Article de méthode

Fabrication de réseaux de microtissus cardiaques 3D à l’aide de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales dérivés de l’iPSC humain

DOI :

10.3791/61879

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14 mars 2021

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1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Department of Medicine, Division of Cardiovascular Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous décrivons ici une méthodologie facile à utiliser pour générer des réseaux de microtissus cardiaques auto-assemblés en 3D composés de cardiomyocytes, de fibroblastes cardiaques et de cellules endothéliales prédé différenciés dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme. Cette technique conviviale et nécessitant des cellules basses pour générer des microtissus cardiaques peut être mise en œuvre pour la modélisation de la maladie et les premiers stades du développement de médicaments.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La génération de cardiomyocytes humains (CM), de fibroblastes cardiaques (FC) et de cellules endothéliales (CE) à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi) a fourni une occasion unique d’étudier l’interaction complexe entre différents types de cellules cardiovasculaires qui stimulent le développement tissulaire et la maladie. Dans le domaine des modèles de tissus cardiaques, plusieurs approches tridimensionnelles (3D) sophistiquées utilisent des cardiomyocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites (iPSC-CM) pour imiter la pertinence physiologique et l’environnement tissulaire natif avec une combinaison de matrices extracellulaires et de réticulants. Cependant, ces systèmes sont complexes à fabriquer sans expertise en microfabrication et nécessitent plusieurs semaines pour s’auto-assembler. Plus important encore, beaucoup de ces systèmes manquent de cellules vasculaires et de fibroblastes cardiaques qui représentent plus de 60% des non-myocytes dans le cœur humain. Nous décrivons ici la dérivation des trois types de cellules cardiaques à partir des CSPi pour fabriquer des microtissus cardiaques. Cette technique de moulage de réplique facile permet la culture de microtissus cardiaques dans des plaques de culture cellulaire multi-puits standard pendant plusieurs semaines. La plate-forme permet un contrôle défini par l’utilisateur sur la taille des microtissus en fonction de la densité d’ensemencement initiale et nécessite moins de 3 jours pour l’auto-assemblage afin d’obtenir des contractions observables du microtissu cardiaque. En outre, les microtissus cardiaques peuvent être facilement digérés tout en maintenant une viabilité cellulaire élevée pour l’interrogation unicellulaire grâce à l’utilisation de la cytométrie en flux et du séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNA-seq). Nous envisageons que ce modèle in vitro de microtissus cardiaques aidera à accélérer les études de validation dans la découverte de médicaments et la modélisation de la maladie.

Introduction

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La découverte de médicaments et la modélisation des maladies dans le domaine de la recherche cardiovasculaire sont confrontées à plusieurs défis en raison d’un manque d’échantillons cliniquement pertinents et d’outils translationnels inadéquats1. Les modèles précliniques très complexes ou les modèles unicellulaires in vitro trop simplifiés ne présentent pas de conditions physiopathologiques reproductibles. Par conséquent, plusieurs plates-formes miniaturisées d’ingénierie tissulaire ont évolué pour aider à combler l’écart, dans le but d’atteindre un équilibre entre la facilité d’application à haut débit et la récapitulation fidèle de la fonction tissulaire2,3. Avec l’avènement de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi), les outils d’ingénierie tissulaire peuvent être appliqués à des cellules spécifiques au patient avec ou sans état de maladie cardiovasculaire sous-jacent pour répondre aux questions de recherche4,5,6. De tels modèles d’ingénierie tissulaire avec une composition cellulaire similaire au tissu cardiaque pourraient être utilisés dans les efforts de développement de médicaments pour tester la cardiotoxicité et le dysfonctionnement induits par des changements pathologiques dans le comportement d’un ou de plusieurs types de cellules.

Les microtissus ou organoïdes auto-assemblés dérivés d’iPSC humains sont des structures tridimensionnelles (3D) qui sont des assemblages miniatures ressemblant à des tissus présentant des similitudes fonctionnelles avec leurs homologues in vivo . Il existe plusieurs approches différentes qui permettent la formation d’organoïdes in situ via la différenciation dirigée des CSPi ou par la formation de corps embryoïdes4. Les organoïdes qui en résultent sont un outil indispensable pour étudier les processus morphogénétiques qui conduisent l’organogenèse. Cependant, la présence d’une variété de populations cellulaires et les différences d’auto-organisation peuvent entraîner une variabilité des résultats entre différents organoïdes5. Alternativement, les cellules prédé différenciées qui sont auto-assemblées en microtissus avec des types de cellules spécifiques aux tissus pour étudier les interactions cellules-cellules locales sont d’excellents modèles, où il est possible d’isoler les composants auto-assemblés. En particulier dans la recherche cardiaque humaine, le développement de microtissus cardiaques 3D avec des composants multicellulaires s’est avéré difficile lorsque les cellules sont dérivées de différentes lignées de patients ou de sources commerciales.

