REMARQUE : Les étapes critiques de la tomographie en réseau sont illustrées à la figure 3.

Results

Les exemples ci-dessous visent à démontrer la polyvalence des flux de travail recommandés. Les illustrations des études de cas sont des projets pour lesquels nous avons eu du mal à obtenir des résultats satisfaisants avec d’autres techniques. Nous avons choisi la drosophile adulte pour illustrer les défis typiques que l’on pourrait rencontrer avec de nombreux types d’échantillons. Cet organe tubulaire d’environ 6 mm de long, de 500 à 1000 μm de section transversale, est divisé en différentes régions ayant une fonction et une composition cellulaire uniques(Figure 4A)³³. Selon l’orientation du sectionnement, les dimensions du profil intestinal et son apparence sur la section varient. Les sections transversales ou longitudinales sont relativement grandes et seuls deux peuvent être placés sur une seule grille TEM(Figure 2F). Seule une petite partie du tissu peut être imagée dans le FIB, et pour le SBF-SEM, la difficulté est similaire à celle de tout échantillon non homogène. AT fournit un compromis efficace pour l’analyse de tels échantillons et l’intégration plate facilite la localisation du retour sur investissement. Il est important de couper soigneusement l’excès de résine autour de la zone sélectionnée (Figure 4B) pour une collecte efficace des matrices de la zone concernée (Figure 4C). Des centaines de sections peuvent être collectées sur une seule plaquette de manière séquentielle ou aléatoire(Figure 4D). Selon la question de recherche, le criblage et l’acquisition d’échantillons nécessiteront une stratégie différente, que nous divisons arbitrairement en plusieurs scénarios. Pour illustrer les différents scénarios présentés de manière plus ciblée, nous avons choisi plusieurs études de cas des différents projets de recherche.

Analyse de nombreuses grandes structures réparties aléatoirement dans une plage de 1 à 10 μm (Figure 4E)
Souvent, des données ultrastructurelles sont nécessaires pour valider une hypothèse issue de plusieurs approches expérimentales, comparant une condition standard et une condition modifiée expérimentalement. Dans ces cas, plusieurs sections sont généralement collectées au hasard sur des grilles et filtrées pour localiser et imager les zones d’intérêt. Cette tactique est généralement moins systématique et limitée à un petit nombre de sections analysées. Nous suggérons d’enregistrer des aperçus de dizaines/centaines de sections de moyenne résolution à partir d’un ruban donné(Figure 4D). Pour les sections typiques de 70 nm, 200 sections s’étendront sur environ 14 μm, qui contiendront de nombreuses cellules, entièrement ou partiellement, achevées en une demi-heure. Dans un premier temps, la vue d’ensemble basse résolution de l’ensemble du ruban est enregistrée, et la vue d’ensemble permet d’omettre les sections qui montrent les artefacts de préparation (par exemple, plis, saleté). Ensuite, l’acquisition peut être effectuée manuellement ou automatiquement directement sur des parties sélectionnées de la section, ou une section entière, en utilisant l’imagerie simple ou mosaïque, suivie d’une couture (Figure 4E). Ensuite, les images de la zone sélectionnée peuvent être acquises à l’aide de paramètres haute résolution. Par exemple, les mitochondries, les noyaux et les microvillosités peuvent bénéficier d’une telle méthode statistiquement améliorée(Figure 4Ei-iii).

Analyse de plusieurs petites structures peu réparties de 500 à 1 000 nm (film supplémentaire 1)
Dans ce scénario, le retour sur investissement ne peut pas être simplement identifié dans une analyse de vue d’ensemble à faible grossissement, et des images haute résolution sont nécessaires. Dans les échantillons TEM conventionnels, le zoom avant et arrière fastidieux de la section est nécessaire jusqu’à ce que la fonction requise soit trouvée. Souvent, l’imagerie de plusieurs emplacements indépendants dans plusieurs échantillons est statistiquement plus pertinente que la génération d’un seul grand volume. Dans de tels cas, la complexité de l’acquisition manuelle augmente de façon exponentielle. Bien que plusieurs solutions de GDT permettent l’acquisition automatique ou le criblage de plusieurs grilles, la taille de la grille et les défis de sectionnement en série rendent souvent l’approche incompatible pour de nombreux échantillons. Pour des cas similaires, nous générons une carte complète à moyenne résolution d’un retour sur investissement global en plusieurs sections à une résolution suffisante pour identifier les structures d’intérêt. Au cours de cette étape de dépistage latéral, il est conseillé de sauter plusieurs sections à la fois, dans le but de frapper au moins une partie de la structure d’intérêt lorsqu’elle est approchée de manière aléatoire. Cela dépendra en grande partie des dimensions globales de la structure : par exemple, si la taille globale de la structure est de 500 nm et que les sections ont une épaisseur de 50 nm, au moins neuf sections séquentielles d’affilée contiendront probablement une partie de la structure d’intérêt. De cette façon, le saut de 6 à 7 sections doit être efficace pour trouver de nombreux types de structures différents dans plusieurs zones. L’acquisition automatique des cartes mosaïques résolues des sections sélectionnées permet un criblage minutieux de ces sections après leur acquisition. Une fois qu’une telle carte haute résolution est acquise, plusieurs retours sur investissement peuvent être recadrés ou utilisés pour définir des zones d’imagerie locales supplémentaires sur les retours sur investissement(film supplémentaire 1). Golgi, centrioles, jonctions, microtubules, différents types de vésicules sont de bons exemples des structures qui pourraient bénéficier de ce scénario (Film supplémentaire 1).

