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Article de méthode

Modèles de co-culture microfluidique pour disséquer la réponse immunitaire dans des microenvironnements tumoraux in vitro

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DOI :

10.3791/61895

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30 avril 2021

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1CNR Institute for Photonics and Nanotechnology, 2Dept. of Oncology and Molecular Medicine, Istituto Superiore di Sanità, 3Istituto di Patologia Generale, Università Cattolica del Sacro Cuore, 4Tumor Immunology and Immunotherapy Unit, IRCCS Regina Elena National Cancer Institute

Dans cet article

Résumé

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire, la biologie du cancer nécessite de nouveaux outils in vitro et informatiques pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié. Nous décrivons des protocoles pour exploiter les co-cultures microfluidiques immunitaires contre les tumeurs dans des contextes 2D et 3D, compatibles avec la surveillance dynamique et multiparamétrique des fonctions cellulaires.

Résumé

Les modèles de maladies complexes exigent des outils de pointe capables de fournir des informations physiologiquement et pathologiquement pertinentes et exploitables, et de dévoiler des processus autrement invisibles. Des tests cellulaires avancés imitant étroitement le paysage in vivo s’imposent comme de nouvelles façons de visualiser et de mesurer l’interaction bidirectionnelle tumeur-hôte influençant la progression du cancer. Nous décrivons ici deux protocoles polyvalents pour recréer des co-cultures 2D et 3D hautement contrôlables dans des microdispositifs, imitant la complexité du microenvironnement tumoral (TME), sous immunosurveillance naturelle et induite par la thérapie. Dans la section 1, un cadre expérimental est fourni pour surveiller la diaphonie entre les cellules tumorales adhérentes et les populations immunitaires flottantes, par microscopie accélérée à champ clair. En tant que scénario applicatif, nous analysons les effets des traitements anticancéreux, tels que les inducteurs immunogènes de la mort des cellules cancéreuses sur le recrutement et l’activation des cellules immunitaires. Dans la section 2, les microenvironnements 3D immunitaires contre les tumeurs sont assemblés dans une configuration compétitive. L’infiltration immunitaire différentielle est surveillée par des instantanés de fluorescence jusqu’à 72 h, afin d’évaluer les stratégies thérapeutiques combinées. Dans les deux contextes, les étapes de traitement de l’image sont illustrées pour extraire une pléthore de paramètres des cellules immunitaires (par exemple, la migration et l’interaction des cellules immunitaires, la réponse aux agents thérapeutiques). Ces méthodes simples et puissantes peuvent être adaptées pour simuler la complexité du TME englobant l’hétérogénéité et la plasticité des sous-types de cellules cancéreuses, stromales et immunitaires, ainsi que leurs interactions réciproques en tant que moteurs de l’évolution du cancer. La conformité de ces technologies en évolution rapide avec l’imagerie à haut contenu de cellules vivantes peut conduire à la génération de grands ensembles de données informatives, ce qui pose de nouveaux défis. En effet, le triangle ''co-cultures/microscopie/analyse avancée de données'' ouvre la voie à un paramétrage précis du problème qui peut aider à des protocoles thérapeutiques sur mesure. Nous nous attendons à ce que l’intégration future de l’immunité contre le cancer sur puce avec l’intelligence artificielle pour le traitement à haut débit mette en synergie un grand pas en avant dans l’exploitation des capacités en tant qu’outils prédictifs et précliniques pour l’oncologie de précision et personnalisée.

Introduction

L’évolution des différentes branches de la médecine en tant que disciplines expérimentales a dépendu de la capacité à manipuler la population cellulaire et les fonctions des organes dans des conditions contrôlées1. Une telle capacité a ses racines dans la disponibilité de modèles mesurables capables de récapituler les processus qui se produisent dans notre corps.

À l’ère de l’immunothérapie et du profilage génomique unicellulaire 2, la biologie du cancer doit tirer parti des modèles in vitro et informatiques émergents pour étudier l’interface tumorale-immunitaire dans un contexte spatio-temporel approprié 2,3.

Le microenvironnement tumoral4 (TME) est un tissu complexe où les cellules cancéreuses interagissent continuellement et co-évoluent dynamiquement avec les autres composants cellulaires (cellules immunitaires, stromales et endothéliales) et non cellulaires (matrice extracellulaire, ECM). La nature dynamique de ce paysage complexe dicte si les cellules immunitaires jouent le rôle d’amies ou d’ennemies des cellules malignes, affectant ainsi fortement la progression de la maladie et la réponse au traitement. De nos jours, de grands efforts de la part des onco-immunologistes, des bioinformaticiens et des experts en biologie des systèmes convergent pour aborder la signification clinique de l’hétérogénéité du cancer 5,6, soit dans l’espace (c’est-à-dire dans des régions tumorales distinctes) et dans le temps (c’est-à-dire à des stades de progression tumorale distincts)5,6, et pour caractériser le phénotype et la fonction du cancer et des cellules immunitaires au niveau d’une seule cellule. À titre d’exemple de cette synergie, des techniques avancées de vision par ordinateur sont maintenant couramment utilisées pour la cartographie spatiale de l’infiltrat immunitaire dans les échantillons histologiques 7,8.

Sur le front des modèles expérimentaux, des études animales et des méthodes in vitro traditionnelles, les progrès de la microfluidique et des techniques de co-culture donnent accès à différentes classes de modèles cellulaires micro-modifiés tels que les organoïdes, les systèmes microphysiologiques 9,10,11 (MPS) et les organes sur puce12,13,14 (OOC). Ils partagent le trait commun de zoomer sur la vue d’ensemble des écosystèmes cellulaires et d’élargir le potentiel in vitro de contrôle des facteurs microenvironnementaux tout en exploitant la microscopie à haut contenu15 et les approches de traitement d’images.

De nos jours, les systèmes MPS et OOC de pointe ont commencé à inclure des aspects immunologiques, incorporant différents sous-types de cellules immunitaires dans les tissus existants et les co-cultures, afin d’explorer et de mesurer une variété de processus tels que les maladies inflammatoires, la cicatrisation des plaies, l’immunité muqueuse et la réponse aux toxines ou aux produits alimentaires quotidiens16. Les modèles TME-on-a-chip 10,11,12,13,14,15,16,17, également intégrés à des microvaisseaux perfusables 18,19,20,21, ont été développés pour étudier les interactions dépendantes du type cellulaire, les perturbations physiques et chimiques et l’activité cytotoxique des lymphocytes infiltrants22, ainsi que des agents immunomodulateurs cliniquement pertinents23.

Ici, nous fournissons des protocoles polyvalents, allant du chargement de cellules dans des puces à des outils de traitement d’image, pour exploiter des co-cultures microfluidiques avancées contre les tumeurs dans des paramètres 2D (section 1) et 3D (section 2)16, compatibles avec la surveillance et la visualisation dynamiques et multiparamétriques24 des fonctions cellulaires. Ceci est réalisé en maintenant la facilité d’utilisation et la flexibilité à la fois dans la gestion des échantillons et l’analyse des données, en tirant parti du logiciel gratuit Fidji et de ses boîtes à outils25,26.

Le dispositif microfluidique, décrit à la section 1, est conçu pour effectuer des co-cultures 2D de cancer adhérent et de cellules immunitaires flottantes. Cette plateforme a été validée pour la mesure in vitro du comportement des cellules immunitaires en présence de mutations génétiques27 et/ou d’immunodéficiences28. Ici, nous illustrons les étapes de suivi des cellules immunitaires dans des images en champ clair en accéléré, en exploitant une méthode semi-automatique basée sur Trackmate (un plugin implémenté dans le logiciel Fidji). Cette procédure permet d’extraire des descripteurs cinématiques de la migration immunitaire 29 et de la réponse (c’est-à-dire des temps d’interaction) pour cibler les cellules cancéreuses, traitées ou non avec des inducteurs immunogènes de mort cellulaire27.

