Modèles de co-culture microfluidique pour disséquer la réponse immunitaire dans des microenvironnements tumoraux in vitro

Résumé

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire, la biologie du cancer nécessite de nouveaux outils in vitro et informatiques pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié. Nous décrivons des protocoles pour exploiter les co-cultures microfluidiques immunitaires contre les tumeurs dans des contextes 2D et 3D, compatibles avec la surveillance dynamique et multiparamétrique des fonctions cellulaires.

Résumé

Les modèles de maladies complexes exigent des outils de pointe capables de fournir des informations physiologiquement et pathologiquement pertinentes et exploitables, et de dévoiler des processus autrement invisibles. Des tests cellulaires avancés imitant étroitement le paysage in vivo s’imposent comme de nouvelles façons de visualiser et de mesurer l’interaction bidirectionnelle tumeur-hôte influençant la progression du cancer. Nous décrivons ici deux protocoles polyvalents pour recréer des co-cultures 2D et 3D hautement contrôlables dans des microdispositifs, imitant la complexité du microenvironnement tumoral (TME), sous immunosurveillance naturelle et induite par la thérapie. Dans la section 1, un cadre expérimental est fourni pour surveiller la diaphonie entre les cellules tumorales adhérentes et les populations immunitaires flottantes, par microscopie accélérée à champ clair. En tant que scénario applicatif, nous analysons les effets des traitements anticancéreux, tels que les inducteurs immunogènes de la mort des cellules cancéreuses sur le recrutement et l’activation des cellules immunitaires. Dans la section 2, les microenvironnements 3D immunitaires contre les tumeurs sont assemblés dans une configuration compétitive. L’infiltration immunitaire différentielle est surveillée par des instantanés de fluorescence jusqu’à 72 h, afin d’évaluer les stratégies thérapeutiques combinées. Dans les deux contextes, les étapes de traitement de l’image sont illustrées pour extraire une pléthore de paramètres des cellules immunitaires (par exemple, la migration et l’interaction des cellules immunitaires, la réponse aux agents thérapeutiques). Ces méthodes simples et puissantes peuvent être adaptées pour simuler la complexité du TME englobant l’hétérogénéité et la plasticité des sous-types de cellules cancéreuses, stromales et immunitaires, ainsi que leurs interactions réciproques en tant que moteurs de l’évolution du cancer. La conformité de ces technologies en évolution rapide avec l’imagerie à haut contenu de cellules vivantes peut conduire à la génération de grands ensembles de données informatives, ce qui pose de nouveaux défis. En effet, le triangle ''co-cultures/microscopie/analyse avancée de données'' ouvre la voie à un paramétrage précis du problème qui peut aider à des protocoles thérapeutiques sur mesure. Nous nous attendons à ce que l’intégration future de l’immunité contre le cancer sur puce avec l’intelligence artificielle pour le traitement à haut débit mette en synergie un grand pas en avant dans l’exploitation des capacités en tant qu’outils prédictifs et précliniques pour l’oncologie de précision et personnalisée.

Introduction

L’évolution des différentes branches de la médecine en tant que disciplines expérimentales a dépendu de la capacité à manipuler la population cellulaire et les fonctions des organes dans des conditions contrôlées¹. Une telle capacité a ses racines dans la disponibilité de modèles mesurables capables de récapituler les processus qui se produisent dans notre corps.

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire 2, la biologie du cancer doit tirer parti des modèles in vitro et informatiques émergents pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié

Protocole

1. Conception de puces pour les co-cultures 2D de cellules adhérentes et flottantes

REMARQUE : La disposition de co-culture 2D (Figure 1A-C) est caractérisée par trois chambres (100 μm de haut) reliées entre elles par deux ensembles de réseaux de microcanaux (500 x 12 x 10 μm³, L×W×H). La chambre intermédiaire forme deux compartiments fermés en cul-de-sac qui bloquent les cellules immunitaires flottantes débordant dans le site tumoral lors de l’étape de chargement 2.5. Ce type d’appareil est utile pour les mesures bidimension....