Analyse de grands rois de retour sur investissement peu répartis dans de grands échantillons (figures 4F-4H)
Ce scénario implique des événements rares, qui sont souvent décrits comme « une aiguille dans une botte de foin » dans lesquels le problème n’est pas dans l’identification du retour sur investissement mais sa localisation. Pour de nombreux échantillons, l’approche corrélative n’est pas une option valable, mais souvent le retour sur investissement a une ultrastructure révélatrice et, lorsqu’il est localisé, peut être identifié avec une grande fiabilité. Pour ces échantillons, il est essentiel d’appliquer l’acquisition à plusieurs niveaux, en commençant par les échantillons présélectionnés avec des dizaines à des centaines de sections à moyenne résolution. Dans le logiciel utilisé ici, il existe deux stratégies différentes pour obtenir des ensembles d’images de plusieurs sections: Enregistrement des images d’aperçu à une résolution plus élevée ou acquisition d’un jeu de tuiles de tableau avec des paramètres appropriés (Figure 4F). Différents types de cellules spécialisées dansl’intestin de la drosophile sont répartis de manière aléatoire (par exemple, cellules souches, entéroendocrines) et sectionnés minces à une orientation aléatoire. Pourtant, ils peuvent être distingués visuellement après avoir examiné les images obtenues à l’aide de paramètres haute résolution, soit à partir de sections individuelles, soit sous la forme d’une collection d’images série(Figure 4G). Après l’alignement, les piles peuvent être rendues à l’aide de différentes solutions logicielles(Figure 4H, Film supplémentaire 2).

Scénario 1 : Organoïdes intestinaux (Figure 5A)
Les organoïdes deviennent rapidement l’un des outils les plus avancés des sciences de la vie modernes. Ce modèle d’organe dérivé de cellules souches 3D quasi physiologique permet une étude précise d’une gamme de processus biologiques in vivo, y compris le renouvellement des tissus, la réponse aux médicaments et la médecine régénérative. Les mini-tubes intestinaux³⁴ récemment introduits ouvrent une nouvelle génération de technologie organoïde, ressemblant étroitement à la physiologie tissulaire in vivo, à la composition de type cellulaire et à l’homéostasie, permettant de larges perspectives pour la modélisation de la maladie, l’interaction hôte-microbe et la découverte de médicaments. Cependant, lorsque la caractérisation ultrastructurale est nécessaire, la localisation de différents types de cellules dans des tissus aussi volumineux à l’aide d’échantillons aléatoires peut être difficile. En outre, dans les tests d’infection variables, il est crucial de s’assurer que l’analyse révèle différents stades de développement qui affectent le tissu. Pour de telles études, une couverture statistiquement significative de l’échantillon est centrale, mais difficile à atteindre en utilisant l’approche tem traditionnelle sur le réseau. Le scénario AT 1 est bénéfique dans de tels cas : de nombreuses sections séquentielles peuvent être générées sur une plaquette(Figure 5Aii)et filtrées à l’aide de paramètres de basse résolution pour localiser les zones d’intérêt général (Figure 5Aiii; flèches). Ces zones peuvent être ciblées pour une analyse plus approfondie à l’aide de paramètres d’acquisitionavancés (figures 5Aiv et Figure 5Av). Lorsqu’une structure pertinente est détectée (généralement un groupe de 5 à 10 sections une fois sur 100 à 300 sections), il est facile de se concentrer sur chacune des structures d’intérêt et d’acquérir manuellement des images uniques ou d’utiliser les fonctions d’automatisation pour acquérir des volumes d’images sur plusieurs sections.

