Flux de travail quantitatif protéomique sans étiquette pour les interactions hôte-pathogène axées sur la découverte

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour profiler l’interaction entre l’hôte et l’agent pathogène pendant l’infection par protéomique basée sur la spectrométrie de masse. Ce protocole utilise une quantification sans étiquette pour mesurer les changements dans l’abondance des protéines de l’hôte (p. ex., macrophages) et de l’agent pathogène (p. ex., cryptococcus néoformans)en une seule expérience.

Résumé

Les réalisations technologiques de la protéomique quantitative basée sur la spectrométrie de masse (SP) ouvrent de nombreuses voies inconnues pour analyser le protéome global d’un organisme dans des conditions variables. Cette stratégie puissante appliquée aux interactions des pathogènes microbiens avec l’hôte désiré caractérise globalement les deux perspectives vers l’infection. Dans ce cas, le flux de travail décrit la quantification sans étiquette (LFQ) de l’infectome des néoformans Cryptococcus, un pathogène intracellulaire fongique qui est l’agent causal de la cryptococcose mortelle de la maladie, en présence de cellules macrophages immortalisées. Le protocole détaille les techniques appropriées de préparation des protéines pour les cellules pathogènes et mammifères au cours d’une seule expérience, ce qui donne lieu à une soumission appropriée de peptides pour l’analyse liquide-chromatographie (LC)-MS/SP. La nature générique à haut débit de LFQ permet une large gamme dynamique d’identification et de quantification des protéines, ainsi que la transférabilité à n’importe quel paramètre d’infection hôte-pathogène, maintenant une sensibilité extrême. La méthode est optimisée pour cataloguer des profils étendus et impartiaux d’abondance de protéines d’un agent pathogène dans des conditions imitant l’infection. Plus précisément, la méthode démontrée ici fournit des informations essentielles sur la pathogénie c. néoformans, telles que la production de protéines nécessaires à la virulence et identifie les protéines hôtes critiques répondant à l’invasion microbienne.

Introduction

La prévalence des infections fongiques invasives augmente considérablement et est corrélée avec des taux de mortalité inacceptablement élevés, le plus souvent signalés chez les personnes ayant des prédispositions immunodéficientes¹. Cryptococcus neoformans est un pathogène fongique opportuniste notoire capable de survie intracellulaire dans les cellules macrophages hôtes. L’intervention antifongique inadéquate a comme résultat la diffusion fongique et les manifestations représentant un danger pour la vie de la méningite cryptococcique et de la méningoencéphalite^2,3. L’augmentat....

Protocole

Une lignée immortalisée de macrophages dérivés de souris BALB/c a été utilisée pour le protocole suivant approuvé par le Protocole d’utilisation des animaux 4193 de l’Université de Guelph. Notamment, d’autres souches de souris ou d’autres sources de cellules immortalisées peuvent être appliquées au protocole décrit avec des tests suffisants pour optimiser les paramètres détaillés. Le protocole suivant naviguera dans les étapes commençant par un flacon gelé de cellules macrophages. Les cellules sont stockées dans 10 % de FBS (sérum bovin fœtal), 1 % de L-glutamine et 5 % de mélange Pen/Strep (Pénicilline-Streptomycine) au DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) et 20 %....

Résultats

Le protocole décrit ci-dessus permet l’identification et la quantification des protéines dérivées à la fois de l’agent pathogène fongique, C. neoformans,et de l’hôte, les cellules macrophages, en une seule expérience. Après la co-culture, les cellules sont collectées et traitées ensemble et séparées bioinformatiquement à partir de profils peptidiques spécifiques à chaque espèce. Il s’agit d’une approche puissante pour définir l’interaction de la relation hôte-pathogène pendant l’infection. Le nombre de protéines.......