Résultats

L’infiltration immunitaire tumorale est un paramètre de la réponse antitumorale de l’hôte. Les tumeurs sont hétérogènes dans la composition, la densité, l’emplacement et l’état fonctionnel des leucocytes infiltrants dont les interactions avec les cellules cancéreuses peuvent sous-tendre des informations cliniquement pertinentes pour prédire l’évolution de la maladie et la réponse au traitement. En ce sens, les technologies microfluidiques pourraient être utilisées comme des outils in vitro complémentaires et privilégiés .......

Discussion

Les méthodes décrites tentent de concevoir une approche générale pour récapituler, avec un degré de complexité modulable, deux aspects significatifs dans le domaine de l’onco-immunologie, qui peuvent bénéficier de l’adoption de modèles in vitro plus pertinents. Le premier concerne le côté de la population de cellules tumorales, où s’attaquer aux caractéristiques des cellules uniques peut conduire à une meilleure description de l’hétérogénéité et de la signification biologique et clinique corrélée, y compris la résistance.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
forts » ; Tubes
50 mL	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	CLS430828	tubes à centrifuger
5-aza-2'-désoxycytidine DAC	Millipore-Sigma ; St. Louis, MO	A3656	Agent hypométhylant d’ADN
Plaques à 6 puits	Corning-Sigma Aldrich, St. Louis, MO	Boîtes de culture CLS3506
75 cm2 Flacon	traité pour culture cellulaireCorning, New York, NY	430641U	flacons de culture
A365M	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA	br/> CVCL_B222	lignée cellulaire de mélanome humain
Chlorhydrate de doxorubicine	Millipore-Sigma ; St. Louis, MO	D1515	antibiotique anthracycline  ;
Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM	EuroClone Spa, Milan, Italie	ECM0728L	Milieu de culture pour cellules SK-MEL-28
Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline sans calcium sans magnésium	EuroClone Spa, Milan, Italie	ECB4004L	solution tampon saline
Sérum de veau fœtal	EuroClone Spa, Milan, Italie	ECS0180L	auxiliaire pour la culture cellulaire
Ficoll	GE-Heathcare	17-1440-02	séparation des cellules mononucléées du sang humain.
hémocytomètre	Neubauer		Compteur de cellules
Flacons héparinés	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Flacons pour prélèvement de sang veineux
interféron alpha-2b	Millipore-Sigma ; St. Louis, MO	SRP4595	cytokine humaine recombinante
L-Glutamine 100X	EuroClone Spa, Milan, Italie	ECB3000D	auxiliaire pour la culture cellulaire
Azote
Milieux de séparation cellulaire des lympholytes	Cedarlane Labs, Burlington, Canada		Séparation des lymphocytes par centrifugation à gradient de densité
Lymphoprep	Axis-Shield PoC AS, Oslo, Norvège
Matrigel	Corning, New York, NY	354230	facteur de croissance matrice de membrane basale
réduite MDA-MB-231  ;	American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginie		Lignée cellulaire de cancer du sein humain
Pénicilline/Streptomycine 100X  ;   ;	EuroClone Spa, Milan, Italie	ECB3001D	auxiliaire pour la culture cellulaire
Aide à la pipette	Drummond Scientific Co., Broomall, PA	4-000-201	Manipulation de liquides
PKH26 Rouge Fluorescent cell linker	Millipore-Sigma ; St. Louis, MO	PKH26GL	cellulaire fluorescent rouge
PKH67 Connecteur cellulaire fluorescent vert	Millipore-Sigma ; St. Louis, MO	vert PKH67GL
RPMI-1640	EuroClone Spa, Milan, Italie	ECM2001L	Milieu de culture pour pipettes sérologiques à cellules MDA-MB-231