Scénario 2 : Drosophila pupal notum (Figure 5B)
L’étude de la division cellulaire et des mécanismes qui contrôlent la progression à travers le cycle cellulaire est cruciale pour comprendre les processus standard et modifiés dans les organismes multicellulaires. L’information existante est souvent dérivée de systèmes unicellulaires; cependant, cette solution n’a pas le contexte critique des interactions 3D entre les cellules d’un tissu. Une monocouche unicellulaire du notum, le dos en développement de la larve de drosophile, est un modèle parfait pour l’interaction entre les cellules épithéliales en général et la division cellulaire en particulier³⁵. Il s’agit d’un modèle établi pour les études des interactions moléculaires et cellulaires utilisant la combinaison des données disponibles par microscopie fluorescente et manipulations génétiques. L’abscission, dernière étape de la division cellulaire, assure la séparation finale entre deux cellules en division, et la caractérisation des changements structurels qui se produisent pendant l’abscission est essentielle à notre compréhension de la mitose. Cependant, les divisions mitotiques dans le notum ne sont pas faciles à localiser au niveau ultrastructurel : les cellules sont relativement grandes, par rapport à la zone d’abscission (Figure 5B). Le rapport entre la taille globale de la zone d’abscission et la surface de la section à couvrir est important (Figure 5Bi). Même s’il est possible de localiser la zone d’abscission en utilisant les méthodes TEM ou SBF-SEM^36,la tâche est laborieuse. Avec ce scénario, les images de vue d’ensemble automatiques à moyenne résolution des sauts de 20 à 40 sections peuvent être utilisées pour localiser les cellules en division (Figure 5Bii). Lorsque de telles cellules sont identifiées, les sections servent d’ancrage pour un examen plus approfondi des sections à proximité, et de nombreuses cellules en division peuvent être trouvées et sélectionnées pour une analyse plus approfondie. De cette façon, la zone d’abscission peut être localisée et imagée dans son intégralité (Figure 5Biii). Selon la question, des images haute résolution uniques ou 3 à 7 séquences d’images peuvent être collectées pour couvrir la profondeur de la structure(Figure 5Biv).

Scénario 3 : Neurones tanycytes de souris (Figure 5C)
La souris fournit un modèle bien établi pour le développement du cerveau et est bien documentée à différents niveaux, y compris par EM. Même si différentes méthodes automatisées de blocs en série ont été largement utilisées pour étudier le tissu cérébral, il existe des cas où l’AT est mieux adapté pour collecter les données nécessaires. L’hypothalamus est un modèle de neuroscience bien établi, une partie du cerveau qui contient de multiples fonctions neuronales. Les tanycytes hypothalamiques représentent un sous-ensemble particulier de cellules épendymogliales tapissant le bas du troisième ventricule, avec des processus inhabituellement longs (jusqu’à 300 μm) et de grandes extrémités (~ 5 μm)³⁷. Cela les rend peu pratiques pour l’analyse par les méthodes TEM ou FIB. La tâche est encore compliquée lorsque plusieurs tanycytes indépendants doivent être localisés et analysés. L’une des approches pour faciliter cette tâche peut être le ciblage semi-corrélatif, dans lequel la carte de fluorescence est obtenue à partir des échantillons marqués par fluorescence avant la fixation et l’intégration pour EM. Le sectionnement est effectué sur la zone capturée en combinant les informations de position de l’échantillon de fluorescence et de la réplique en plastique plat intégré. Après cela, le scénario AT 3 peut être utilisé: les images de mosaïque de vue d’ensemble de haut niveau sont générées pour révéler les régions avec des grappes d’extrémités tanycytes. Par la suite, les fonctions d’automatisation du logiciel sont utilisées pour configurer l’acquisition de séquences d’images à partir d’une ou plusieurs zones dans une seule image ou en mode mosaïque. Ces images peuvent être analysées séparément, sous forme de piles alignées ou rendues par la suite.

La puissance de la méthode AT permet la « mise à niveau » relativement sans effort des données de la 2D à la 3D : les cartes sont disponibles à partir de l’acquisition primaire, et les volumes peuvent être obtenus à partir de la zone sélectionnée et de son voisinage. La pile résultante peut être alignée et rendue par la suite. Il est essentiel de déterminer à l’avance quelle résolution et quelle qualité d’image sont nécessaires pour trouver des rois. L’imagerie doit permettre de reconnaître le retour sur investissement, mais pas au-delà de cette valeur, car le temps d’acquisition s’échelonne proportionnellement au temps de séjour des pixels et au carré inverse de la taille des pixels.