Il est important de noter que ces paramètres, extraits d’images de séries chronologiques, peuvent être traités avec des machines mathématiques avancées. À titre d’exemple de la potentialité de cette approche, nos groupes ont récemment publié une analyse basée sur des méthodes mathématiques issues des processus stochastiques et de la mécanique statistique pour modéliser les propriétés du réseau cellulaire et fournir une description paramétrée du comportement des cellules immunitaires (c.-à-d. marche aléatoire biaisée ou non corrélée, mouvement hautement coordonnéou non 30,31).

Le réglage 3D, fourni dans la deuxième section, est basé sur un protocole de co-culture pour recréer des TME immunocompétents plus complexes intégrés dans deux régions de gel avec différentes combinaisons de types de cellules et de médicaments de manière compétitive. Ici, les étapes de traitement d’images sont décrites pour mesurer, à différents moments, l’infiltration de cellules immunitaires colorées dans des cellules de mélanome A375M humaines cultivées au sein de Matrigel, pour évaluer des combinaisons d’agents antitumoraux32. La lignée A375M, une lignée cellulaire dérivée de l’A375P caractérisée par un phénotype hautement métastatique a été choisie pour évaluer leur capacité métastatique en présence de cellules immunitaires32.

Les modèles décrits peuvent être entièrement conformes à différentes sources cellulaires (lignées cellulaires immortalisées ou primaires murines et humaines, organoïdes, xénogreffes, entre autres). Dans des études récentes de notre laboratoire, en combinant la microscopie vidéo à haut contenu avec l’analyse d’images, la disposition 3D compétitive a été appliquée pour étudier: i) une réponse immunitaire antitumorale (cytotoxicité à médiation cellulaire dépendante des anticorps, ADCC) et disséquer le rôle des fibroblastes dans la résistance au traitement par trastuzumab dans les modèles sur puce de cancer du sein HER2+ 33; ii) l’action des cellules myéloïdes (c’est-à-dire des macrophages associés au cancer) dans les mécanismes d’évasion tumorale et de recrutement des lymphocytes T34; iii) l’efficacité des régimes immunothérapeutiques, spécifiquement basés sur des cellules dendritiques conditionnées par l α’interféron (IFN-DC), cultivées avec des cellules cancéreuses du côlon traitées par des médicaments dans des matrices de collagène, et pour évaluer l’efficacité du mouvement et les événements de phagocytose qui en découlent35; iv) la migration chimiotactique des éosinophiles dérivés de la moelle osseuse vers les cellules de mélanome traitées ou non traitées par IL-3336.

Ces modèles avancés pourraient servir de fenêtres d’observation pour comprendre le rôle de la contexture immunitaire dans les métastases cancéreuses et les mécanismes de résistance, mais des efforts sont nécessaires pour traduire les résultats dans les cliniques, comblant ainsi l’écart avec la recherche fondamentale37.

En tant que scénario émergent, l’exploitation de la puissance de la microscopie automatisée à haut contenu couplée à l’utilisation de microsystèmes plus pertinents sur le plan physiologique ouvre de nouveaux défis potentiels pour la manipulation, le traitement et l’interprétation de centaines, voire de milliers, de gigaoctets de données multiparamétriques, qui peuvent être générées à partir d’une seule campagne expérimentale. Cela implique un lien direct entre les expériences OOC et les algorithmes basés sur l’intelligence artificielle 38,39,40,41,42 (IA) à la fois pour l’analyse automatisée avancée et la génération de fonctionnalités qui peuvent alimenter à leur tour des modèles in silico d’interaction cancer-immunité 43, avec de nouvelles applications passionnantes à l’horizon, telles que le développement de tests prédictifs de dépistage de médicaments 44.

Un flux d’efforts sans cesse croissant est axé sur la conception de modèles de maladies conjointement avec l’optimisation des stratégies pour mettre en œuvre les criblages de perturbation à grande échelle avec des lectures multi-omiques unicellulaires. Cela contribuera sans aucun doute au développement et, espérons-le, à la mise en œuvre clinique, accompagnée d’un degré approprié de normalisation des méthodes, d’une approche systématique onco-immunologie sur puce pour acquérir de nouvelles connaissances sur les troubles immunitaires et les mécanismes de dissémination du cancer.

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Protocole

1. Conception de puces pour les co-cultures 2D de cellules adhérentes et flottantes

REMARQUE : La disposition de co-culture 2D (Figure 1A-C) est caractérisée par trois chambres (100 μm de haut) reliées entre elles par deux ensembles de réseaux de microcanaux (500 x 12 x 10 μm3, L×W×H). La chambre intermédiaire forme deux compartiments fermés en cul-de-sac qui bloquent les cellules immunitaires flottantes débordant dans le site tumoral lors de l’étape de chargement 2.5. Ce type d’appareil est utile pour les mesures bidimensionnelles en temps réel de la motilité unicellulaire (adhérente ou flottante) et des interactions cellule-cellule 16,27,28,30,31. Une étude typique de migration cellulaire (menée de plusieurs heures à plusieurs jours) combine la microscopie de cellules vivantes avec des algorithmes de traitement d’images45, afin de traduire les séquences d’images acquises en caractéristiques numériques25. Sur la base des schémas migratoires, plusieurs indicateurs biophysiques peuvent être estimés, tels que le déplacement et la vitesse des cellules, ainsi que la durée des interactions entre les cellules immunitaires et les cellules cibles24.