Pour améliorer notre compréhension mécaniste des comportements cellulaires dans un modèle in vitro physiologiquement pertinent et personnalisé, idéalement, tous les types de cellules constitutives devraient être dérivés de la même lignée de patients. Dans le contexte d’un cœur humain, un modèle cardiaque in vitro vraiment représentatif capturerait la diaphonie entre les types de cellules prédominants, à savoir les cardiomyocytes (CM), les cellules endothéliales (CE) et les fibroblastes cardiaques (FC)6,7. La récapitulation fidèle d’un myocarde nécessite non seulement un étirement biophysique et une stimulation électrophysiologique, mais également une signalisation cellule-cellule qui découle de types cellulaires de soutien tels que les CE et les CF8. Les FC sont impliqués dans la synthèse de la matrice extracellulaire et le maintien de la structure tissulaire; et dans un état pathologique, les FC peuvent induire une fibrose et altérer la conduction électrique dans les CMs9. De même, les CE peuvent réguler les propriétés contractiles des CM par la signalisation paracrine et l’approvisionnement en demandes métaboliques vitales10. Par conséquent, il est nécessaire que des microtissus cardiaques humains composés des trois principaux types de cellules permettent de mener des expériences à haut débit physiologiquement pertinentes.

Ici, nous décrivons une approche ascendante dans la fabrication de microtissus cardiaques par dérivation de cardiomyocytes humains dérivés de l’iPSC (iPSC-CM), de cellules endothéliales dérivées de l’iPSC (iPSC-EC) et de fibroblastes cardiaques dérivés de l’iPSC (iPSC-CFs) et leur culture 3D dans des réseaux de microtissus cardiaques uniformes. Cette méthode facile de génération de microtissus cardiaques spontanés peut être utilisée pour la modélisation de la maladie et le test rapide de médicaments pour la compréhension fonctionnelle et mécaniste de la physiologie cardiaque. En outre, de telles plateformes de microtissus cardiaque multicellulaires pourraient être exploitées avec des techniques d’édition du génome pour émuler la progression de la maladie cardiaque au fil du temps dans des conditions de culture chroniques ou aiguës.

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Protocole

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1. Préparation du milieu, du réactif, de la plaque de culture