Figure 1: Défis de la préparation des échantillons EM et de l’acquisition du volume. (A) La perte de fluorescence et de retrait se produit en raison d’une concentration élevée de métaux lourds et de la déshydratation lors de la préparation de l’échantillon. i) Un dessin schématique d’un spécimen observé sous LM ii) le même spécimen préparé pour EM, qui devient complètement opaque et perd environ 10 % de son volume. (B) L’incorporation des échantillons se fait généralement à l’aide de résines époxy ou acryliques. Les blocs traditionnels (i) peuvent être utilisés avec succès pour des échantillons homogènes qui ne nécessitent pas d’orientation particulière. Les blocs plats (ii) sont utiles lorsqu’il est essentiel de cibler et d’orienter au microscope, une zone précise destinée au sectionnement, par exemple dans des échantillons non homogènes ou des procédures de microscopie corrélative. (C) Sur l’ensemble du volume de l’échantillon, seule une fraction limitée est représentée sur une seule section de 50 nm, fournissant une image 2D d’un échantillon 3D, souvent dans une orientation inconnue. (D) Pour illustrer le problème de l’enregistrement de volumes trop importants par rapport à un ciblage précis, nous avons choisi trois cubes concentriques avec les faces de 1000, 500 et 50 μm sont organisés pour inclure un échantillon hypothétique de 1000 x 500 x 500 μm (marron foncé). Si de tels cubes d’échantillon hypothétiques sont soigneusement sectionnés avec des tranches de 50 nm, pour couvrir tout le volume, il faudra un total de 20 000, 10 000 et 1 000 tranches, et 800 tb, 100 tb et 100 gb, en conséquence (résolution d’imagerie 5 nm x 5 nm x 50 nm, données 8 bits). Cela montre l’importance de planifier l’acquisition de données EM uniquement pour acquérir le volume minimum nécessaire. (E) Couvrir une grande surface d’échantillon en haute résolution présente un problème similaire à celui d’un grand volume. Le carrelage de plusieurs images haute résolution en une seule est une solution utile pour un tel problème. Cependant, pour couvrir une surface de 1 mm x 1 mm à l’aide du cadre 2024 x 1048 dans un grossissement de 10 000x, il faudra un grand nombre de carreaux, ce qui peut devenir difficile à coudre. De plus, si les sections sont compressées ou déformées de manière variable pendant la découpe, les piles de données résultantes deviennent presque impossibles à aligner. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2: Le flux de travail pour la génération directe des tableaux de sections sur un support de grande taille. ( A ) Pourunrognage serré à l’aide de l’outil de coupe, les blocs sont fixés à l’intérieur du support du microtome. Cette étape permet d’assurer les côtés parallèles d’un bloc et réduit également la résine vide autour de l’échantillon. (B) Un couteau modifié pour les acquisitions de sections AT. Un grand bateau facilite le transfert des sections et leur manipulation lors du sectionnement et du transfert des échantillons sur le support. Un grand bassin permet la manipulation des sections; le système de vidange limite le mouvement des rubans pendant l’étape de vidange, le fond plat rend le séchage progressif du support fiable. (C) Le couteau, prêt à être sectionné avec une plaquette à décharge incandescente placée au fond du bassin et de l’eau nivelée sur les bords. La construction du couteau maintient l’aiguille incrustée, sans interférer avec le support. (D) Génération de matrice, vue de dessus sur la zone de sectionnement du microtome. (i) Les premières sections sont généralement faciles à obtenir car elles collent les unes aux autres et forment un ruban régulier. (ii) Lorsque d’autres sections sont ajoutées au ruban et qu’il s’allonge, celui-ci perd sa stabilité et se courbe fréquemment. Il est crucial de garder les pistes de séquence organisées en séquence en préparation de l’étape d’acquisition d’image. (iii) Lorsqu’un ruban de sections atteint la longueur souhaitée, il est soigneusement détaché du bord du couteau à l’aide d’un cil. iv) L’eau est évacuée du bassin; la plaquette reste à l’intérieur jusqu’à ce qu’elle soit entièrement sèche à l’air. Cette étape est essentielle, car elle permet de redresser les sections et d’éviter la formation des micro plis. La plaquette est placée dans le four à 60°C pendant au moins 30 min pour fixer les sections sur le support. (E) Exemples de plaquettes avec les sections transférées. Bien qu’il soit pratique d’obtenir des rubans droits et précis, les échantillons réels empêchent la formation de tels rubans idéaux dans la plupart des cas. Néanmoins, même les rubans « bâclés » sont très instructifs pour le grand nombre de cas, et l’importance du ruban « soigné » dépendra d’une stratégie de recherche pour laquelle les sections sont collectées. Barre d’échelle 1 cm. (F) Exemple de grilles d’emplacement avec les sections série. Même lorsque de nombreuses sections sont rassemblées sur une seule grille, il ne s’agit toujours que d’une infime fraction de ce qui peut être collecté sur une seule plaquette. Les compétences requises pour maîtriser le transfert des sections sur une grille (grille à fentes en particulier) représentaient un goulot d’étranglement important pour la maîtrise de la préparation des échantillons en microscopie électronique. Barre d’échelle 500 μm. (G) Quelle que soit la méthode de collecte de section utilisée, les points forts de l’approche AT sont la facilité relative de génération de sections séquentielles, par rapport à la collecte sur grille. Si un bloc d’échantillon de 1000 μm x 500 μm est envisagé, il n’y a aucun problème à installer environ 100 sections sur une tranche de 2 cm x 4 cm (i). Les sections de même taille sur une grille d’emplacements ne s’adapteront qu’à trois sections/grille au maximum (ii). Nous fournissons une image à l’échelle pour montrer combien de grilles peuvent être nécessaires pour couvrir le même nombre de sections, sans mentionner la difficulté de collecter des sections en série sur la grille. Barre d’échelle = 1 cm. Veuillez cliquer ici pour agrandir cette figure.