  1. Préparation des cellules cancéreuses et PBMC
    1. Culture de cellules cancéreuses
      REMARQUE : MDA-MB-231 triple négatif [récepteur des œstrogènes (ER)-, récepteur de la progestérone (PR)-, et récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (HER2)-] les cellules d’adénocarcinome du sein humain sont couramment cultivées dans un milieu 1640 du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) supplémenté avec 10 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS), 2 mM de L-glutamine, 100 UI mL−1 de sel de sodium de pénicilline G et 100 μg de sulfate de streptomycine (milieu de croissance), dans des conditions de culture standard (37 °C et 5 % de CO2).
      1. Pour optimiser la croissance de la culture cellulaire, plaquez les cellules MDA-MB-231 dans des flacons de 75 cm2 à une densité de 1 × 106 cellules mL-1 dans 12 à 15 mL de milieu de croissance.
      2. Lorsque les cellules atteignent les 75-80% de la confluence, jeter le milieu de croissance, laver les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) préchauffée pour éliminer complètement le FBS, puis les détacher avec de la trypsine préchauffée (1 à 2 min à 37 ° C).
      3. Ajouter un milieu de croissance pour inactiver l’activité enzymatique de la trypsine et recueillir les cellules détachées. Laver les cellules deux fois pendant 5 min à 1 100 x g à température ambiante (RT).
      4. Compter les cellules d’une lame de comptage de cellules au moyen d’un test d’exclusion de colorant Trypan Blue, puis les réensemencer soit pour une culture d’entretien (pour pas plus de 6 passages de décongélation), soit pour des procédures expérimentales.
      5. Pour les expériences microfluidiques, ensemencer 1 × 10 6 cellules dans des plaques à6 puits dans 3 mL de milieu de croissance et traiter avec 25 μM de doxorubicine (DOXO) ou un volume égal de solvant DOXO (PBS) comme témoin.
      6. Quatre à 6 heures après, lavez les cellules traitées par DOXO deux fois avec du PBS préchauffé pendant 5 minutes à 1 100 x g à TA.
      7. Compter les cellules témoins traitées par DOXO et PBS comme ci-dessus (voir étape 1.1.1.5) et mettre la co-culture avec des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) dans des dispositifs microfluidiques.
    2. Isolement PBMC
      1. Prélever du sang total veineux (10 ml environ) de volontaires sains dans des flacons héparinisés et mélanger délicatement en retournant le tube 2 à 4 fois47.
      2. Diluer le sang 1:1 avec du PBS et déposer plus de 10 mL de Lymphoprep à gradient de densité dans un tube de 50 mL.
        REMARQUE: Assurez-vous de faire la stratification très doucement et lentement pour laisser le sang et Lymphoprep former deux couches distinctes.
      3. Tubes à centrifuger pendant 30 minutes à 400 x g à 4 °C dans un godet pivotant sans freins. Quatre couches distinctes se formeront : (i) du plasma au sommet, (ii) une couche blanche et trouble contenant des PBMC, (iii) du Lymphoprep, et (iv) une pastille d’érythrocytes et de granulocytes.
      4. Aspirer doucement les PBMC avec une pipette de 2 ml et les remettre immédiatement en suspension dans un milieu de croissance chaud (le même que celui utilisé à l’étape 1.1.1) et laver deux fois pendant 5 min à 1 100 x g à TA.
      5. Compter les PBMC granulés comme ci-dessus (voir étape 1.1.1.5) et les utiliser pour les procédures expérimentales ou les congeler pour les entreposer à long terme.
  2. Placage des cellules dans des puces 2D
    REMARQUE: Les PBMC ne sont pas tachés dans ce protocole. Pour caractériser des phénotypes spécifiques sur puce, les sous-populations de cellules immunitaires peuvent être isolées par sélection de billes immunomagnétiques, colorées avec des trackers cellulaires fluorescents, remélangées avec la fraction restante non marquée, et donc confrontées à des cellules cancéreuses cibles, comme indiqué dans les expériences sur puce, décrites dans Vacchelli et al.27, et dans Racioppi et al.34.
    1. Avant de commencer les expériences de co-culture et pour faciliter l’ajout de réactifs, activer les puces stockées par un traitement au plasma d’oxygène pendant quelques secondes. Remplissez immédiatement les réservoirs avec de l’eau désionisée ou du PBS pour maintenir les surfaces PDMS (polydiméthylsiloxane) hydrophiles jusqu’aux étapes de placage.
      REMARQUE: Le PDMS est intrinsèquement hydrophobe, ce qui peut entraîner des difficultés de fonctionnement et le piégeage des bulles d’air dans les microcanaux. Voir l’étape 7 du fichier supplémentaire fournissant des détails sur l’activation du plasma d’oxygène.
    2. Stériliser sous une armoire UV pendant 20 min, laver 2-3 fois avec du PBS frais, puis incuber avec un milieu de culture pendant 1 h. Conservez les copeaux dans l’incubateur jusqu’à ce que les étapes de placage soient effectuées.
    3. Retirer l’excès de milieu des six réservoirs. Veillez à ne pas aspirer les médias des principales chambres de culture.
    4. Appliquer lentement 1 × 105 cellules cancéreuses remises en suspension dans 10 à 20 μL de milieu de croissance dans le réservoir supérieur gauche, puis dans le puits inférieur (figure 1A, réservoirs 1 et 2). Attendez 5 minutes pour laisser les cellules adhérer dans la chambre tumorale. Certaines cellules vont se déposer et se fixer dans les réservoirs.
      REMARQUE: Insérez la suspension cellulaire à côté des ouvertures du canal. Cette procédure est appliquée aux cellules cancéreuses MDA-MB-231, d’autres lignées nécessiteront une optimisation de la densité cellulaire. Pour améliorer la fixation des cellules cancéreuses, une fonctionnalisation du revêtement des surfaces (par exemple, poly-L-lysine, fibronectine) peut être effectuée. Veuillez vous référer aux protocoles précédemment publiés pour les étapes de revêtement16, 48,49,50.
    5. Sur le côté droit, pipeter doucement 1 × 106 6 PBMC remis en suspension dans 50 μL de milieu de croissance dans les puits 3 et 4 (voir figure 1A, réservoirs 3 et 4).
      REMARQUE: Après l’écoulement, PBMC se répartira dans la chambre intermédiaire créant un « front », qui représente le point de départ de l’expérience.
    6. Remplissez les six réservoirs avec jusqu’à 100-150 μL de milieu de croissance. Au microscope, vérifier que les cellules se sont réparties correctement dans les compartiments de culture, comme illustré à la figure 1D-E. Les volumes finaux peuvent varier en fonction de la taille des réservoirs. Ajustez les volumes pour qu’ils soient égaux dans tous les puits.
    7. Replacez les puces dans l’incubateur pendant environ 1 h pour stabiliser le système avant l’enregistrement accéléré. Ajouter un milieu frais tous les 3 jours, car il peut être soumis à des pertes par évaporation.
      REMARQUE: Le système est compatible avec l’analyse des cellules vivantes / mortes et le profilage dynamique de la sécrétion de cytokines multiplex à partir de milieux conditionnés. Pour les analyses de chimiokines, jusqu’à 200-250 μL aliquotes de surnageants peuvent être accessibles en collectant des milieux dans les deux réservoirs de chaque compartiment. Les tests classiques de profilage des cytokines ELISA et Luminex nécessitent environ 50 μL de surnageants. Veuillez consulter 51,52 exemples d’études d’autres laboratoires effectuant le profilage des cytokines sur des modèles OOC.
  3. Acquisition accélérée de cellules cancéreuses et immunitaires non marquées
    REMARQUE: En règle générale, 3 puces sont disposées sur une seule lame de microscope (voir Figure 1A pour la puce 2D et Figure 4B pour la puce 3D). En utilisant des porte-étapes allouant 4 lames, les co-cultures peuvent être surveillées par microscopie automatisée à haute teneur pour analyser de grands lots de conditions expérimentales. Les puces peuvent être facilement montées sur des lames d’une épaisseur égale à 1 mm ou 170 microns (lamelles de couverture en plastique ou en verre, multi-puits optiques à 6 puits) pour l’imagerie confocale haute résolution.
    1. Enregistrez des séries d’images en fond clair de cellules non marquées au moyen d’une installation de microscopie vidéo équipée d’un système d’incubation.
      REMARQUE: Ici, des ensembles de données de séries chronologiques (fenêtre temporelle: 48 h, fréquence d’images: 2 min) ont été acquis avec un microscope à fluorescence, équipé d’un objectif 4x et CMOS 1,3 million de pixels, optimisés pour tenir dans un incubateur de culture cellulaire standard.
    2. Réchauffer le microscope pendant au moins 2 h pour l’équilibrer à 37 °C et 5% de CO2 avant de commencer l’acquisition.
