Collecte et traitement de données de cristallographie neutronique pour la modélisation des atomes d’hydrogène dans les structures protéiques

Gabriela C. Schröder; Flora Meilleur

doi:10.3791/61903

Method Article

Collecte et traitement de données de cristallographie neutronique pour la modélisation des atomes d’hydrogène dans les structures protéiques

DOI:

10.3791/61903

⸱

December 1st, 2020

Gabriela C. Schröder¹^,² , Flora Meilleur¹^,²

¹Department of Molecular and Structural Biochemistry, North Carolina State University, ²Neutron Scattering Division, Oak Ridge National Laboratory

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cristallographie des protéines neutroniques est une technique structurelle qui permet la localisation des atomes d’hydrogène, fournissant ainsi des détails mécanistes importants sur la fonction des protéines. Nous présentons ici le flux de travail pour le montage d’un cristal de protéine, la collecte de données de diffraction neutronique, le raffinement de la structure et l’analyse des cartes de densité de longueur de diffusion neutronique.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cristallographie neutronique est une technique structurelle qui permet de déterminer la position des atomes d’hydrogène dans les macromolécules biologiques, fournissant des informations mécaniquement importantes sur les états de protonation et d’hydratation sans induire de dommages causés par le rayonnement. La diffraction des rayons X, en revanche, ne fournit que des informations limitées sur la position des atomes de lumière et le faisceau de rayons X induit rapidement des dommages par rayonnement des cofacteurs photosensibles et des centres métalliques. Voici le flux de travail utilisé pour les lignes de faisceau IMAGINE et MaNDi au Oak Ridge National Laboratory (ORNL) afin d’obtenir une structure de diffraction neutronique une fois qu’un cristal de protéine de taille appropriée (> 0,1 ^mm3) a été cultivé. Nous démontrons le montage de cristaux de protéines hydrogénées dans des capillaires de quartz pour la collecte de données de diffraction neutronique. Le processus d’échange de vapeur des cristaux montés avec un tampon contenant du _D2O est également présenté pour assurer le remplacement des atomes d’hydrogène sur les sites échangeables par du deutérium. L’incorporation de deutérium réduit le fond résultant de la diffusion incohérente des atomes d’hydrogène et empêche l’annulation de la densité causée par leur longueur de diffusion cohérente négative. Les stratégies d’alignement des échantillons et de collecte de données à température ambiante sont illustrées à l’aide de la collecte de données quasi-Laue à IMAGINE au réacteur à isotopes à haut flux (HFIR). En outre, le montage des cristaux et la congélation rapide dans l’azote liquide pour la collecte de données cryogéniques afin de piéger les intermédiaires de réaction labile sont démontrés à l’instrument à temps de vol MaNDi à la source de neutrons de spallation (SNS). La préparation des fichiers de données de coordonnées et de diffraction du modèle et la visualisation des cartes de densité de longueur de diffusion des neutrons (SLD) seront également abordées. Le raffinement de la structure par rapport aux données neutroniques uniquement ou par rapport aux données conjointes rayons X/neutrons pour obtenir une structure entièrement atomique de la protéine d’intérêt sera finalement discuté. Le processus de détermination d’une structure neutronique sera démontré à l’aide de cristaux de la polysaccharide lytique monooxygénase Neurospora crassa LPMO9D, une métalloprotéine contenant du cuivre impliquée dans la dégradation des polysaccharides récalcitrants via le clivage oxydatif de la liaison glycosidique.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cristallographie macromoléculaire neutronique est une technique qui fournit une fenêtre unique sur la structure et la chimie sous-jacente des protéines. Conceptuellement similaire à la diffraction des rayons X, la diffraction des neutrons fournit des détails atomistiques de la structure macromoléculaire, cependant, l’interaction des neutrons avec les noyaux permet la localisation des atomes légers, souvent difficiles à détecter avec la diffraction des rayons ^X1. Au cours de la diffraction des rayons X, les rayons X se dispersent à partir du nuage d’électrons, ce qui rend les atomes légers tels que l’hydrogène (H) mal visibles dans les cartes de densité d’électrons qui n’ont pas une résolution proche de celle de sous-Ångström2. En revanche, l’intensité de diffusion des neutrons dépend d’interactions complexes avec le noyau, les isotopes d’un même élément affichant des longueurs de diffusion différentes. Par conséquent, les atomes légers et leurs isotopes, tels que l’hydrogène (^1H) et le deutérium (^2H ou D), ont une visibilité comparable à celle des atomes de carbone, d’azote et d’oxygène de l’épine dorsale dans les cartes de densité de longueur de diffusion des neutrons (SLD). De plus, comme l’ampleur de la diffusion des neutrons est indépendante du nombre d’électrons, la diffusion à partir d’éléments légers n’est pas obscurcie par les éléments lourds lorsqu’ils sont à proximité les uns des autres, comme on l’observe dans la diffusion des rayons X. La visibilité accrue de H et de son isotope D lors de l’utilisation de la diffraction neutronique fournit des informations précieuses sur l’état de protonation des résidus, cofacteurs et ligands catalytiquement importants et facilite l’orientation des molécules d’eau, révélant des informations importantes sur les mécanismes catalytiques et la chimie des ^protéines3. La diffraction neutronique offre également l’avantage d’être une technique non destructive, particulièrement adaptée aux échantillons biologiques sensibles à l’ionisation tels que les protéines à centres métalliques ou les cofacteurs redox photosensibles2. L’objectif principal de cet article est de fournir une vue d’ensemble du flux de travail pour obtenir une structure cristalline de protéine neutronique de haute qualité. Nous renvoyons le lecteur intéressé à Podjarny et ^al.4, ^Blakeley5, Blakeley et ^al.6 et O’Dell et ^al.3 pour un excellent aperçu de la diffraction des protéines neutroniques et Ashkar et ^al.7 pour d’autres applications de la diffusion neutronique.