Figure 3: Étapes critiques du flux de travail array Tomography. Schéma du flux de travail pour l’acquisition sans surveillance de piles d’images haute résolution. Toutes les étapes préparatoires sont automatisées (symboles d’engrenages verts) et ne nécessitent aucune action à effectuer manuellement, section par section. Les piles d’images peuvent être alignées dans n’importe quel logiciel d’analyse d’images capable d’un alignement automatique rigide ou affine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4: Trois scénarios d’acquisition avec l’intestin adulte de la drosophile comme modèle de démonstration. (Un) dessin d’un intestin moyen disséqué de la drosophile, avec trois régions principales désignées par des couleurs différentes: antérieure, moyenne et postérieure. (B) Bloc plat taillé dans lequel un boyau est orienté pour la section transversale. Notez que la quantité de résine vide est soigneusement équilibrée autour du tissu contenant la région d’intérêt (rectangle blanc). (C) Des sections transversales en série flottent à la surface de l’eau à l’intérieur du bassin du couteau AT. Toutes les images ont été acquises en mode SEM d’électrons secondaires à l’aide du détecteur de miroir avec le contraste inverse. (D) Image en mosaïque cousue de sections transversales en série sur une plaquette. La barre d’échelle est de 1000 μm. (E) Section transversale à travers l’intestin de la drosophile. Barre d’échelle 20 μm. L’image est une mosaïque cousue de 7 x 7 images de milieu de gamme. Encarts - images à grossissement et à résolution plus élevées des régions spécifiques d’intérêt: (ii) noyau, (iii) bordure de brosse et (i) mitochondries. Barre d’échelle 5 μm pour tous. (F) Image de milieu de gamme d’une section transversale à travers l’intestin qui cible l’emplacement des cellules en développement (carré). La barre d’échelle est de 20 μm. (G) Le tableau ciblé de sections série collectées en fonction de la zone localisée lors de l’analyse de la section présente dans le panneau F. La barre d’échelle est de 10 μm. (H) Le modèle 3D est rendu sur la base de la séquence de pile de 50 sections obtenue à partir de l’acquisition en série ciblée dans le panneau G. Veuillez cliquer ici pour afficher une version plus grande de cette figure.

Figure 5: Études de cas pour les scénarios d’application de l’AT. (A) Localisation de différentes structures cellulaires dans l’organoïde intestinal. i) Micropuce de silicium intégrée. Barre d’échelle = 200 μm. (ii) Image en mosaïque cousue de 127 sections transversales à travers la partie centrale de la puce. Barre d’échelle = 1500 μm (iii) Quatre images basse résolution d’une section transversale complète à travers la partie de l’organoïde intestinal. Les flèches pointent vers le site potentiel d’intérêt. La barre d’échelle est de 20 μm. (iv) Différents retours sur investissement, ciblés sur des micrographies à basse résolution sélectionnées pour une analyse plus approfondie. Barre d’échelle = 10 μm. (v) Image haute résolution de la cellule infectée d’intérêt. L’analyse de la même région dans les sections adjacentes peut fournir des informations 3D ciblées si nécessaire. Barre d’échelle = 5 μm. (B) Localisation du milieu du corps chez Drosophila melanogaster pupal notum. i) Vue schématique d’une nymphe drosophile disséquée. Notum exposé pour la dissection (beige) après avoir enlevé la partie de la cuticule protectrice (marron). La ligne noire désigne la direction de la section (ii) Une coupe transversale à travers la zone présentée dans le diagramme. L’image combine des images SEM haute résolution prises séquentiellement 3x7 sur un panneau de mosaïque. Le rectangle noir délimite la zone qui contient une cellule de division. La barre d’échelle est de 15 μm. (iii) Image agrandie sur la cellule de séparation à partir du panneau ii. À ce grossissement et à cette résolution, le milieu du corps est évident (flèches blanches). Toute la section est analysée pour trouver les cellules en division. Sauter entre différents rubans de sections par intervalles de 20 à 30 sections pendant l’étape de criblage latéral permet de localiser de nombreuses paires de cellules en division. La barre d’échelle est de 5 μm (iv) lorsqu’une cellule en division est localisée, des images séquentielles du milieu du corps recueillies à partir de quatre sections autour du milieu du corps délimitées par un carré jaune dans le panneau (iii). La barre d’échelle est de 1 μm. (C) Localisation des pieds finaux de Tanycytes dans l’hypothalamus de la souris. i) Image de fluorescence d’une tranche de vibratome. Les tanycytes expriment la protéine fluorescente tdTomato (rouge). Un rectangle blanc délimite la zone d’intérêt. Barre d’échelle 500 μm. (ii) La même section de vibratome préparée pour EM sera soigneusement taillée autour de la zone d’intérêt - en fonction de la corrélation indirecte des informations fluorescentes du panneau (i). La ligne blanche pointillée représente la zone de sectionnement ultramince. La barre d’échelle est de 50 μm pour les deux panneaux. iii) Coupe transversale à travers la tranche de vibratome dans la zone d’intérêt. L’image mosaïque SEM est composée de 75 images cousues. Plusieurs sections sont ciblées par criblage latéral et imagées avec des paramètres similaires. Les sections sont analysées « hors ligne » afin de trouver le retour sur investissement - les pieds finaux de tanycyte. Le rectangle noir représente la zone qui contient les pieds de tanycyte. Cette section servira d’ancrage pour une analyse plus approfondie. La barre d’échelle est de 15 μm. (iv) Image haute résolution et à fort grossissement des pieds d’extrémité de tanycyte entourant un vaisseau sanguin. Après la localisation initiale du retour sur investissement sur une section, la séquence z est collectée à partir des sections adjacentes en amont de la section d’ancrage (panneau iii). Barre d’échelle 5 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Figure 6: Les problèmes lors de l’ultra-microtomie, de la collecte des sections et du stockage des sections peuvent conduire à des artefacts. (A) Sections d’échantillons de cerveau sur une plaquette. La majeure partie de la résine vide s’est détachée du tissu et s’est repliée sur elle-même (sépia). La boîte noire en pointillés désigne une zone utilisée pour contenir la section entière. Barre d’échelle 500 μm. (B) Petit pli local à la surface d’une section de poisson-zèbre de 50 nm d’épaisseur. Barre d’échelle 1 μm. (C) Marque de couteau sur la surface d’une section de cerveau de souris de 70 nm. Barre d’échelle 5 μm. (D) Les cheveux (astérisque) à la surface de la plaquette qui recouvrent partiellement une section musculaire de poisson zèbre. En jaune, le tissu est ciblé pour l’analyse. En rose, une cellule servait de référence pour la taille de la zone touchée. Barre d’échelle 50 μm. (E) Notochorde de poisson zèbre avec des rides en bas à droite (flèches noires), où le tissu neural dense (ombragé en bleu) borde le tissu musculaire plus mou et la résine vide (flèches noires). Barre d’échelle 10 μm. (F) Segmentation du volume d’une pile de 50 images comme dans E, montrant que cette région présentait des rides dans la plupart des sections. Le polygone en pointillés dessine la zone indiquée dans la barre d’échelle G. 10 μm. (G) Vue XY de la même segmentation de volume que dans F, montrant les rides sous forme de courts traits noirs dans la moitié droite du bloc. Notez que l’alignement de la pile dans les parties restantes du tissu n’est pas affecté par les rides. Barre d’échelle 5 μm. (H) Projection XZ de la même zone qu’en G, montrant les rides dans les 50 sections. Barre d’échelle 5 μm. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.