  1. Solution de lavage cellulaire pour la culture cellulaire: Utilisez 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou une solution saline équilibrée hanks (HBSS) sans calcium ni magnésium.
  2. Milieux de différenciation cardiomyocytaire
    1. Préparer le milieu de différenciation #1 en ajoutant un supplément de 10 mL (50x B27 plus insuline) à 500 mL de milieu basal cardiomyocytaire (RPMI 1640).
    2. Préparer le milieu de différenciation #2 en ajoutant un supplément de 10 mL (50x B27 moins insuline) à 500 mL de milieu basal cardiomyocytaire (RPMI 1640).
    3. Préparer le milieu de purification #3 en ajoutant un supplément (50x B27 plus insuline) à 500 mL de milieu basal cardiomyocytaire (RPMI 1640) moins le glucose.
  3. Milieux de croissance endothéliaux et réactifs de tri cellulaire activé magnétiquement (MACS)
    1. Préparez le milieu de croissance endothélial (EGM) avec le kit de supplément de milieu de croissance des cellules endothéliales disponible dans le commerce.
    2. Préparer la solution tampon de tri de séparation cellulaire en diluant la solution mère d’albumine sérique bovine (BSA) à 1:20 avec une solution de rinçage.
  4. Milieu de différenciation des fibroblastes cardiaques: Préparez le milieu de différenciation des fibroblastes cardiaques avec le milieu basal des fibroblastes (DMEM-glucose élevé) et le kit Serum-Free Fibroblast Life Factors.
  5. Milieu de fabrication et d’entretien du microtissu cardiaque : Préparer le milieu filtré avec le milieu basal cardiomyocytaire (RPMI 1640) avec supplément (50x B27 plus insuline) et EGM dans un rapport de 70/30 v/v%.
  6. Solutions de petites molécules et de facteurs de croissance
    1. Pour la différenciation des trois types de cellules, préparer 200 μL aliquotes de l’inhibiteur GSK3-bêta CHIR 99021 (6-[[2-[[4-(2,4-Dichlorophényl)-5-(5-méthyl-1H-imidazol-2-yl)-2-pyrimidinyl]amino]éthyl]amino]-3-pyridinecarbonitrile); Inhibiteur de Wnt IWR-1-endo (4-(1,3,3a,4,7,7a-Hexahydro-1,3-dioxo-4,7-methano-2H-isoindol-2-yl)-N-8-quinolinyl-Benzamide; et inhibiteur du facteur de croissance transformant bêta (TGF-β) SB431542 (4-[4-(1,3-Benzodioxol-5-yl)-5-(2-pyridinyl)-1H-imidazol-2-yl]benzamide) à une concentration de 10 mM dans le sulfoxyde de diméthyle (DMSO).
    2. Pour la différenciation iPSC-EC humaine, préparer 100 μL d’aliquotes de facteur de croissance fibroblastique basique (bFGF) (20 μg/mL), de facteur de croissance endothélial vasculaire 165 (VEGF165; 50 μg/mL) et de protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP4; 20 μg/mL) dans 0,1 % (p/v) de BSA dans de l’eau distillée ultrapure. Conserver les aliquotes à -20 °C; pour un stockage à long terme, les aliquotes peuvent être stockées à -80 °C jusqu’à 1 an.
  7. Plaques de pré-revêtement pour la maintenance des iPSC-CM, iPSC-CE et iPSC-FC.
    1. Préparer des plaques de 6 puits revêtues de milieu de matrice de membrane basale pour le replaçage iPSC-CM en diluant le milieu de matrice de membrane basale à facteur de croissance réduit (DFG) dans DMEM/F12 dans un rapport de 1:200. Ajouter 2 mL de milieu matriciel à membrane basale diluée à chaque puits de la plaque à 6 puits et laisser reposer pendant au moins 2 à 4 h.
    2. Pré-enduire une assiette de 6 puits ou un plat de 10 cm avec de la gélatine. Liquéfiez une solution de gélatine à 2 % au bain-marie à 37 °C et préparez de la gélatine filtrée à 0,2 % (v/v) dans du PBS dans un volume approprié au besoin. Enduire la plaque de culture de 10 mL de 0,2 % de gélatine pendant au moins 30 min à 37 °C avant utilisation.
      REMARQUE: Les plaques de gélatine peuvent être utilisées pour les iPSC-CFs et les iPSC-ECs après MACS.
  8. Fabrication de moules à microtissu : Préparer une solution d’agarose à faible teneur en fusion à 2 % dans du PBS dans une bouteille sèche en verre de 100 ml. Stériliser l’agarose à 121 °C, 15 psi pendant 20 min avant utilisation. Autoclavez les micro-moules en silicone coulé à 121 °C, 15 psi pendant 15 min.
  9. Solutions pour la digestion, l’immunocoloration et la cytométrie en flux
    1. Pour la digestion par microtissus, préparer un tampon de digestion enzymatique de Dispase I (1 U/mL) et de Liberase (3 U/mL) dans le PBS. Gardez cette solution sur la glace.
    2. Pour la fixation des cellules et des microtissus, utilisez un réactif de fixation glacé disponible dans le commerce contenant 4,2 % de paraformaldéhyde (PFA).
    3. Préparer 0,25 % de Triton X-100 dans pbS pour la perméabilisation et 0,1 % de Tween-20 pour les lavages. La solution peut être conservée à température ambiante.
    4. Pour les analyses de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS), préparer le tampon FACS [PBS ou HBSS avec 2% de sérum fœtal bovin (FBS)] et conserver à 4 °C.
    5. Pour l’immunocoloration, préparez 2% de sérum normal de chèvre / âne / lapin dans pbS. Choisissez l’espèce sérique en fonction de l’hôte dans lequel les anticorps ont été élevés.

2. Différenciation et purification cardiaques

REMARQUE: Tous les CSPi doivent être maintenus à ~ 75% à 80% de confluence avant la différenciation des cardiomyocytes. Les CSPi utilisés pour ce protocole ont été dérivés de cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à l’aide de la reprogrammation du virus sendai effectuée à la biobanque du Stanford Cardiovascular Institute (SCVI).