Les neutrons sont principalement générés au cours de réactions nucléaires utilisant l’un des deux processus suivants : la fission nucléaire aux sources du réacteur ou la spallation aux sources basées sur les ^{accélérateurs8}. Les sources de réacteur fournissent un faisceau de neutrons continu en utilisant la fission nucléaire de l’isotope ^235U tandis que les sources de neutrons de spallation produisent un faisceau de neutrons pulsés en bombardant une cible, par exemple un métal liquide tel que le mercure, avec des ^protons9. Oak Ridge National Laboratory (ORNL) à Oak Ridge, Tennessee, héberge à la fois une source de neutrons à l’état d’équilibre au réacteur à isotopes à haut flux (HFIR) et une source pulsée de 60 Hz à la source de neutrons de spallation (SNS). La ligne de faisceau IMAGINE, située au niveau du HFIR, est un diffractomètre à neutrons optimisé pour les macromolécules biologiques (Figure supplémentaire 1)¹⁰. IMAGINE utilise un détecteur à plaque d’image neutronique pour mesurer les données quasi-Laue en utilisant une passe de bande étroite comprise entre 2,8 et 4,5 Å à partir de monocristaux avec des bords de cellule unitaires <150 Å. Le diffractomètre à neutrons macromoléculaires (MaNDi), situé au SNS, est un diffractomètre à neutrons Laue à temps de vol (TOF) équipé d’un cadre sphérique à réseau de détecteurs (DAF) (Figure supplémentaire 2)¹¹. MaNDi mesure les données des monocristaux avec des bords de cellules unitaires compris entre 10 et 300 Å en utilisant une bande passante accordable de 2 Å-longueur d’onde comprise entre 2,0 et 6,0 ^Å12.