Film supplémentaire 1: Une image de montage haute résolution d’une coupe transversale à travers l’intestin moyen antérieur de la drosophile. Image mosaïque d’une image SEM SE-MD inversée. 352 tuiles d’image distinctes ont été automatiquement acquises à une résolution de 5 nm et assemblées pour présenter toute la section. Il est possible de zoomer pour plus de détails et d’obtenir une couverture exhaustive des données, en utilisant la même image. Des jonctions serrées, des microtubuli, différents types de vésicules peuvent être lors du zoom avant. La barre d’échelle est de 10 μm. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Film supplémentaire 2: Rendu des cellules intestinales de la drosophile. Cinquante images en mosaïque alignées des sections dans la zone de division des cellules intestinales. Rendu IMOD des bordures cellulaires (bleu, turquoise et orange) et des noyaux (blanc). Veuillez cliquer ici pour télécharger ce film.

Documents supplémentaires. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier. 

Discussion

La microscopie électronique donne un aperçu de l’ultrastructure des cellules et des organismes, pour laquelle il est souvent souhaitable d’imager des structures d’intérêt dans leur contexte en 3 dimensions. Malgré de nombreuses tactiques EM pour l’analyse ultrastructurale, il n’existe toujours pas de solution « de référence ». La raison principale est la grande variété d’échantillons, de nombreuses questions biologiques, qui nécessitent souvent une approche sur mesure. Le flux de travail AT proposé est conçu pour minimiser le temps nécessaire au traitement des échantillons, à l’acquisition des données, à l’évaluation et au stockage. De plus, le couteau modifié fournit un outil utile pour simplifier l’acquisition de matrices. La disposition compacte des sections sur les plaquettes est pratique, à la fois pour l’observation et le stockage ultérieur des échantillons. Cette disposition permet le « criblage latéral » des échantillons en se déplaçant horizontalement d’un ruban à l’autre et en ne scannant qu’une seule section sur chacun, ce qui réduit considérablement le temps nécessaire pour localiser un retour sur investissement. Les scénarios d’acquisition de données proposés facilitent le ciblage de zones petites et réparties de manière aléatoire. Une fois trouvé, AT/SEM limite précisément l’imagerie haute résolution au volume d’intérêt, qu’elle soit effectuée manuellement ou à l’aide d’une fonction automatique. AT pour les volumes limités peut être complété manuellement, l’opérateur naviguant dans l’échantillon et définissant les régions d’imagerie une par une. Le module automatisé du logiciel fournit une stratégie d’acquisition d’images flexible pour l’imagerie de petites zones sur de grandes sections. L’automatisation de ce logiciel permet d’enregistrer de grandes images haute résolution sur des centaines de sections, obtenant des volumes similaires à SBFI. L’enregistrement d’images de vue d’ensemble de toutes les sections simplifie la localisation du retour sur investissement et réduit le temps passé au microscope. Étant donné que les sections ne sont pas endommagées lors de l’enregistrement des aperçus et des aperçus de résolution supérieure, AT/SEM permet de réutiliser l’échantillon pour collecter d’autres données d’autres rois ou à une résolution plus élevée.