    3. Sélectionnez la fenêtre d’observation en centrant le réseau de microcanaux entre la tumeur et le compartiment central. Cela permet de visualiser la dynamique de l’infiltration immunitaire et les interactions au sein de la région dans laquelle les cellules cancéreuses sont ensemencées.
    4. Ajustez l’intensité de l’éclairage et le foyer du cancer et des cellules immunitaires.
    5. Pour lancer l’acquisition time-lapse, optimisez la fréquence d’images et la durée en fonction de l’expérience et du type de cellule à l’étude.
      REMARQUE: Les conditions d’imagerie doivent être optimisées pour éviter une exposition excessive à la photo tout en maintenant un bon rapport signal sur bruit (SNR). Comme les cellules immunitaires sont très mobiles, la fréquence d’acquisition doit être suffisamment élevée pour suivre le processus dynamique d’intérêt et permettre un suivi facile53. Un compromis devrait être trouvé entre l’algorithme de suivi, la compatibilité avec la taille de l’ensemble de données résultant et la viabilité, la densité et la motilité des cellules observées.
    6. À la fin du time-lapse, utilisez la fonction Import Image Sequence et Save as du logiciel ImageJ pour convertir le jeu de données d’images dans un fichier vidéo non compressé de 25 ips.
      REMARQUE: Le fichier vidéo généré est maintenant prêt pour l’analyse de suivi cellulaire. Ici, des images RVB (1280x1024 pixels) ont été collectées avec une résolution spatiale de 1,33 μm/pixel. Un film d’une durée de 24 heures (pile de 3,5 Go) d’un seul champ de vision (FOV) se compose de 720 images pour chaque condition.
  4. Analyse des données : extraction semi-automatique des traces immunitaires non marquées par Trackmate
    REMARQUE: Ici, l’analyse de la motilité immunitaire dans les images time-lapse 2D non étiquetées est effectuée à l’aide de TrackMate54, une boîte à outils open source disponible dans le bundle logiciel Fiji/ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Plusieurs algorithmes sont fournis pour effectuer un suivi automatisé à une seule particule55(SPT) de structures ponctuelles. Ils ont été appliqués efficacement aux images fluorescentes, où les objets sont lumineux sur un fond sombre avec un rapport signaleur d’impact élevé (c.-à-d. taches fluorescentes à sous-résolution, vésicules de circulation marquées, noyaux)1,25,56,57,58. Le SPT est principalement basé sur deux étapes séquentielles. Tout d’abord, les objets sont localisés avec des positions identifiées dans plusieurs trames (segmentation), comme schématisé dansGraphique 2. Dans la deuxième étape (liaison de particules), les taches détectées sont liées sur des images consécutives pour estimer le mouvement et reconstruire leurs trajectoires, sous la forme d’une piste (Graphique 3). Les entités numériques peuvent être calculées à partir de chaque tableau de coordonnées X, Y, Z extrait au fil du temps. La documentation détaillée est signalée dans54ainsi qu’en ligne (http://imagej.net/TrackMate), en suivant le tutoriel Prise en main de TrackMate. La précision du processus peut être inspectée immédiatement, en gérant une interface utilisateur graphique intuitive (interface graphique de type assistant) qui permet aux utilisateurs, à chaque étape, de réajuster les paramètres. La partie suivante explique brièvement comment utiliser Trackmate pour les étapes de traitement et de quantification d’images, appliquées aux images en lumière visible :
    1. Faites glisser et déposez la pile vidéo / image à temps plein sur la barre d’outils Fidji.
    2. Configuration de la pile d’étalonnage (Figure 2A).
      1. Vérifiez la dimensionnalité et attribuez les propriétés de l’image en sélectionnant Propriétés de l’image> Propriétés. Remplissez les zones Unité de longueur, Dimensions des pixels et Intervalle d’image.
        REMARQUE : Pour effectuer l’étalonnage, utilisez la longueur connue des microcanaux (500 μm, figure 1C) et divisez par la longueur mesurée correspondante en pixels. Pour les séries chronologiques 2D, assurez-vous d’échanger le champ Z/T entrant 1 comme z-slice et le nombre correct d’images vidéo. S’ils ne sont pas réalisés, les résultats quantitatifs et les paramètres de Trackmate seront rapportés en unités de pixels et en périodes.
    3. Pré-traitement des images.
      1. Pour améliorer la discrimination correcte des cellules immunitaires à partir d’un arrière-plan bruyant, pré-traitez les images en champ clair pour compenser les artefacts. Assurez-vous que les jeux de données sont constitués d’images TIFF 8 bits (plage de luminosité : 0-255).
        REMARQUE: Un éclairage inégal, un faible rapport signal/bruit et une contamination par de petites particules de débris dans les images en lumière visible pourraient compromettre le succès d’un processus de suivi cellulaire. Ici, les jeux de données de séries chronologiques sont prétraités par soustraction d’arrière-plan, fonction de réglage de la luminosité / contraste et par soustraction locale d’une image gaussienne des images originales. Il existe d’autres boîtes à outils d’analyse différentes disponibles dans ImageJ pour le traitement et la segmentation d’images à contraste de phase ou en fond clair, y compris le seuil de gradient empirique (EGT)59.
    4. Premier panneau d’étalonnage (figure 2A)
      1. Avec la pile d’images sélectionnée, démarrez Trackmate (Plugins>Tracking).  Réviser/confirmer la dimensionnalité et la fenêtre temporelle des données (c.-à-d. largeur en pixels et intervalle de trame).
        REMARQUE: TrackMate lit automatiquement dans la zone de propriétés de l’image pour donner les résultats finaux de suivi en unités physiques calibrées (c’est-à-dire μm et minutes).
      2. Définissez une région d’intérêt pour calculer l’extraction des pistes immunitaires, en insérant manuellement des valeurs ou en dessinant une zone fermée sur l’image active, puis en appuyant sur le bouton Actualiser la source. Pour extraire les voies globales de migration immunitaire, sélectionnez des régions rectangulaires respectivement sur le côté droit des microcanaux (chambre centrale, Figure 1E) et sur la gauche (chambre tumorale, Figure 1D). Pour analyser les interactions entre le cancer et les points chauds immunitaires, dessinez des sous-régions circulaires à l’aide des outils de retour sur investissement (allez à Modifier → Sélection → Spécifier).
        REMARQUE: Lorsque vous exécutez pour la première fois cette boîte à outils sur une nouvelle application biologique, passez le temps nécessaire à optimiser les paramètres pour reconstruire les pistes.
        NOTE: Effectuer un suivi manuel des trajectoires des cellules (environ 50-100 cellules) pour trouver empiriquement la bonne configuration et ensuite valider comme référence la fiabilité de l’extraction automatique des mouvements. De plus, travaillez d’abord sur une zone plus petite pour vérifier facilement la précision des paramètres choisis.
    5. Étape de détection des points immunitaires (Figure 2B)
      1. Sélectionnez le détecteur Laplacien de Gauss (LoG) par défaut. Le détecteur LoG permet de trouver des objets brillants, ressemblant à des blobs et arrondis et d’appliquer un filtre laplacien de gaussien sur l’image réglée pour des tailles de points intermédiaires (5 à 20 pixels de diamètre).
      2. Dans Diamètre estimé du blob (ici, 10-13 μm), entrez une valeur légèrement supérieure à la taille du spot attendue. Augmentez la valeur du seuil (ici de 1 à 3 μm) jusqu’à ce que les taches d’arrière-plan parasites supplémentaires soient réduites, éventuellement sans supprimer les caractéristiques de l’objet. Les détections inférieures à la valeur seuil (basées sur une mesure de qualité) seront éliminées de l’analyse ultérieure. Cochez la case du filtre médian et de la localisation des sous-pixels pour améliorer la qualité de la détection des taches.
      3. Utilisez le bouton Aperçu pour afficher et inspecter rapidement les cellules immunitaires identifiées superposées sur les images par des cercles de couleur magenta.
        REMARQUE: Les erreurs lors de la détection auront un impact considérable sur le processus de liaison. D’autres détections indésirables peuvent être corrigées dans les menus suivants par des filtres définis par l’utilisateur (c’est-à-dire par intensité, taille ou position du spot).
    6. Une fois satisfait des sélections, appuyez sur Suivant.