  1. Avant la différenciation, la culture des colonies iPSC jusqu’au passage (P20).
  2. Retirez le milieu de culture iPSC de la plaque à 6 puits et lavez les cellules une fois avec 2 mL de PBS.
  3. Le jour 0, commencez l’induction du mésendoderme en ajoutant 2 mL de milieu de différenciation #1 avec CHIR (6 μM final) dans chaque puits. La concentration finale peut varier entre 6 et 9 μM pour différentes lignées iPSC. Par conséquent, il est recommandé de tester différentes concentrations de CHIR sur une plaque de 6 puits pour identifier l’induction optimale du mésoderme cardiaque.
  4. Le jour 2, récupérez les cellules en les remplaçant par du milieu frais de 2 mL #1 dans chaque puits.
  5. Le jour 3, remplacer le milieu dans chaque puits par 2 mL de différenciation Du milieu #1 par l’inhibiteur de Wnt IWR-1-endo (5 μM) pour induire la spécification de la lignée cardiaque.
  6. Le jour 5, récupérez les cellules en remplaçant le milieu par du milieu frais de 2 mL #1 dans chaque puits.
  7. Le jour 7, remplacez le milieu par 2 mL de milieu #2 dans chaque puits. Des battements spontanés de cardiomyocytes peuvent être observés dès les jours 8-9. Pour certaines lignes, les cellules battantes peuvent apparaître aussi tard que le jour 11.
  8. Pour la purification de la culture de différenciation, remplacer par 2 mL moins le milieu de glucose #3 dans chaque puits le jour 10.
  9. Le jour 13, récupérez les cellules en changeant le milieu avec 2 mL plus le glucose Medium #2 dans chaque puits.
  10. Le jour 16, effectuez une deuxième série de purification avec 2 mL de medium #3 dans chaque puits.
  11. Récupérez les cellules le jour 19 avec 2 mL plus glucose Medium #2.
  12. Le jour 20, lavez les puits une fois avec 1 mL de PBS et dissociez les cellules à l’aide de 1 mL 10x trypsine pendant 6 min à 37 °C. Après l’incubation, les cellules sont soulevées de la surface du puits en cellules individuelles pendant moins de 15 s et ajoutées à un tube conique de 15 mL avec un volume égal de milieu #2 pour neutraliser l’enzyme. Centrifuger la suspension de la cellule pendant 3 min à 270 x g.
  13. Remettre en suspension la pastille de cellule dans un milieu de 3 mL #3. Comptez les cellules et ajoutez le volume approprié de milieu #3 pour plaquer un total d’environ 3 millions de cellules dans chaque puits d’une nouvelle matrice de membrane basale recouverte d’une plaque de 6 puits revêtue de matrice basale. Le deuxième jour après le replacage, remplacez le milieu par du milieu frais de 2 mL #2 et reconstituez-le avec 2 mL de milieu n ° 2 tous les deux jours jusqu’à la trypsinisation des cardiomyocytes pour la congélation ou de futures expériences.

3. Différenciation des cellules endothéliales et MACS

  1. À une confluence iPSC de 75 % à 80 %, laver la plaque avec du PBS, 2 mL par puits.
  2. Commencez la différenciation au jour 0 en remplaçant par 2 mL de différenciation Le milieu #1 avec 6 μM CHIR.
  3. Le jour 2, remplacez le milieu par 2 mL de différenciation Milieu #1 par 2 μM CHIR.
  4. Le jour 4, remplacez le milieu par 2 mL d’EGM complétés par 20 ng de bFGF-2, 50 ng de VEGF165 et 20 ng de BMP4.
  5. Changer le milieu avec 2 mL d’EGM complété par des facteurs de croissance tous les 2 jours du jour 6 au jour 10. L’ajout d’inhibiteur de TGFβ (SB431542) à une concentration de 8 μM est facultatif pour favoriser l’expansion endothéliale et supprimer la différenciation d’autres types de cellules d’origine mésenchymateuse.
  6. Le jour 12, commencez les étapes pour macS en rinçant chaque puits avec 1 mL de PBS suivi d’une dissociation cellulaire en utilisant 1 mL de 10x trypsine dans chaque puits d’une plaque de 6 puits pendant 8 min à 37 °C.
  7. Préparer un volume égal de milieu EGM dans un tube conique de 50 mL pour neutraliser l’enzyme de dissociation. Placez une passoire cellulaire de 40 μm sur le tube conique de 50 mL et passez la suspension cellulaire dissociée à travers la crépine. Changez le filtre pour chaque 2 à 3 puits dissociés.
  8. Dénombrer le total des cellules viables à l’aide de 0,4 % de bleu de Trypan à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
  9. Pastillez la suspension de la cellule à 300 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse pré-refroidie réglée à 4 °C.
  10. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans un volume approprié de tampon de tri en fonction du nombre total à l’étape 3.8.
    REMARQUE: Ajouter 80 μL de tampon de tri pour 107 cellules au total.
  11. Pour le marquage magnétique des billes, ajouter 20 μL de réactif fcr bloquant par 107 cellules et incuber pendant 5 min.
  12. Ajouter 20 μL de microbilles CD144 ou CD31 par 107 cellules et bien mélanger. Incuber la suspension cellulaire dans l’obscurité à 4 °C pendant 15 min.
  13. Ajouter 20 mL de tampon de tri pour laver les cellules étiquetées et granuler les cellules 300 x g pendant 5 min dans une centrifugeuse pré-refroidie réglée à 4 °C.
  14. Remettez en suspension la pastille de cellule dans 3 mL de tampon de tri et laissez-la sur la glace.
  15. Préparez une colonne de séparation magnétique en plaçant la colonne dans l’encoche du séparateur.
  16. Équilibrez la colonne en rinçant avec 3 mL de tampon de tri et collectez le flux dans un tube conique de déchets.
  17. Une fois que le tampon de rinçage est passé, remettez soigneusement en suspension la suspension cellulaire pour briser les amas et appliquez la suspension cellulaire sur la colonne.
  18. Une fois que la suspension cellulaire a coulé, lavez la colonne avec 3 mL de tampon de tri trois fois pour éliminer les cellules non étiquetées.
  19. Retirez la colonne du séparateur et placez-la dans un tube conique de 15 mL pour l’élution des cellules CD144+/CD31+.
  20. Ajoutez 5 mL de tampon de tri sur la colonne et rincez immédiatement les cellules marquées magnétiquement avec le piston.
  21. Déterminez le nombre de cellules viables à l’aide de 0,4 % de bleu de trypan à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
  22. Centrifuger la suspension de la cellule dans une centrifugeuse pré-refroidie à 300 x g pendant 3 min.
  23. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié d’EGM avec 5 à 8 μM d’inhibiteur de TGFβ (SB431542) en fonction du nombre total à l’étape 3.21.
  24. Plaquer ce passage 0 (P0) de cellules à une densité cellulaire appropriée (4 x 104 cellules/cm2) sur une plaque de gélatine pré-enduite à 0,2%.
  25. Pour P0 et P1, continuer à reconstituer le milieu avec de l’EGM frais tous les 2 jours avec un inhibiteur de TGFβ. À partir de P2, les cellules peuvent être cultivées dans un milieu de croissance endothélial sans inhibiteur de TGFβ.

