Étude de la dynamique des protéines par spectroscopie d’écho de spin neutronique

Résumé

Le présent protocole décrit des méthodes pour étudier la structure et la dynamique de deux protéines modèles qui jouent un rôle important dans la santé humaine. La technique combine la caractérisation biophysique de paillasse avec la spectroscopie d’écho de spin neutronique pour accéder à la dynamique aux échelles de temps et de longueur pertinentes pour les mouvements interdomaines des protéines.

Résumé

L’activité et la fonctionnalité de la plupart des protéines du corps humain sont liées à des changements de configuration de sous-domaines entiers au sein de la structure cristalline de la protéine. Les structures cristallines constituent la base de tout calcul qui décrit la structure ou la dynamique d’une protéine, la plupart du temps avec de fortes restrictions géométriques. Cependant, ces restrictions de la structure cristalline ne sont pas présentes dans la solution. La structure des protéines dans la solution peut différer de celle du cristal en raison de réarrangements de boucles ou de sous-domaines sur l’échelle de temps pico à nanoseconde (c’est-à-dire le régime temporel de la dynamique interne des protéines). Le présent travail décrit comment les ralentis sur des échelles de temps de plusieurs dizaines de nanosecondes peuvent être accessibles en utilisant la diffusion des neutrons. En particulier, la caractérisation dynamique de deux protéines humaines majeures, une protéine intrinsèquement désordonnée qui n’a pas de structure secondaire bien définie et une protéine d’anticorps classique, est traitée par spectroscopie d’écho de spin neutronique (NSE) combinée à un large éventail de méthodes de caractérisation en laboratoire. D’autres connaissances sur la dynamique du domaine protéique ont été obtenues à l’aide de la modélisation mathématique pour décrire les données expérimentales sur les neutrons et déterminer le croisement entre les mouvements diffusifs et internes combinés des protéines. L’extraction de la contribution dynamique interne à la fonction de diffusion intermédiaire obtenue à partir de NSE, y compris l’échelle de temps des différents mouvements, permet une vision plus approfondie des propriétés mécaniques des protéines uniques et de la douceur des protéines dans leur environnement presque naturel dans la solution protéique encombrée.

Introduction

Dynamique de sondage de la matière molle avec des neutrons
L’étude des propriétés dynamiques des protéines et des peptides est une partie importante de la recherche biophysique, et de nombreuses méthodes bien développées existent aujourd’hui pour accéder à un large éventail de paysages énergétiques¹. Relier la dynamique révélée expérimentalement des protéines à leur fonction biologique est une tâche beaucoup plus difficile, nécessitant des modèles mathématiques complexes et des simulations dynamiques assistées par ordinateur. L’importance de la spectroscopie neutronique pour l’analyse des mouvements des protéines a été souli....

Protocole

Les présents travaux caractérisent deux protéines : une protéine d’anticorps humains IgG régulière et le MBP intrinsèquement désordonné. La forme lyophilisée des protéines a été obtenue à partir de sources commerciales (voir tableau des matériaux).

1. Préparation d’échantillons de protéines

1. Préparer un tampon de phosphate de sodium de 50 mM + 0,1 M de NaCl en pesant et en dissolvant les réactifs solides respectifs dans de l’eau lourde (D₂O) (voir tableau des matériaux). Il s’agit du solvant tampon deutéré pour les IgG.
   1. Ajuster le pH de la solution tampon à 6,6.<....

Résultats

Les protéines IgG du sérum humain et des protéines MBP bovines ont été reconstituées à des concentrations élevées (~50 mg/mL) dans des tampons D₂O-base. Comme les protéines ont été dissoutes à des concentrations élevées, les solutions obtenues étaient des solutions protéiques encombrées. Les dynamiques étudiées à l’aide de NSE souffrent de l’environnement surpeuplé dans lequel résident les protéines (interactions des facteurs de structure et effets hydrodynamiques)

Discussion

La spectroscopie NSE fournit une vue unique et détaillée de la dynamique des protéines, que d’autres techniques spectroscopiques ne peuvent pas produire. Les mesures sur une longue échelle de temps fournissent des observations de la diffusion translationnelle et rotationnelle des protéines, comme présenté ici. La dynamique segmentaire et d’autres oscillations internes se révèlent comme une forte désintégration de la fonction de diffusion cohérente S(Q, t) à une courte échelle de temps et sont bien séparées des p.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution protéique MBP bovine	Sigma-Aldrich	M1891	poudre lyophilisée reconstituée en  ; D2O
D2O - eau lourde	Sigma-Aldrich	N° de produit 151882	liquide
Eau dionisée	dans la maison	-	pour cellules de lavage / nettoyage
Instrument DLS	Zetasizer Nano ZS, FZ-Jü ;	Instrument de diffusion dynamique de la lumière	lich-dynamic
Étalons de diffusion élastique	SNS-NSE, ORNL-Al		2O3  ; et Poudres de graphite
Éthanol	Sigma-Aldrich	65350-M	Éthanol à 70 % pour le nettoyage des cellules
Solution protéique IgG	Sigma-Aldrich	I4506	poudre lyophilisée reconstituée dans  ; D2O
KWS-2	Instrument JCNS à la MLZ,  ; Garching,	Allemagne-Instrument	à neutrons à petit angle
Liquinox Détergent à vaisselle	Alconox-Nettoyant		liquide pour verrerie de laboratoire sans phosphate
Na2HPO4· ; 7H2O	Sigma-Aldrich	N° de produit S9390	phosphate disodique sel heptahydraté
NaCl	Sigma-Aldrich	N° de produit S9888 Sel	chlorure de sodium
NaH2PO4· ; H2O	Sigma-Aldrich	N° de produit S9638	phosphate monosodique sel monohydraté
Spectrophotomètre Nanodrop Thermo	Scientific	Numéro de catalogue :  ; ND-2000	NanoDrop 2000/2000c Spectrophotomètre
Caméra d’alignement de neutrons	NeutronOptics, Grenoble	NOG210222	Caméra 100 x 100 mm avec capteur CMOS Sony IMX249
Parafilm M - parafilm de cire	Bemis	Parafilm M - 5259-04LC PM996	film de laboratoire polyvalent dans un distributeur en carton
Spectromètre Phoenix-J-NSE Station	JCNS à la MLZ,  ; Garching,	Allemagne-Spectromètre à	neutrons
SasView	https://www.sasview.org/
SAXSpace, instrument Anton Paar	FZ-Jü ;	Instrument à rayons X	lich-small
Slide-A-Lyzer Membranes de dialyse	Thermo Scientific	88400-88405	Mini appareils de dialyse Slide-A-Lyzer tubes de 3,5 K MWCO
SNS Cluster d’analyse à distance	Neutron Science Analyse à distance (sns.gov)	https://analysis.sns.gov
Spectromètre SNS-NSE	ORNL, Oak Ridge, TN, USAspectromètre		neutrons
Filtres à seringue stériles	VWR	N.A. PN :28145-501	0.2 & micro ; m filtres de taille de pores
Système de forçage de température (TFS)	SP Scientific	Numéro de pièce 100004055	équipement d’environnement d’échantillon
Urée -d4	Sigma-Aldrich	N° de produit 176087	Sel d’urée deutéré
Viscosimètre	FZ-Jü ;		viscosimètre à bille tombante de liche

de angle à