      REMARQUE : Ces paramètres peuvent varier en fonction de la configuration expérimentale et des modalités d’imagerie d’acquisition (p. ex., FOV, grossissement objectif, images en fond clair ou fluorescentes), du type de cellule (cellules adhérentes ou flottantes), de la motilité lente ou rapide, du type de comportement cellulaire (en interaction ou non) et de la densité faible/moyenne/élevée dans la zone d’observation.
    7. Continuez et ignorez le menu Initialing (Seuil initial). Sélectionnez la fenêtre Hyperstack Displayer.
    8. Définissez des filtres sur le panneau Spots (Figure 2C).
      1. Sélectionnez : Couleur uniforme. Des filtres, comme le montre la figure 2C, peuvent être ajoutés pour conserver les points étiquetés avec des valeurs de caractéristique, affichées dans un histogramme, au-dessus ou au-dessous d’un seuil réversible.
    9. Étape de sélection du tracker (Figure 3A). Choisissez le tracker LAP simple, comme algorithme de liaison de particules demandant trois champs à remplir (dans ce cas, « Distance maximale de liaison »: 30-50 μm, « Distance maximale de fermeture de l’écart »: 25-50 μm, « Écart maximal de fermeture de l’écart »: 4-6). Ce détecteur gère les événements de réduction des lacunes, avec un calcul de liaison des coûts uniquement basé sur leur distance respective.
      REMARQUE : La distance de liaison maximale autorisée limite la plage de recherche spatiale pour les points correspondants candidats, correspondant au déplacement maximal autorisé parcouru entre deux images suivantes (Figure 3D).
      1. Fournir des valeurs plus élevées de déplacement maximal lorsque la fragmentation des traces de particules très mobiles est remarquée.
        Remarque : Deux liaisons ne seront pas connectées si le mouvement image à image est plus grand que la valeur de distance maximale donnée. Si les segments relient mal deux cellules différentes, diminuez la valeur du déplacement maximal.
      2. Essayez de reconnecter les points manquants, en faisant varier les valeurs de « la distance maximale pour la fermeture de l’espace » et « l’écart maximal de l’image ».
        Remarque : Ces paramètres traitent des événements de fermeture d’écart dans les trames non adjacentes. La disparition des taches peut se produire pour certaines images (p. ex., particules floues, cellules sortant et dans le champ de vision, échecs de segmentation dans une image bruyante).
        REMARQUE: Pour gérer les événements de division ou de fusion, optez pour LAP linker comme détecteur qui introduit des pénalités de matrice de coûts de liaison.
    10. Cliquez sur Suivant pour exécuter le calcul de suivi. Appuyez sur Suivant.
    11. Panneau Filtrage des pistes (Figure 3B). Changez la couleur des chemins immunitaires en sélectionnant, dans le menu déroulant, « ID de piste » ou d’autres fonctionnalités de piste. À ce stade, choisissez éventuellement de définir des filtres interactifs fonctionnels, afin d’améliorer la qualité du résultat et de revoir la procédure.
      REMARQUE: Les taches parasites proviennent du bruit dans l’image et de la perte de qualité des caractéristiques. Cela générera des segments courts tandis que les cellules d’intérêt peuvent être suivies sur de nombreuses images.
      1. Pour supprimer les chemins courts, essayez de filtrer en fonction du nombre de taches qu’ils contiennent. En outre, triez les pistes à l’aide d’une combinaison d’options telles que le déplacement de piste, la durée de la piste ou la vitesse minimale/moyenne/maximale pour exclure les pistes fausses ou indésirables (avec moins d’images par rapport à la durée totale du laps de temps ou impliquant des particules sales ou non mobiles) du post-traitement ultérieur.
        REMARQUE: Le choix des filtres peut varier en fonction de l’application spécifique et du système biologique.
    12. Examinez toutes les pistes de l’interface Options d’affichage, faites défiler le temps et vérifiez la précision des pistes correspondant aux chemins de migration des cellules. Le menu déroulant fournit des codes de couleur pour les points et les chemins pour faciliter la visualisation et le filtrage selon plusieurs modalités (par exemple, paramètres cinétiques, intensité, position temporelle ou spatiale).
      REMARQUE: Pour le suivi de cultures à haute densité ou de cellules à forte mobilité, augmentez la fréquence d’acquisition en minimisant le déplacement des cellules dans des intervalles de temps consécutifs.
    13. Correction manuelle des erreurs de segmentation et de liaison (Figure 3E).
      1. Pour améliorer encore la qualité des résultats, modifiez manuellement les taches (particules de débris, cellules stationnaires) et supprimez les traces erronées dérivant des limites tumorales détectées lors de l’analyse des ROI de l’interaction tumorale-immunité.
      2. Tout d’abord, sélectionnez l’outil TrackMate dans la barre d’outils ImageJ. Pour éliminer un spot existant dans toute la pile, appuyez sur Maj et créez par le curseur de la souris un masque ROI sur le point cible (édité dans un cercle vert), puis appuyez sur la touche SUPPR.
      3. Pour ajouter un nouveau spot (en cas de pistes manquantes dues à la disparition de spots), appuyez sur la touche A, en plaçant la souris à l’emplacement pointé. Répétez le processus de calcul de liaison de pistes après cette étape.
    14. Lorsque vous êtes satisfait, sélectionnez Analyse dans le panneau Options d’affichage pour générer trois fichiers texte (Figure 3C et 3F). Le tableau dans « Spots in tracks statistics » fournit les coordonnées spatio-temporelles des taches immunitaires (positions X-Y-Z des cellules étiquetées avec le cadre associé et le numéro de piste). Les « Liens dans les statistiques des pistes » et les « Statistiques de piste » contiennent des informations relatives aux pistes: durées des pistes, nombre de lacunes ou de points détectés, initiale de la piste et stop-frame, etc. Enregistrez et exportez pour chaque jeu de données.
      REMARQUE: Lorsque vous cliquez sur une ligne dans les fenêtres de résultats, le spot, le lien ou la piste respectif est activé dans la vidéo time-lapse pour une inspection visuelle. Répétez les étapes de filtrage pour sélectionner/supprimer des pistes. Toutes les données exportées à l’avenir seront mises à jour. CONSEIL : Les valeurs de suivi initial et stop-frame et de durée de piste peuvent être exploitées pour calculer les temps de contact entre le cancer et les cellules immunitaires lors du traitement des ROI d’interaction.
    15. Appuyez sur le bouton Enregistrer pour générer un fichier XML résultant contenant toutes les valeurs des paramètres, le chemin d’accès aux images et les positions ponctuelles dans le temps. La commande ''Load TrackMate'' (Plugins> Tracking) restaure l’ensemble de la session de processus pour chaque fichier vidéo individuellement.
    16. Accédez au dernier panneau de l’interface graphique appelé Sélectionner une action. Dans la liste, utilisez la fonction de superposition de capture> d’exécution pour produire une vidéo avec des pistes superposées. CONSEIL : L’option « Tracer les points N en fonction du temps » peut être utilisée pour calculer la densité spatiale des cellules immunitaires dans un retour sur investissement (Figure 6B, panneau de droite).
    17. Analyse post-traitement et statistiques de migration
      1. Analyser les données de position brutes directement dans Trackmate ou exporter les données pour calculer des paramètres cinétiques complets29 (c.-à-d. longueur totale de la trajectoire, distance euclidienne, rapport de confinement, déplacement quadratique moyen56, vitesse moyenne ou instantanée de la trajectoire, coefficient d’arrêt, distribution des angles de migration, indice de migration vers l’avant, vitesse moyenne en ligne droite) pour classer le comportement de migration des cellules immunitaires (p. ex., mouvement dirigé ou diffusif30, 31) et la réponse aux cellules cancéreuses cibles (p. ex. traitées vs témoins).
        REMARQUE : D’autres plug-ins utiles tels que L’outil de chimiotaxie et de migration (http://ibidi.com/software/chemotaxis_and_migration_tool/) fournissent divers graphiques (par exemple, des diagrammes de rose ou de secteurs, tels que illustrés à la figure 6) et des tests statistiques pour une analyse et une visualisation avancées des données expérimentales de migration et de chimiotaxie. La combinaison d’algorithmes de suivi cellulaire et de segmentation cellulaire24,25,45 peut permettre de mesurer les paramètres morphologiques au niveau de la cellule unique (c.-à-d. la surface cellulaire, la longueur des axes principal et mineur et le rapport hauteur / largeur de la cellule).