4. Différenciation des fibroblastes cardiaques

  1. Permettre aux CSPi de devenir confluents à 90 % à 95 %; laver chaque puits avec 1 mL de PBS.
  2. Commencez la différenciation au jour 0 en ajoutant 2 mL de différenciation Milieu #1 avec 11 μM CHIR. Pour les raies iPSC sensibles, la concentration peut varier entre 9 et 10 μM.
  3. Le jour 1, observez la plaque. Il est normal d’observer une mort cellulaire importante avec ~ 30% à 40% de cellules adhérées à la plaque.
  4. Le jour 3, ajouter 2 mL de milieu de différenciation #1 avec 5 μM IWR-1-endo pour favoriser l’expansion des progéniteurs cardiaques.
  5. Le jour 4, remplacez le milieu par 2 mL de milieu de différenciation des fibroblastes cardiaques. Remplacer par du milieu frais tous les 2 jours jusqu’au jour 16.
  6. Le jour 18, détachez les cellules à l’aide de 1 mL de 10x trypsine dans chaque puits d’une plaque de 6 puits pendant 10 min à 37 °C.
  7. Perturbez complètement la couche cellulaire et faites passer la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube conique de 50 mL contenant un volume égal de milieu DMEM/F12 complété par 5% de FBS.
  8. Déterminez le nombre de cellules viables à l’aide de 0,4 % de bleu de trypan à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur cellulaire automatisé.
  9. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min pour obtenir une pastille.
  10. Pour le premier replacage, remettre en suspension la pastille cellulaire dans un volume approprié de milieu de différenciation et la plaque à une densité cellulaire (6 x 104 cellules/cm2) sur une plaque enduite de gélatine à 0,2 % jusqu’à 90 % de confluence.
  11. Divisez la plaque et maintenez les fibroblastes cardiaques dans le DMEM / F12 régulier avec 10% de sérum sur des plaques enduites de gélatine.