Le temps d’acquisition d’images est l’un des aspects les plus importants (et les plus coûteux) de 3D EM et doit donc être pris en compte dans la conception de l’expérience. S’il n’est pas surprenant que l’imagerie de grandes zones prenne plus de temps que l’imagerie de petites zones, il est facile de sous-estimer l’impact : selon les paramètres d’imagerie sélectionnés, le temps d’acquisition sur chaque section peut varier de quelques secondes à quelques heures. Les paramètres d’imagerie critiques incluent la taille du champ de vision, la résolution et le temps de séjour. En supposant une résolution cible de 10 nm par pixel et un temps de séjour de 1 μs, l’imagerie d’un champ de 20 μm x 20 μm, 100 μm x100 μm ou 500 μm x500 μm prend 4 secondes, 100 secondes ou 2 500 s à enregistrer. Nous pouvons multiplier ces temps d’imagerie par section par le nombre de sections pour estimer le temps nécessaire pour le travail d’imagerie complet. De longs temps d’imagerie par section peuvent être acceptables si le nombre de sections est faible ou si le temps d’outil du microscope n’est pas préoccupant.

Cependant, il est nécessaire de limiter le temps d’enregistrement à un travail de nuit ou à un travail de week-end dans la plupart des cas. Un aspect tout aussi critique de 3D EM qui devrait être pris en compte est la quantité et la structure des données d’image résultantes. L’enregistrement des champs d’imagerie susmentionnés dans 100 sections génère respectivement 400 Mo, 10 Go ou 250 Go de données d’image; les images de 500 μm x 500 μm posent le problème supplémentaire d’être plus grandes que 2 Go chacune. De nombreux logiciels utilisés pour l’évaluation des données ne peuvent pas ouvrir des images de cette taille.

Pour réduire le temps d’imagerie, il est important de choisir le temps d’arrêt des pixels pour répondre aux exigences de rapport signal/bruit pour l’évaluation ultérieure des données (par exemple, reconstruction, traçage) et de limiter les enregistrements à des retours sur investissement définis. L’extension AT du logiciel facilite l’acquisition d’images dans de petites zones dans les sections série. Le logiciel prend en charge les flux de travail manuels et automatiques et de nombreuses variantes semi-automatiques: les zones d’imagerie peuvent être positionnées manuellement et concentrées sur chaque section, ou l’utilisateur peut utiliser les fonctions de recherche automatique de section et d’alignement de position. Selon le niveau d’automatisation choisi et pris en charge par le type d’échantillon ou les objectifs d’imagerie, le temps nécessaire à la configuration de l’acquisition d’images dans des centaines de sections peut prendre une journée de travail entière (effectuée manuellement) ou seulement quelques minutes. En principe, la tomographie par réseau rend plus difficile que les autres méthodes 3D EM d’acquérir de petits retours sur investissement; le placement imprécis d’une région sur des sections consécutives doit être compensé par l’acquisition de zones plus grandes. Par exemple, si le retour sur investissement est de 20 μm x 20 μm et que la variabilité de position section à section des champs d’imagerie est de 10 μm, il faut acquérir des images de 40 μm x 40 μm afin de s’assurer que le retour sur investissement est entièrement capturé dans chaque image, sur chaque section. La variabilité de la position de l’image dans le monde réel varie de 100 μm à < 10 μm en fonction de la disponibilité ou de la qualité des fonctionnalités logicielles pour l’alignement de position ou de la patience de l’utilisateur. Avec ce logiciel, 10 μm peuvent être atteints sans trop d’intervention manuelle dans la plupart des échantillons.

Comme toute technique, l’AT a plusieurs points faibles qui peuvent influencer l’acquisition de données réussie, et beaucoup sont similaires à d’autres méthodes basées sur le sectionnement. Le manque de distribution homogène de la résine vide par rapport au tissu peut entraîner des réseaux incurvés ou brisés. Dans les cas extrêmes, les sections peuvent se détacher du support (Figure 6A). Une compression ou un étirement variable pendant le processus de coupe peut créer des plis qui peuvent perturber l’échantillon dans des régions variables sur les sections suivantes (Figure 6B). Des marques de couteau peuvent apparaître à la surface des sections collectées à l’aide d’un couteau endommagé (Figure 6C). Les différences dans les conditions de sectionnement peuvent induire une compression occasionnelle de la section et des différences d’épaisseur. Des particules de poussière ou de saleté peuvent atterrir sur une section et obscurcir partiellement la zone d’intérêt(Figure 6D). L’acquisition d’images peut échouer en raison de fonctions imparfaites d’auto-contraste, de mise au point automatique et d’auto-stigmate. Le positionnement des zones d’imagerie créées automatiquement peut être variable et peut ne pas capturer le retour sur investissement dans toutes les sections.