Le processus de génération de neutrons est très énergivore, ce qui entraîne des flux de faisceaux de neutrons relativement faibles par rapport aux flux de faisceaux de rayons X aux sources ^{synchrotron13}. Pour garantir des rapports signal/bruit suffisants lors de la collecte des données, il est nécessaire de faire pousser des cristaux de taille et de qualité ^{appropriées14}. En règle générale, des cristaux d’un volume > 0,1 ^mm3 sont nécessaires pour collecter des données avec des statistiques ^adéquates15. Outre les flux plus faibles, les propriétés inhérentes à l’interaction entre les neutrons et les noyaux de l’échantillon doivent être prises en ^{considération16}. La longueur de diffusion des neutrons diffère pour les isotopes d’un même élément, une propriété qui peut être avantageusement exploitée dans la diffusion neutronique à petit angle (SANS) pour masquer ou mettre en évidence les régions d’un échantillon – un processus connu sous le nom de correspondance de ^contraste17. Dans les expériences de diffraction, la longueur de diffusion de neutrons cohérents négatifs de H (-3,741 fm pour ^1H) peut entraîner l’annulation des caractéristiques de la carte de densité de diffusion des neutrons puisque les longueurs de diffusion de neutrons cohérents d’autres atomes biologiquement pertinents, y compris le carbone (6,6511 fm pour ^12C), l’azote (9,37 fm pour ^14N), l’oxygène (5,803 fm pour ^16O), le phosphore (5,13 fm pour ^{le 31P}) et le soufre (2,804 fm pour ^{le 32S}) sont positifs (tableau 1)^12,14. En outre, la grande longueur de diffusion incohérente de H (25,274 fm) augmente l’arrière-plan lors de la collecte des données, ce qui entrave la qualité de l’ensemble de données et compromet la résolution des ^données7. Pour contourner ces limitations introduites par H, il est nécessaire, pour la diffraction des neutrons, d’échanger H contre son isotope deutérium, ^2H (D), qui a une longueur de diffusion neutronique cohérente positive (6,671 fm) et une longueur de diffusion incohérente significativement inférieure (4,04 fm)¹⁹. Ceci peut être réalisé par perdeuteration, un processus dans lequel la protéine est exprimée par des organismes cultivés dans des milieux entièrement deutérés assurant l’incorporation complète de D sur les sites ^H20. Il est également possible de devenir partiellement des protéines en remplaçant H par D uniquement sur les sites échangeables (groupes titrables) tandis que les sites liés au carbone non échangeables restent hydrogénés21. Cela peut être réalisé par la croissance de cristaux de protéines hydrogénées dans la liqueur mère deutérée22. Le plus souvent, cependant, l’échange H / D de protéines hydrogénées est effectué par échange de vapeur après la croissance de cristaux de taille appropriée dans un tampon à base de _H2O23. Dans de tels cas, les cristaux sont montés dans un capillaire de quartz et équilibrés à la vapeur avec une liqueur mère à base de _D20.

Les flux de neutrons limités aux sources de neutrons se traduisent par des temps de collecte de données plus longs, allant de quelques jours à plusieurs ^semaines24. À l’ORNL, IMAGINE et MaNDi utilisent tous deux une bande passante de longueur d’onde étroite dans la gamme 2–6 Å pour optimiser la collecte de ^données25. Les données peuvent être collectées à température ambiante ou à température cryogénique. La collecte de données cryogéniques peut potentiellement améliorer la qualité des données et ouvrir la possibilité d’intermédiaires catalytiques par congélation. Après la collecte de données sur la diffraction des neutrons, un ensemble de données de rayons X est généralement collecté sur le même cristal à la même température ou sur un cristal cultivé dans des conditions ^identiques26. La collecte de données à la même température permet d’affiner la structure par rapport aux données de rayons X et de neutrons, empêchant ainsi tout artefact potentiel induit par la température, tel que les changements de visibilité et de position des eaux ou l’occupation de résidus avec des conformations ^{alternatives27}. Le raffinement conjoint des données neutroniques des rayons X augmente le rapport données-paramètres et offre l’avantage de permettre d’affiner les coordonnées de l’épine dorsale des protéines par rapport aux données des rayons X, tandis que les données de diffraction des neutrons sont utilisées pour affiner la position des atomes H/^D28. Ceci est particulièrement utile lors de l’utilisation d’échantillons partiellement deutérés, où l’annulation de la densité due aux atomes H sur des sites non échangeables sur la protéine est présente. Bien que le nombre de structures de rayons X dépasse de loin le nombre de structures neutroniques déposées dans la banque de données sur les protéines (PDB), les progiciels initialement conçus pour le raffinement des données de rayons X ont été étendus pour englober également les données neutroniques3,29,30. Après la collecte des données, les modèles peuvent être affinés à l’aide de packages de raffinement tels que phenix.refine, CNSsolve (nCNS) ou SHELXL28,31,32,33. Au cours du processus d’affinement, les cartes de densité de diffusion des neutrons peuvent être visualisées pour un ajustement manuel à l’aide de ^COOT34. Suivant la solution de structure, les coordonnées et les fichiers de données de diffraction des neutrons et/ou des rayons X peuvent être soumis à l’APB, qui validera et déposera le modèle, le rendant accessible au public18,29,30.