5. Coulée de moisissures de microtissus cardiaque et ensemencement cellulaire

  1. Faire fondre l’agarose au micro-ondes dans une bouteille en verre de 100 ml jusqu’à ébullition. Vaporisez le flacon d’agarose et placez-le dans l’armoire de biosécurité. Laissez l’agarose refroidir pendant environ 3 min.
  2. Pipette 700 μL d’agarose fondue dans un micro-moule en silicone de 9 x 9 array. Évitez de générer des bulles pendant le pipetage.
  3. Placez soigneusement le moule sur un bloc de glace pré-refroidi pour accélérer la gélification de l’agarose.
  4. Assurez-vous qu’une fois que l’agarose est gélifiée, elle devient translucide. Pliez soigneusement les bords du micro-moule pour desserrer la réplique d’agarose. Ensuite, pelez doucement la réplique de tous les côtés pour détacher la réplique d’agarose du micro-moule en silicone.
  5. Transférer le plateau de microtissu d’agarose contenant 81 renfoncements circulaires (800 μm de diamètre; 800 μm de profondeur) dans une plaque stérile de 12 puits.
  6. Ajouter 2 mL de PBS au plateau de microtissu d’agarose et inspecter au microscope les bulles piégées ou les puits de forme irrégulière.
  7. Immergez le plateau d’agarose dans 2 mL d’éthanol à 70% pendant la nuit, puis le traitement UV dans l’armoire de biosécurité pendant 1 h.
  8. Avant utilisation, retirer l’éthanol à 70 % et laver deux fois à l’eau distillée et un lavage final avec 2 mL de PBS.
  9. Trypsiniser, neutraliser et compter les iPSC-CM, iPSC-ECs et iPSC-CFs et placer les suspensions cellulaires sur la glace.
  10. Retirez soigneusement le PBS du puits et de la chambre d’ensemencement cellulaire sans toucher les renfoncements.
  11. Dans un nouveau tube, mélangez des iPSC-CM, des iPSC-CE et des iPSC-FC dans un rapport de 7:2:1, respectivement, pour obtenir une densité cellulaire finale de 106 cellules/mL. Des densités cellulaires plus élevées entraîneront des microtissus plus importants.
    REMARQUE: Ne pas dépasser 2 x 106 cellules / mL.
  12. Ajouter soigneusement les 200 μL de la suspension cellulaire goutte à goutte dans la chambre d’ensemencement.
  13. Laisser les cellules se déposer à 37 °C dans un incubateur à CO2 pendant 2 h.
  14. Ajouter un milieu de fabrication de microtissue entourant le moule d’agarose pour recouvrir simplement la surface de la chambre intérieure.
  15. Après 24 h, les cellules s’auto-assemblent et se compactent de manière significative dans les renfoncements circulaires. Remplacer par un milieu frais tous les 2 jours pour l’entretien.

6. Fixation et perméabilisation des cellules et des microtissus cardiaques pour l’immunocoloration

  1. Pour chaque type de cellule, cultivez les cellules séparément sur un milieu de matrice de membrane basale ou des lames de chambre revêtues de gélatine (environ 2,5 à 3 x 105 cellules/mL). Les microtissus cardiaques peuvent être recueillis dans un tube conique de 15 mL en les rinçant doucement hors des renfoncements circulaires.
  2. Aspirer le milieu et rincer les cellules ou les microtissus avec 1 mL de PBS; par la suite, fixer avec le tampon de fixation contenant 4,2% de PFA pendant 20 min pour les glissières de la chambre et 1 h pour les microtissues à température ambiante.
  3. Aspirer le PFA et ajouter 1 mL de solution perméabilisante (0,25% de Triton X-100 dans pbS) pendant 5 à 7 min pour les lames de chambre et 20 min pour les microtissues dans un tube conique de 15 mL.
    REMARQUE: À partir de cette étape, les échantillons peuvent être doucement bercés sur une plate-forme à bascule de paillasse.
  4. Aspirer la solution perméabilisante et rincer une fois avec 2 à 3 mL de PBS.
  5. Incuber les cellules avec 500-1 000 μL de solution bloquante (2% à 5% de sérum de chèvre normal ou de sérum d’âne) pendant au moins 1 h pour les lames de chambre et 3 à 4 h pour les microtissus.
  6. Incuber les cellules ou les microtissus cardiaques avec des anticorps conjugués préparés dans la solution bloquante suffisante pour couvrir l’échantillon. Incuber avec de la troponine-T (cTnT2) anti-cardiaque (1:50), de l’anti-CD31 (1:75) et de l’anti-DDR2/Vimentin (1:50) pendant 1 h pour les lames de la chambre et pendant la nuit à 4 °C pour les microtissus cardiaques.
  7. Lavez les glissières de la chambre trois fois avec 500 μL 0,1% Tween-20 pendant 5 min entre chaque lavage et un lavage final avec PBS.
  8. Pour les microtissus cardiaques, laver avec 2 mL 0,1% Tween-20 cinq fois avec une durée de 20 min entre chaque lavage. Effectuez une dernière étape de lavage pendant 20 minutes supplémentaires.
  9. Incuber les cellules ou les microtissus avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 μg/mL) avant la microscopie confocale.
  10. Pour les microtissus cardiaques, transférer soigneusement dans une parabole inférieure en verre de 35 mm et ajouter du PBS pour immerger les microtissus.
  11. Pour l’imagerie 3D, à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 20x ou 40x, le centre de mise au point du microtissu et ajuste les paramètres d’exposition pour chaque fluorophore.
  12. Pour obtenir une pile Z, définissez les première et dernière coordonnées en mode Live avec une profondeur d’imagerie totale de 100-200 μm avec un intervalle de tranche de 5-10 μm.