Plusieurs problèmes peuvent survenir au stade de la couture et de l’alignement. L’assemblage automatique des acquisitions de carreaux de mosaïque peut échouer, par exemple, en raison du grand espace vide à l’intérieur de l’échantillon. En raison d’un changement radical de forme en 3D, les piles d’images peuvent être difficiles à enregistrer. Des programmes spécialement développés (par exemple, IMOD, Fiji, TrackEM2, MIB ou MAPS-AT) peuvent faciliter l’alignement semi-automatique^32,38,39,40. Les sections les plus difficiles peuvent être alignées manuellement à l’aide d’un logiciel de retouche photo. Malheureusement, certains jeux de données peuvent être impossibles à aligner correctement.

Les grands échantillons sont difficiles pour les sections série TEM qui s’adaptent aux grilles; d’autre part, de nombreux projets ne justifient pas une acquisition automatique longue en utilisant FIB/SEM ou SBF-SEM. L’AT est une alternative simple à une section série fastidieuse TEM où la collecte et la manipulation de sections série sur une plaquette sont plus simples qu’avec les grilles de fentes. Plusieurs stratégies ont été développées pour faciliter la collecte des tableaux, et nous partageons notre méthode pour élargir la boîte à outils existante. Dans les cas où l’identification du retour sur investissement est difficile, AT-SEM offre un avantage fondamental, avec le criblage efficace des échantillons où une résolution à l’échelle de l’organite sur 50 à 500 sections est requise. Pour les volumes plus importants, les stratégies AT de collecte automatique peuvent être collectées efficacement si davantage de sections sont nécessaires. Les échantillons AT peuvent être ré-imagés plusieurs fois, ce qui facilite l’imagerie ciblée des zones haute résolution sur la base d’images de synthèse précédemment acquises. Nous pensons que l’analyse ciblée et le suréchantillonnage réduit par AT/SEM proposés ici diminuent les besoins en main-d’œuvre et en stockage de données. En fin de compte, les bibliothèques de sections peuvent être collectées et entretenues pour une réutilisation et une consultation ultérieures. Pour l’acquisition de volume, les approches FIB ou SBF-SEM offrent une excellente solution chaque fois que le retour sur investissement est facile à identifier sur la face du bloc ou si de grands volumes 3D sont nécessaires pour l’analyse. Cependant, les FIB/SBF-SEM sont moins efficaces lorsque l’image de pile haute résolution doit être collectée à partir d’un retour sur investissement défini de manière ciblée. Pour conclure, les méthodes proposées pour le criblage des échantillons AT et l’utilisation d’images de synthèse à moyenne résolution permettent de limiter l’acquisition d’images aux parties pertinentes du tableau de sections. La visée précise des régions d’imagerie accélère le délai de génération des données et simplifie l’évaluation des données.

En résumé, bien que le concept d’AT/SEM ne soit pas nouveau, son utilisation n’est toujours pas aussi répandue que ses mérites le suggèrent. Dans l’ensemble, il fournit une procédure complémentaire aux autres méthodes EM existantes. AT/SEM est compatible avec la plus large gamme de protocoles de préparation d’échantillons et de flux de travail d’imagerie et peut être effectué sur n’importe quel microscope FIB/SEM ou SBF-SEM comme technique d’accompagnement. Dans cet article, nous nous sommes concentrés sur l’AT pour enregistrer des données ultrastructurales à partir d’échantillons qui sont moins susceptibles d’être traités avec succès par d’autres méthodes. Nous espérons que la procédure décrite pour une collecte pratique des sections et des stratégies d’acquisition considérablement automatisées aidera dans les premières tentatives pour ceux qui n’ont jamais rencontré la méthode et aidera à la perfectionner pour ceux qui ont déjà une certaine expérience.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cutting
AT Couteau à tronçonner	Diatome	DUATS3530	Diatome Couteau Jumbo
Couteau diamanté pour tailler 90° ;	Diatome	DTB90	Ébavurage des diatomées 20° ; Couteau en verre
Adhésif de contact Pattex	Pattex	PCL3C
Plaquette de silicium	Ted Pella	16015	Résistance : 1-30 Ohms Type P : (Bore) (1 plat primaire) Rugosité : 2 nm Pas de revêtement de finition SiO2 TTV : = < 20 et micro ; m Wafer est poli sur une face
Ultramicrotome	Leica UC6		Leica UC7
	EMS	7642	EMF, Small Sample Cleaver, CatNo. 7652
Image acquisition
FESEM	Thermo Fischer Helios	1072419	Alternatives : Zeiss, Jeol, Hitachi, TESCAN
Maps 3 pour SEM avec flux de travail corrélatif & Thermo	Fisher Scientific	1135932	Maps permet d’automatiser les flux de travail d’imagerie MEB et d’importer des données tierces pour CLEM et la navigation.
Image analysis
Amira x.y	Thermo Fisher Scientific	1131599	Amira est un logiciel de visualisation et d’analyse de données 3D doté de plusieurs fonctions pratiques pour la reconstruction de données de tomographie matricielle.
Traitement d’images	Open source	Fiji (http://fiji.sc/#download)	IMOD, MIB (Voir le texte pour les références)