2. Modèle 3D immuno-compétent de cancer sur puce dans un test compétitif

REMARQUE: La conception de la puce 3D, représentée à  lafigure 4, se compose de 5 compartiments principaux: un compartiment central pour l’apport en cellules immunitaires flottantes, deux régions latérales pour l’incorporation des cellules tumorales dans des matrices d’hydrogel (150-250 μm de haut) et des chambres de perfusion de milieux. Les chambres immunitaires et tumorales sont reliées par deux ensembles de réseaux étroits de microcanaux (200×12×10 μm3, L×W×H, Figure 4E). Régulièrement des micropiliers isocèles trapézoïdaux espacés de 100 μm (environ 25-30 interfaces pour chaque région de gel latéral, Figure 4C) agissent comme des barrières pour confiner la solution de gel pendant l’injection en exploitant l’équilibre entre la tension superficielle et les forces capillaires60,61 et relient les régions tumorales aux deux chambres de média latérales supplémentaires afin de définir une interface gel-liquide (Figure 5). Les caractéristiques détaillées du test compétitif 3D sont présentées à la figure 4. La migration préférentielle des cellules immunitaires vers les deux compartiments hydrogel hébergeant des cellules tumorales ayant subi différents traitements peut être surveillée et quantifiée. La configuration concurrentielle particulière peut être appliquée pour étudier une pléthore de phénotypes de biologie du cancer différents (par exemple, résistant aux médicaments vs agressif, primaire ou métastatique, répondeur vs non-répondeur). De plus, les régions intégrées au gel peuvent être facilement intégrées à différentes populations cellulaires pour recréer des ETM plus hétérogènes, y compris des composants stromaux (fibroblastes, cellules endothéliales)23 ou pour simuler un milieu immunosuppresseur spécifique34 (par exemple, les macrophages) pour disséquer les mécanismes de résistance aux médicaments et d’évasion tumorale.
REMARQUE : La coloration nucléaire et active des caspases, à l’aide de trousses commerciales pour les essais vivants/morts (p. ex. Thermo Fisher Scientific, réactifs pour incucytes), peut être mise en œuvre pour évaluer les décès mitotiques ou apoptotiques, comme indiqué dans Nguyen et coll.33.