7. Digestion des microtissus cardiaques et préparation des cellules pour la cytométrie en flux

  1. Pour digérer les microtissus, rincez doucement les microtissues avec le médium #1 hors des renfoncements circulaires à l’aide d’une pointe de pipette de 1 mL à large alésage dans un tube conique de 15 mL.
  2. Laisser les microtissus se déposer et aspirer soigneusement le milieu et rincer soigneusement les cellules ou les microtissus avec 1 mL de PBS et ajouter 200-300 μL de tampon de digestion enzymatique pendant 20 min à 37 °C. A 10 min, mélanger doucement les microtissus pendant 1 min et incuber à nouveau à 37 °C pour le reste du temps.
  3. Après l’incubation, utilisez une pointe de pipette régulière de 1 mL pour mélanger vigoureusement les microtissus afin d’obtenir une suspension cellulaire trouble.
  4. Une fois que les microtissus sont suffisamment digérés en cellules individuelles, neutralisez immédiatement la suspension cellulaire avec 5 mL de milieu contenant 5% de FBS et filtrez la suspension cellulaire à travers une passoire cellulaire de 40 μm. Compter le nombre total de cellules et centrifuger la suspension monocellulaire à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.
  5. Aspirer le surnageant et remettre en suspension 1 x 105-1 x 106 cellules dans un tampon de liaison à l’annexine de 100 μL avec l’annexine V du FITC et 100 μg/mL d’iodure de propidium (PI) ou de colorant d’exclusion des cellules mortes To-Pro3 pendant 10 min sur glace.
  6. Après l’incubation, ajouter 300 μL du tampon de liaison à l’annexine à la suspension cellulaire et transférer dans un tube FACS à fond rond pour l’analyse par cytométrie en flux. Utilisez les lasers et les filtres d’émission appropriés pour les fluorophores sélectionnés.
  7. Pour la quantification des marqueurs de surface cellulaire à l’aide de cellules fixes, effectuer la fixation et la perméabilisation de la pastille cellulaire comme décrit aux étapes 6.2 et 6.3.
  8. Après la perméabilisation, rincer la pastille cellulaire et incuber les cellules avec les anticorps conjugués respectifs pendant 1 h. Laver la pastille de cellule dans un tampon FACS de 4 mL (2% FBS en PBS) et centrifuger à 300 x g pendant 3 min. Répétez l’étape de lavage deux fois.
  9. Remettre en suspension les cellules dans un tampon FACS de 200 à 300 μL pour l’analyse par cytométrie en flux.
  10. Ajustez les propriétés de diffusion vers l’avant et latérale avec un échantillon non coloré et envisagez d’utiliser un contrôle d’isotype pour chaque fluorophore afin d’ajuster les tensions laser. Collectez un minimum de 20 000 événements pour l’analyse des données.

8. Effectuer des analyses de contraction de microtissus cardiaques battant spontanément

  1. Enregistrez des vidéos de microtissus cardiaques pour capturer au moins trois battements. Réglez la résolution d’enregistrement sur au moins 1280 x 720 pixels à une fréquence d’images >30 images par seconde et enregistrez la vidéo dans . Format AVI.
  2. Exécutez le script MotionGUI11 dans un environnement MATLAB pour lancer l’interface utilisateur.
  3. Trouvez le fichier . Emplacement du fichier AVI dans votre dossier pour charger la vidéo. Ensuite, entrez la fréquence d’images à laquelle la vidéo a été capturée dans le panneau de saisie.
  4. Dans le panneau de saisie avancé, une taille de pixel peut être spécifiée en fonction de la résolution et du grossissement de la capture.
  5. Une taille de pixel macrobloc appropriée peut être spécifiée (16 par défaut) et un mouvement de pixel détectable en fonction de la force de la contraction du microtissu.
  6. Après avoir ajusté les paramètres, cliquez sur Obtenir des vecteurs de mouvement pour commencer l’analyse.
  7. Sélectionnez une région d’intérêt à l’aide de la case d’option Choisir un AOI pour exclure les zones entourant la microtissue unique dans le renfoncement circulaire.
  8. Utilisez la fonction Map Time Ave pour générer une carte thermique de contraction moyenne basée sur le mouvement détecté sur les axes X et Y.
  9. Pour les données de suivi des pics, utilisez la fonction Obtenir les données de contraction pour mesurer automatiquement les pics de contraction et de relaxation.
  10. En cas de faible rapport signal/bruit, appliquez un seuil de hauteur et de distance de crête pour annoter correctement la vitesse de contraction maximale (point bleu) et la vitesse de relaxation maximale (triangle rouge).
  11. Après avoir défini les seuils corrects, sélectionnez Analyser les pics pour obtenir les valeurs de contraction et de relaxation avec la vitesse de battement et l’intervalle de battement.
  12. Obtenez des mesures à partir d’un minimum de 25 microtissus individuels pour des analyses statistiques.