Discussion

Les étapes critiques du protocole comprennent la préparation des cellules macrophages et la collecte d’échantillons de co-culture pour le traitement des protéines avec une perturbation minimale des cellules. Il est important d’effectuer des étapes de lavage, d’inoculation et d’élimination des cellules macrophages adhérentes doucement et soigneusement pour prévenir la lyse inutile des cellules avant la collecte. Il est également essentiel d’établir le moi correct pour l’expérience, car l’inocculation avec un MOI excessive.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
100 mM Tris-HCl, pH 8,5	Fisher Scientific	BP152-1	Maintenir à 4° ; Plat C
60 x 15 mm, Nunclon Delta	ThermoFisher Scientific	174888
Plaque de culture cellulaire 6 puits	ThermoFisher Scientific	140675
Acétonitrile, grade MS	Pierce	TS-51101
Acide acétique	Sigma Aldrich	1099510001
Acétone	Sigma Aldrich	34850-1L
Ammonium bicarbonate (ABC)	ThermoFisher Scientific	A643-500	Préparez une solution mère de 50 mM ABC, stable à température ambiante jusqu’à un mois.
Bel-Art&commerce ; Système de prélèvement par aspirateur HiFlow	Fisher Scientific	13-717-300	Non indispensables, les pipettes sérologiques peuvent être utilisées pour retirer les milieux.
Résine C18	3M Empore	3M2215
Racleurs de cellules	VWR	10062-906	Pas indispensable, d’autres méthodes pour libérer les cellules macrophages peuvent être utilisées.
Concentrateur centrifuge sous vide	Eppendorf	07-748-15
Unité de filtration complète	VWR	10040-436
Tubes coniques Falcon (15 mL)	Fisher Scientific	05-539-12
Compteur de cellules automatisé Countess II	ThermoFisher Scientific	AMQAX1000	Non indispensable, l’hémocytomètre peut être utilisé comme alternative.
CytoTox 96 Dosage de cytotoxicité non radioactive	Promega	G1780
Dithiothréitol (DTT)	ThermoFisher Scientific	R0861	Préparer une solution mère en vrac de 1 M de DTT, congelée et stockée à -20 ° ; C jusqu’à l’utilisation. Jeter après chaque utilisation (ne pas congeler-décongeler à plusieurs reprises).
DMEM, glycémie élevée, supplément GlutaMAX	ThermoFisher Scientific	10566016
sérum de veau fœtal (FBS)	ThermoFisher Scientific	12483020	Inactivation de la chaleur par incubation à 60° ; C pendant 30 minutes. Préparez 50 ml d’aliquotes et congelez-les. Décongeler avant la préparation du milieu
Hémocytomètre	VWR	15170-208
HEPES	Sigma Aldrich	H3375	Préparer 40 mM HEPES/8 M d’urée dans une solution mère en vrac, surgelé, conserver à -20° ; C jusqu’à l’utilisation. Jeter après chaque utilisation (ne pas congeler-décongeler à plusieurs reprises).
Système de chromatographie liquide haute performance	ThermoFisher Scientific	LC140	La longueur du gradient est basée sur la complexité de l’échantillon, gradient recommandé de 120 min pour les échantillons d’infectome.
Spectromètre de masse haute résolution	ThermoFisher Scientific	726042
Iodoacétamide (IAA)	Sigma Aldrich	I6125	Préparer une solution mère en vrac de 0,55 M, surgelée, conserver à -20° ; C jusqu’à l’utilisation. Jeter après chaque utilisation (ne pas congeler-décongeler à plusieurs reprises).
L-glutamine	ThermoFisher Scientific	25030081	Peut être aliquote et congelée pour le stockage. Décongeler avant la préparation du support.
LoBind Microtubes à centrifuger	Eppendorf	13-698-794
MaxQuant	https://maxquant.org/		MaxQuant est une plateforme publique qui propose des tutoriels, tels que la MaxQuant Summer School, décrivant les étapes d’analyse computationnelle de grands ensembles de données MS
Microcentrifugeuse	Eppendorf	13864457
Pénicilline : Streptomycine 10k/10k	VWR	CA12001-692	Peut être aliquote et congelé pour le stockage. Décongeler avant la préparation du support.
Colonnes de séparation peptidique	ThermoFisher Scientific	ES803
Logiciel Perseus	http://maxquant.net/perseus/
Phosphate Buffered Saline	VWR	CA12001-676	Puchase non nécessaire. Le PBS peut également être préparé mais une filtration stérile doit être effectuée avant utilisation.
Dosage des protéines Pierce BCA	ThermoFisher Scientific	; 23225
Pipette, sérologique jetable (10 mL)	Fisher Scientific	13-678-11F
Pipette, sérologique jetable (25 mL) Basix	Fisher Scientific	14955235
Sonciateur	ThermoFisher Scientific	100-132-894
Inhibiteur de protéase comprimé	cocktail Roche	4693159001
Dodécylsulfate de sodium	ThermoFisher Scientific	28364	20 % (p/v)
Spectrophotomètre (Nanodrop)	ThermoFisher Scientific	ND-2000
STAGE Centrifugeuse basculante	Sonation	STC-V2
Agitateur thermique	VWR	NO89232-908
Acide trifluoroacétique	ThermoFisher Scientific	85183
Mélange de protéases Trypsine/Lys-C, MS grade	Pierce	A40007	Maintenir à -20 ° ;C.
Bain à ultrasons	Bransonic	A89375-450	Stocké en chambre froide (4C)
Urea	Sigma Aldrich	U1250-1KG	Préparer 40 mM HEPES/8 M d’urée dans une solution mère en vrac, surgelée, conserver à -20 ° ; C jusqu’à l’utilisation. Jeter après chaque utilisation (ne pas congeler-décongeler à plusieurs reprises).
Bouillon peptone dextrose à l’extrait de levure	BD Difco	BM20