  1. Préparation de la solution matricielle avec les cellules et chargement dans l’appareil
    REMARQUE : Dans le contexte expérimental suivant, les deux régions de gel contiennent des mélanges de lignées cellulaires de mélanome A375M humaines, cultivées en solution matricielle (p. ex. Matrigel), exposées à des agents thérapeutiques utilisés en monothérapie ou en combinaison. Ce paramètre nous a permis d’évaluer l’efficacité d’une combinaison de deux médicaments par rapport à des médicaments uniques de manière compétitive et de quantifier leur capacité à attirer les PBMC.
    1. Décongeler un stock de solution matricielle (p. ex., Matrigel) en le plaçant sur de la glace dans un réfrigérateur à 4 °C un jour avant l’expérience.
      REMARQUE : N’exposez pas le produit à plusieurs cycles de congélation-décongélation, car il devient « grumeleux ». D’autres protocoles d’hydrogels synthétiques ou naturels peuvent convenir à cette utilisation. Veuillez vous référer à 33,34,35 pour la préparation des cellules cancéreuses dans les matrices de collagène.
    2. Resuspendre les cellules de mélanome humain A375, colorées avec un agent de liaison fluorescent vert PKH67 compatible vivant dans une solution matricielle (2 mg mL-1). Lorsque cela est indiqué, ajouter la 5-aza-2'-désoxycytidine (DAC; 2,5 μM), appelée DAC, et/ou l’IFN-α2b, appelée IFN, aux doses appropriées32.
      REMARQUE: Faites correspondre le # de lot sur la fiche technique de la bouteille matricielle. En fonction de la concentration, calculer le volume de milieu nécessaire pour obtenir jusqu’à 2 mg mL-1 Veuillez ajuster la concentration optimale de protéines et la concentration de suspension de cellules cancéreuses en fonction de votre application d’intérêt.
    3. Pipeter soigneusement de haut en bas pour éviter la génération de bulles. Gardez le tube de microcentrifugeuse sur de la glace pendant le mélange pour éviter toute polymérisation indésirable.
    4. Après la stérilisation, placez les dispositifs sur de la glace (à l’aide d’un seau à glace et d’un couvercle) pour éviter la solidification de la solution matricielle pendant toute la procédure de chargement des cellules.
    5. Injectez lentement les deux mélanges de cellules matricielles IFN et DAC/IFN (2 à 4 μL) dans l’orifice de gel gauche et droit, respectivement à l’aide d’une micropipette de 10 μL à l’aide d’embouts froids (Figure 5A). Appliquez une légère pression pour pousser la solution matricielle d’un côté jusqu’à ce qu’elle atteigne le côté opposé.
      NOTE: Le volume de la solution matricielle a été choisi pour éviter de déborder dans les canaux adjacents. N’exercez pas une pression de pipetage excessive pour empêcher la solution de s’infiltrer dans les médias et les canaux centraux. Si, pendant le chargement, le chemin du gel est bloqué le long du canal, essayez d’insérer la solution de l’autre entrée jusqu’à ce que les fronts de gel se rencontrent. Lorsque vous retirez la micropipette des entrées, maintenez le piston, sinon la pression négative aspirera la solution matricielle.
    6. Placer le dispositif dans un incubateur en position verticale à 37 °C et 5% de CO2 pendant 30 minutes pour permettre la gélification de la solution matricielle (Figure 5B). Manipulez avec soin les puces avec un gel non polymérisé incorporé pour éviter les fuites hors du canal de gel.
    7. En attendant, resuspendre les PBMC marqués PKH67 (1x106 cellules) dans 10 μL de DMEM complet (milieu d’aigle modifié de Dulbecco).
    8. Après la gélification matricielle, remplir les canaux du milieu avec (50-100 μL) la même partie aliquote du milieu de culture dans les six réservoirs pour empêcher le gel de séchage dans les copeaux. Conserver en incubateur jusqu’à l’ensemencement de la suspension des cellules immunitaires.
      REMARQUE: Vérifiez au microscope la distribution correcte et homogène des cellules tumorales dans le gel et l’intégrité des barrières de gel polymérisé. Des régions gelées partiellement ou non uniformes ou des bulles dans le mélange conduisent à l’écoulement prématuré des PBMC dans les canaux de milieu de gel au point de départ de l’expérience en raison des fluctuations initiales de la pression.
    9. Aspirer le média des six puits et positionner l’embout près de l’entrée d’un canal de média pour injecter doucement avec une suspension de cellules PBMC à pression modérée. La séquence temporelle de chargement est représentée à la figure 5C :
      1. PBMC dans un milieu de 10 μL dans le puits central supérieur.
      2. 50-100 μL de milieu dans chacun des quatre puits de canaux latéraux.
      3. Milieu de 40 à 90 μL dans le puits central supérieur.
      4. 50-100 μL de milieu dans le puits central inférieur.
    10. S’assurer au microscope que la distribution des PBMC reste confinée dans la chambre centrale après l’étape de chargement. (figure 7A).
      REMARQUE: Si ce n’est pas optimal, ajustez la concentration si nécessaire et répétez les étapes d’ensemencement en utilisant des copeaux immaculés. Lors du calcul des volumes pour les conditions expérimentales prévues, se référer à un nombre excessif de puces (15-20%) pour tenir compte des erreurs et ajustements potentiels. Les volumes et les concentrations doivent être optimisés en fonction de l’application spécifique.
    11. Placer les dispositifs assemblés sur une surface plane dans l’incubateur à 37 °C et 5% de CO2 pour l’acquisition ultérieure de l’imagerie par fluorescence. Manipuler avec soin les puces après avoir chargé les cellules immunitaires qui flottent.
      NOTE: Compenser les pertes par évaporation des volumes dans les réservoirs en remplaçant le milieu tous les 2-3 jours. Pour le profilage des chimiokines, jusqu’à 100 μL de chacun des deux puits des compartiments de culture peuvent être aspirés, veuillez vous référer à l’étape 2.7, à l’étape 1.
  2. Comptage automatisé des PBMC recrutés dans des images fluorescentes monocanal dans ImageJ
    REMARQUE: Les méthodes classiques d’immunofluorescence pour l’imagerie confocale à haute résolution peuvent être appliquées aux opérations sur puce en tant que mesures de point final. La procédure de coloration de base implique la fixation sur puce des cellules, la perméabilisation, le blocage, la liaison aux anticorps, la coloration des noyaux avec des étapes de lavage entre les deux. Les cellules immunitaires non marquées infiltrées dans les régions de gels 3D avec des microenvironnements cancéreux intégrés peuvent être fixées aux points temporels souhaités et colorées pour les marqueurs d’expression de l’activation/épuisement/maturation (p. ex., pour les cellules CD8, surveillance des marqueurs CD69, CD95, PD1, TIM3). Dans Parlato et al.35, la phagocytose des cellules apoptotiques SW620 a été évaluée par microscopie confocale, à l’aide de dispositifs montés sur des lamelles de couverture de 170 μm d’épaisseur. Les IFN-DC ont été colorés en ajoutant des aliquotes Ab anti-humains HLA-DR-FITC sur puce.
    Pour calculer l’étendue des cellules immunitaires vivantes colorées par fluorescence infiltrées mises au défi par des signaux concurrents, un flux de travail d’analyse d’image commun est défini comme suit (Graphique 7D-G):
    1. Acquérir, à des critères d’évaluation temporels spécifiques, des microphotographies de contraste de phase et de fluorescence des canaux rouge/vert des régions de gel gauche et droite contenant des cellules tumorales respectivement exposées à un seul régime pharmacologique ou à des combinaisons de ceux-ci.
      NOTE: Ici, les images ont été capturées par un microscope à fluorescence EVOS-FL après chargement cellulaire (0 h), après 48 h et après 72 h d’incubation (Figure 7A-B). Un grossissement 4x-10x a été utilisé pour acquérir la chambre centrale, les réseaux de microcanaux et les deux canaux latéraux juxtaposés contenant A375 plus IFN et A375 plus DAC/IFN.
      1. Lors de la réalisation d’opérations d’acquisition, tenez compte des paramètres à mesurer et évitez la saturation des entités à comptabiliser. Les résultats optimaux de segmentation dépendent de la nature des images acquises, en raison de la variabilité des échantillons biologiques eux-mêmes, de la qualité de la coloration et des techniques de microscopie utilisées pour les applications orientées utilisateur.
    2. Charger les données de fluorescence monocanal (dans ce cas rouge = PBMCs), aux Fidji en les faisant glisser dans la fenêtre principale (Figure 7D). Dupliquez l’image pour éviter d’écraser les données brutes lors de la sélection des filtres de prétraitement jusqu’à la segmentation finale.
      1. Si l’image est une image couleur (RVB), appuyez sur Image > Type 8 ou 16 bits pour convertir en niveaux de gris. Vérifiez que Modifier les options > > Conversions est défini sur la mise à l’échelle lors de la conversion.
    3. Prétraitement des données brutes via le nettoyage du bruit et des artefacts.
      1. Accédez au menu Traiter > soustraire l’arrière-plan en appliquant l’algorithme de la bille roulante pour corriger le bruit de fond inégal avec de grandes variations spatiales d’intensités. Définissez le rayon au moins sur la taille de la plus grosse particule de premier plan. Choisissez la case Aperçu pour la procédure d’essai et d’erreur afin d’obtenir des résultats optimaux. Des valeurs trop petites peuvent supprimer à tort les structures d’intérêt.
      2. Dans la commande Luminosité et contraste, faites glisser les curseurs Minimum/Maximum pour modifier la plage d’intensités dans l’histogramme. Déplacez le curseur Maximum vers la gauche pour augmenter la luminosité, sans fonctions de délavage. Déplacez la diapositive Minimum vers la droite pour augmenter le contraste de l’image en évitant la disparition des caractéristiques moins visibles en arrière-plan. Cliquez sur Appliquer pour corriger les modifications.
    4. Amélioration de l’image.
      1. Accédez à Process > Filters (Traiter filtres) et expérimentez les filtres gaussiens médians sur les images (Figure 7E).
        REMARQUE: Le rayon de préfiltrage doit être adapté aux pixels de bruit de l’image. Le filtre Médiane non linéaire remplace la valeur en pixels par la valeur médiane des voisins, afin de réduire le bruit poivre et sel. Le « Flou gaussien » est utilisé pour lisser une image numérique, en remplaçant les pixels par une moyenne pondérée des pixels environnants. Les poids proviennent de la distribution de probabilité gaussienne, de sorte que les pixels les plus proches sont plus influents.
      2. Accédez éventuellement à Traiter > mathématiques > Gamma avec la case Aperçu cochée pour augmenter le contraste.
        REMARQUE: Les intensités définies dans le panneau B & C sont mises à l’échelle entre les deux limites min et max. Les valeurs < 1,0 accentuent les différences entre les intensités faibles, tandis que les valeurs > 1,0 accentuent les différences entre les intensités élevées. La correction gamma est fonctionnelle pour trouver une plage d’affichage, montrant les objets les plus sombres sans saturer les plus lumineux.
    5. Création d’un masque d’image binaire.
      1. Accédez à Image > ajustez > seuil. La méthode la plus simple utilisée pour déterminer les seuils repose sur l’analyse histogramme des niveaux d’intensité, comme le montre la figure 7F. Dans le menu déroulant, jouez avec différentes méthodes de seuillage global (dans notre cas, Otsu est appliqué).
      2. Faites défiler manuellement ou tapez une plage connue d’intensités de pixels dans les panneaux d’histogramme, observez le changement du motif rouge superposant l’image qui ressemble principalement à la zone réelle de la cellule. Le bouton Réinitialiser supprime la superposition. Une fois satisfait, cliquez sur Appliquer pour générer une version binaire de l’image. Cochez Options de > de processus > binaires pour contrôler l’affichage des images avec seuil et l’identification des objets par l’analyseur de particules.
    6. Utilisez la commande de menu Processus/Binaire/Particules du bassin versant pour diviser les particules qui se chevauchent partiellement ou fusionnent pendant le seuil. Le bassin versant peut souvent les séparer avec précision en ajoutant une ligne épaisse de 1 pixel. Effectuez des opérations morphologiques telles que les opérations de dilatation ou d’érosion pour agrandir ou supprimer les pixels des pixels sous-saturés ou sursaturés.
      REMARQUE: Pour plus d’informations, consultez la section Commandes de menu ou reportez-vous à MorphoLibJ, une bibliothèque intégrée basée sur la morphologie mathématique pour traiter les données binaires.
    7. Description quantitative de la fonction d’image.
      1. Une fois la reconnaissance d’objet satisfaisante obtenue, ouvrez l’analyseur de particules de Analyser > Analyser les particules. Les particules peuvent être exclues par leur taille et leur circularité, exprimées en pixels ou dans une unité de mesure calibrée (vérifiez l’échelle correcte par rapport aux paramètres du microscope sous Propriétés de l’image >). Pour tout inclure, conservez la valeur par défaut de 0-Infinity et la plage de circularité par défaut à 0,00 - 1,00 (0 = ligne droite, 1 = cercle parfait).
      2. Pour filtrer les petits pixels « bruit » ou les entités qui n’ont pas d’intérêt, définissez la plage minimale et maximale. Cochez les options Inclure les trous, Afficher, Contour et Afficher les résultats dans le champ de la fenêtre. Exclure sur les bords éliminera les particules détectées sur les bordures de l’image. Ajouter au gestionnaire ajoute la sélection obtenue au gestionnaire de retour sur investissement pour une analyse plus approfondie en conservant les informations de position de la particule.
        REMARQUE: Dans le « ROI Manager », il est possible de corriger la segmentation automatique de la sortie enregistrée (fusionner les cellules divisées, diviser les cellules fusionnées). Sélectionnez, à l’aide des outils de sélection de la barre d’outils Fidji, les ROI à l’intérieur des deux régions de gel où les cellules cancéreuses sont intégrées pour estimer l’infiltration immunitaire.
    8. Exportez les valeurs obtenues vers une feuille de calcul pour effectuer une analyse statistique, comme illustré à la figure 7G. « Résultats » énumère un tableau de données relatif aux propriétés des particules numérotées identifiées. « Résumer » ouvre une fenêtre avec le nom de l’image, le nombre total et d’autres informations pour l’image entière.
      1. Allez à Analyser > Définir les mesures pour inclure un large éventail de paramètres.
    9. Enregistrez éventuellement une macro (en sélectionnant Plugins > Macros > Record) pour automatiser le flux de travail de traitement et gagner du temps d’analyse sur de grands ensembles de données.
      1. Utiliser la même routine de traitement pour analyser le canal de fluorescence vert dans les mêmes régions afin d’analyser les changements morphologiques des cellules tumorales dans les régions 3D16