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Résultats

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Caractérisation par immunocoloration et cytométrie en flux des CM, CE et FC dérivés de l’iPSC
Pour générer des microtissus cardiaques composés d’iPSC-CM, d’iPSC-CE et d’iPSC-FC, les trois types de cellules sont différenciés et caractérisés individuellement. La différenciation in vitro des CSPi en cSPi-MC s’est améliorée au cours des dernières années. Cependant, le rendement et la pureté des iPSC-CM diffèrent d’une ligne à l’autre. Le protocole actuel produit plus de 75 % d’iPSC-CM purs qui co...

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Discussion

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Pour générer des microtissus cardiaques à partir d’iPSC-CM, d’iPSC-EC et d’iPSC-CF prédifférenciés, il est essentiel d’obtenir une culture très pure pour un meilleur contrôle du nombre de cellules après un compactage cellulaire inhibé par contact dans les microtissus cardiaques. Récemment, Giacomelli et. al.18 ont démontré la fabrication de microtissus cardiaques à l’aide d’iPSC-CM, d’iPSC-CE et d’iPSC-FC. Les microtissus cardiaques générés à l’aide de la méthode décrite se composent d’environ 5 0...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. est cofondateur de Khloris Biosciences mais n’a pas d’intérêts concurrents, car le travail présenté ici est complètement indépendant. Les autres auteurs ne signalent aucun conflit.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous remercions la Dre Amanda Chase pour ses commentaires utiles sur le manuscrit. Le financement a été fourni par le Tobacco-Related Disease Research Program (TRDRP) de l’Université de Californie, T29FT0380 (D.T.) et 27IR-0012 (J.C.W.); American Heart Association 20POST35210896 (H.K.) et 17MERIT33610009 (J.C.W.); et National Institutes of Health (NIH) R01 HL126527, R01 HL123968, R01 HL150693, R01 HL141851 et NIH UH3 TR002588 (J.C.W).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Plaques 12 puitsFisher Scientific08-772-29
Micro-moules 3DMicrotissusFormat 12-81 Plaques
puitsFisher Scientific08-772-1B
AutoMACS Rinsing SolutionThermo Fisher ScientificNC9104697
B27 Supplement minus InsulinLife TechnologiesA1895601
Supplément B27 plus insulineLife Technologies17504-044
BD CytofixBD Biosciences554655
BD Matrigel, matrice qualifiée hESCBD Biosciences354277
Anticorps T Troponine CardiaqueMiltenyi130-120-403
CD144 (VE-Cadhérine) MicrobillesMiltenyi130-097-857
CD31 AnticorpsMiltenyi130-110-670
CD31 MicrobillesMiltenyi130-091-935
CHIR-99021SelleckchemS2924
DDR2Santa Cruz Biotechnologysc-81707
Kit d’apoptose à cellules mortes avec Annexine V FITC et PIThermo Fisher ScientificV13242
Dispase IMillipore Sigma4942086001
DMEM, teneur élevée en glucose (4,5 g/L), sans milieu11960044
milieu basal DMEM/F-12Gibco11320033
solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS), sans calcium, sans magnésiumLife Technologies14190-136
EGM2 BulletKitLonzaCC-3124
Fœtus bovins sérumLife Technologies10437
FibroLife Fibroblast sans sérumLifeFactors Kit LifeLIne Cell TechnologyLS-1010
Sérum sans glucose RPMI mediumLife Technologies11879-020
Sérum de chèvreLife Technologies16210-064
FGF humain de baseThermo Fisher Scientific13256029
Humain VEGF-165PeproTech100-20
IWR-1-endoSelleckchemS7086
Liberase TLMillipore Sigma5401020001
LS Colonnes de triMiltenyi130-042-401
MACS BSA Solution mèreMiltenyi130-091-376
Tampon de rinçage MACSMiltenyi130-091-222
Séparateur MidiMACSMiltenyi130-042-302
RPMI mediumLife Technologies11835055
SB431542SelleckchemS1067
TO-PRO 3Thermo Fisher ScientificR37170
Triton X-100Millipore SigmaX100-100ML
TrypLE Select 10XThermo Fisher Scientificred
Vimentin Alexa Fluor® ; 488-conjugué AnticorpsR& D SystemsIC2105G
6 glutamine

Références

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Mots-clés

Micro tissus cardiaquesfraction vasculaire stromalecytom trie en fluxs quen age de l ARN unicellulairemicroscopie confocaletechnique du moule d agarosedensit d ensemencement cellulaireanalyse de la fonction contractilemarquage par immunofluorescence

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