(2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)	Corning- Millipore-Sigma ; St. Louis, MO	CLS4486 ; CLS4487 ; CLS4488 ; CLS4489 ; CLS4490	pour la manipulation
des liquides (1-10 &mu ; L, 10-20 &mu ; L, 20-200 &mu ; L, 1000 &mu ; L)	EuroClone Spa, Milan, Italie	ECTD00010 ; ECTD00020 ; ECTD00200 ; ECTD01005	conseils pour
minuterie
Trypan Blue solution	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	15250061	coloration cellulaire pour évaluer la viabilité cellulaire
Trypsin	EuroClone Spa, Milan, Italie	ECM0920D	réactif de dissociation pour cellules adhérentes
Équipement de culture cellulaire
EVOS-FL	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA		Microscope fluorescent pour cellules vivantes
Incubateur de culture cellulaire humifié.	Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA	311 Forma Incubateur de COIncubateur ; TC 230	Incubation de cultures cellulaires à 37 ° ; C, 5 % CO2
Juli Microscope	Nanoentek
Réfrigérateur de laboratoire (4 ° ; C)
(Classe II)	Steril VBH 72 MP		Hotte à flux laminaire
Microscope optique	Zeiss
Centrifugeuse réfrigérée	Beckman Coulter
Bain
Matériaux de microfabrication  ;
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)	Sigma Aldrich	A3648	agent silanisant pour le collage de PDMS sur une lamelle en plastique
Masques en quartz de chrome / 4"x4 », HRC / No AZ  ;	MB W& A,  ; Allemagne		Masques optiques pour photolithographie
Lamelle de protection, D 263 M Verre Schott, etc. (170 ± ; 5 & micro ; m)	Ibidi, Allemagne	10812
Solution de peroxyde d’hydrogène 30 %	Carlo Erba Réactifs	412081	réactifs pour solution de piranha
Méthyl isobutyle cétone	Carlo Erba Réactifs	461945	PMMA E-beam résistant révélateur
Microscope Lames de verre (paquet de 50 lames) 76,2 mm x 25,4 mm  ;	Sail Brand	7101	substrats pour puces de collage
Poinçon de biopsie Miltex avec piston, ID 1,0 mm	Poinçons de biopsie cutanée	Tedpella
PMMA  ; 950 kDa	Allresist, Allemagne	AR-P. 679.04	Résines électroniques positives pour le motif des masques
optiques Lamelles de recouvrement non traitées en polymère	Ibidi, Allemagne	10813	substrats pour le collage de puces
Prime CZ-Si Wafer,  ; 4", (100), Dopé au bore	Gambetti Xenologia Srl, Italie	30255
Propan-2-ol	Carlo Erba Réactifs	415238
Acétate de monométhyléther de propylène glycol (PGMEA)	Sigma Aldrich	484431-4L	SU-8 résiste développeur SU-8
3005	Technologie de micro-réserve,Allemagne	C1.02.003-0001	Négatif Photoresists
SU-8 3050	Technologie des micro-réserves, Allemagne	C1.02.003-0005	Photorésines négatives
Suite de Biopunch, ID 4,0 mm, 6,0 mm, 8,0 mm	Tedpella	15111-40, 15111-60, 15111-80	Poinçons de biopsie cutanée pour réservoirs de copeaux
Acide sulfurique 96 %	Carlo Erba Réactifs	410381	réactifs pour solution de piranha
SYLGARD 184 Kit d’élastomère de silicone	Dowsil, Dow Corning	11-3184-01	Élastomère de silicone (PDMS)
Triméthylchlorosilane (TMCS)	Sigma Aldrich	92360-100ML	agent silanisant pour masters
Équipement de microfabrication
100 kV litographie par faisceau d’électrons	Raith-Vistec EBPG 5HR
plaque chauffante
Système de litographie optique	EV-420 Masque de contact double face-aligneur
de gravure ionique réactive	Oxford plasmalab 80 plus
Dessiccateur

<liquideHTB-26 colorant Colorant cellulaire fluorescent Embouts stériles la de micropipette Armoire de sécurité de laboratoire FDM thermostatique pour réservoirs de copeaux à motifs SU-8 Système Système sous vide