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Résultats

L’infiltration immunitaire tumorale est un paramètre de la réponse antitumorale de l’hôte. Les tumeurs sont hétérogènes dans la composition, la densité, l’emplacement et l’état fonctionnel des leucocytes infiltrants dont les interactions avec les cellules cancéreuses peuvent sous-tendre des informations cliniquement pertinentes pour prédire l’évolution de la maladie et la réponse au traitement. En ce sens, les technologies microfluidiques pourraient être utilisées comme des outils in vitro complémentaires et privilégiés ...

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Discussion

Les méthodes décrites tentent de concevoir une approche générale pour récapituler, avec un degré de complexité modulable, deux aspects significatifs dans le domaine de l’onco-immunologie, qui peuvent bénéficier de l’adoption de modèles in vitro plus pertinents. Le premier concerne le côté de la population de cellules tumorales, où s’attaquer aux caractéristiques des cellules uniques peut conduire à une meilleure description de l’hétérogénéité et de la signification biologique et clinique corrélée, y compris la résistance...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer. AS est soutenu par la Fondazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC, Start-Up 2016 #18418) et Ministero Italiano della Salute (RF_GR-2013-02357273). GS et FM sont soutenus par l’Association italienne pour la recherche sur le cancer (AIRC) no. 21366 à G.S.).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
forts » ; Tubes
50 mLCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOCLS430828tubes à centrifuger
5-aza-2'-désoxycytidine DACMillipore-Sigma ; St. Louis, MOA3656Agent hypométhylant d’ADN
Plaques à 6 puitsCorning-Sigma Aldrich, St. Louis, MOBoîtes de culture CLS3506
75 cm2 Flacontraité pour culture cellulaireCorning, New York, NY430641Uflacons de culture
A365MAmerican Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VAbr/> CVCL_B222lignée cellulaire de mélanome humain
Chlorhydrate de doxorubicineMillipore-Sigma ; St. Louis, MOD1515antibiotique anthracycline  ;
Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEMEuroClone Spa, Milan, ItalieECM0728LMilieu de culture pour cellules SK-MEL-28
Dulbecco’s Phosphate Buffer Saline sans calcium sans magnésiumEuroClone Spa, Milan, ItalieECB4004Lsolution tampon saline
Sérum de veau fœtalEuroClone Spa, Milan, ItalieECS0180Lauxiliaire pour la culture cellulaire
FicollGE-Heathcare17-1440-02séparation des cellules mononucléées du sang humain.
hémocytomètreNeubauerCompteur de cellules
Flacons héparinésThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAFlacons pour prélèvement de sang veineux
interféron alpha-2bMillipore-Sigma ; St. Louis, MOSRP4595cytokine humaine recombinante
L-Glutamine 100XEuroClone Spa, Milan, ItalieECB3000Dauxiliaire pour la culture cellulaire
Azote
Milieux de séparation cellulaire des lympholytesCedarlane Labs, Burlington, CanadaSéparation des lymphocytes par centrifugation à gradient de densité
LymphoprepAxis-Shield PoC AS, Oslo, Norvège
MatrigelCorning, New York, NY354230facteur de croissance matrice de membrane basale
réduite MDA-MB-231  ;American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, Virginie Lignée cellulaire de cancer du sein humain
Pénicilline/Streptomycine 100X  ;   ;EuroClone Spa, Milan, ItalieECB3001Dauxiliaire pour la culture cellulaire
Aide à la pipetteDrummond Scientific Co., Broomall, PA4-000-201Manipulation de liquides
PKH26 Rouge Fluorescent cell linkerMillipore-Sigma ; St. Louis, MOPKH26GLcellulaire fluorescent rouge
PKH67 Connecteur cellulaire fluorescent vertMillipore-Sigma ; St. Louis, MOvert PKH67GL
RPMI-1640EuroClone Spa, Milan, ItalieECM2001LMilieu de culture pour pipettes sérologiques à cellules MDA-MB-231
(2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL, 50 mL)Corning- Millipore-Sigma ; St. Louis, MOCLS4486 ; CLS4487 ; CLS4488 ; CLS4489 ; CLS4490pour la manipulation
des liquides (1-10 &mu ; L, 10-20 &mu ; L, 20-200 &mu ; L, 1000 &mu ; L)EuroClone Spa, Milan, ItalieECTD00010 ; ECTD00020 ; ECTD00200 ; ECTD01005conseils pour
minuterie
Trypan Blue solutionThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA15250061coloration cellulaire pour évaluer la viabilité cellulaire
TrypsinEuroClone Spa, Milan, ItalieECM0920Dréactif de dissociation pour cellules adhérentes
Équipement de culture cellulaire
EVOS-FLThermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MAMicroscope fluorescent pour cellules vivantes
Incubateur de culture cellulaire humifié.Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA311 Forma Incubateur de COIncubateur ; TC 230Incubation de cultures cellulaires à 37 ° ; C, 5 % CO2
Juli MicroscopeNanoentek
Réfrigérateur de laboratoire (4 ° ; C)
(Classe II)Steril VBH 72 MPHotte à flux laminaire
Microscope optiqueZeiss
Centrifugeuse réfrigéréeBeckman Coulter
Bain
Matériaux de microfabrication  ;
3-Aminopropyl)triethoxysilane (Aptes)Sigma AldrichA3648agent silanisant pour le collage de PDMS sur une lamelle en plastique
Masques en quartz de chrome / 4"x4 », HRC / No AZ  ;MB W& A,  ; AllemagneMasques optiques pour photolithographie
Lamelle de protection, D 263 M Verre Schott, etc. (170 ± ; 5 & micro ; m)Ibidi, Allemagne10812
Solution de peroxyde d’hydrogène 30 %Carlo Erba Réactifs412081réactifs pour solution de piranha
Méthyl isobutyle cétoneCarlo Erba Réactifs461945PMMA E-beam résistant révélateur
Microscope Lames de verre (paquet de 50 lames) 76,2 mm x 25,4 mm  ;Sail Brand7101substrats pour puces de collage
Poinçon de biopsie Miltex avec piston, ID 1,0 mmPoinçons de biopsie cutanéeTedpella
PMMA  ; 950 kDaAllresist, AllemagneAR-P. 679.04Résines électroniques positives pour le motif des masques
optiques Lamelles de recouvrement non traitées en polymèreIbidi, Allemagne10813substrats pour le collage de puces
Prime CZ-Si Wafer,  ; 4", (100), Dopé au boreGambetti Xenologia Srl, Italie30255
Propan-2-olCarlo Erba Réactifs415238
Acétate de monométhyléther de propylène glycol (PGMEA)Sigma Aldrich484431-4LSU-8 résiste développeur SU-8
3005Technologie de micro-réserve,AllemagneC1.02.003-0001Négatif Photoresists
SU-8 3050Technologie des micro-réserves, AllemagneC1.02.003-0005Photorésines négatives
Suite de Biopunch, ID 4,0 mm, 6,0 mm, 8,0 mmTedpella15111-40, 15111-60, 15111-80Poinçons de biopsie cutanée pour réservoirs de copeaux
Acide sulfurique 96 %Carlo Erba Réactifs410381réactifs pour solution de piranha
SYLGARD 184 Kit d’élastomère de siliconeDowsil, Dow Corning11-3184-01Élastomère de silicone (PDMS)
Triméthylchlorosilane (TMCS)Sigma Aldrich92360-100MLagent silanisant pour masters
Équipement de microfabrication
100 kV litographie par faisceau d’électronsRaith-Vistec EBPG 5HR
plaque chauffante
Système de litographie optiqueEV-420 Masque de contact double face-aligneur
de gravure ionique réactiveOxford plasmalab 80 plus
Dessiccateur
<liquideHTB-26 colorant Colorant cellulaire fluorescent Embouts stériles la de micropipette Armoire de sécurité de laboratoire FDM thermostatique pour réservoirs de copeaux à motifs SU-8 Système Système sous vide

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