L’analyse structurale des protéines est une approche à multiples facettes dans laquelle de nombreuses techniques sont utilisées pour sonder leur fonction et leur ^mécanisme35. La cristallographie des protéines neutroniques fournit des informations chimiques précieuses pour développer et compléter les résultats d’études supplémentaires telles que la diffraction des rayons X, la spectroscopie, la résonance magnétique nucléaire (RMN) ou la diffraction électronique microcristalline (microED)³⁶. La diffraction des protéines neutroniques est particulièrement bien placée pour fournir des informations sur les mécanismes enzymatiques, car les atomes H sont au cœur de leur chimie. L’absence de dommages radiologiques induits par les neutrons en fait une sonde exceptionnellement adaptée à l’étude des métalloprotéines37. Nous présentons ici un exemple représentatif du processus de diffraction des protéines neutroniques de la préparation des échantillons à la collecte, au raffinement et à l’analyse des données (Figure 1). Des cristaux de taille suffisante pour les expériences de diffraction neutronique ont été cultivés à partir de la métalloprotéine Neurospora crassa LPMO9D (NcLPMO9D). Nc LPMO9D est une métalloprotéine contenant du cuivre impliquée dans la dégradation de la cellulose récalcitrante par insertion d’atomes d’oxygène à la liaison glycosidique38,39. Le site actif du NcLPMO9D contient un centre de cuivre mononucléaire au sein d’un « corset d’histidine » caractéristique composé de l’histidine N-terminale et d’une deuxième histidine conservée (figure supplémentaire 3)⁴⁰. Le N-terminal des LPMO fongiques est méthylé mais la modification post-transitionnelle ne se produit pas lors de l’expression recombinante dans la levure. Dans l’état de repos NcLPMO9D, le centre de cuivre est présent dans un état d’oxydation ^Cu2+ et est activé par réduction d’un seul électron en ^Cu1+, permettant à l’oxygène moléculaire de se lier et d’être activé en étant rapidement réduit à une espèce de ^{superoxyde41,42}. La réaction globale de NcLPMO9D nécessite l’ajout d’un électron et de deux protons pour former le produit polysaccharidique ^hydroxylé43. L’identité des espèces d’oxygène activée responsables de l’extraction d’atomes d’hydrogène (HAA) du substrat polysaccharidique n’a pas été identifiée et des études structurelles et informatiques intensives sont actuellement en ^cours44,45. Compte tenu de la chimie redox sur le site actif ncLPMO9D, l’atténuation des dommages causés par les rayonnements est particulièrement pertinente. Nous illustrons ici la collecte de données sur la température ambiante et la cryo-température sur les cristaux NcLPMO9D afin de déterminer la structure NcLPMO9D à l’état de repos et sous forme réduite activée, ^{respectivement46}. L’accent sera mis sur le montage de cristaux de protéines, la configuration d’instruments de ligne de faisceau pour la collecte de données, la préparation des fichiers de données et de coordonnées et les étapes de raffinement nécessaires pour modéliser une structure neutronique entièrement atomique.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Évaluation de la taille des cristaux

Mesurez la taille des cristaux à l’aide d’un microscope équipé d’une lumière normale et polarisée. Sélectionnez des cristaux d’un volume minimal d’environ 0,1 ^mm3 (figure supplémentaire 4).
Étiquetez les puits avec des cristaux suffisamment grands et notez les conditions de cristallisation utilisées pour générer ces cristaux.

2. Préparation du tampon de cristallisation deutéré

Dissoudre les composants du tampon de cristallisation dans _D2O pour générer un tampon de cristallisation deutéré.
Ajustez le pH du tampon en calculant le de la solution à l’aide de l’équation suivante :
(1)
où _pHmeas est le pH mesuré avec une électrode en verre standard. Le pH original du tampon de cristallisation NcLPMO9D était de 6,0, nous utiliserons donc un _pHmeas de 5,6 pour le tampon de cristallisation deutéré à 6,0.
Immergez l’électrode du pH-mètre dans le _D2O pendant dix minutes avant de l’utiliser (figure supplémentaire 5).
Ajuster le pH _à 5,6 en utilisant la base NaOD ou l’acide DCl.

3. Récolte des cristaux

Placez des lames de verre rondes siliconées de 22 mm à côté du plateau de cristallisation à partir duquel les cristaux seront récoltés. Utilisez une lame de verre propre par cristal (Figure 2A).
Ouvrez la boîte à sandwich scellée contenant les cristaux de protéines dans la plaque de verre siliconé à grand volume de 9 puits.
Retirer 10 à 20 μL de la solution du réservoir de cristallisation à l’aide d’une micropipette et placer la solution sur la lame de verre (Figure 2B).
Récoltez le cristal à l’aide d’une microboucle de taille appropriée et placez le cristal dans la goutte de solution du réservoir sur la lame de verre pour éliminer les débris qui sont souvent récoltés avec le cristal (Figure 2C et Figure 2D).
REMARQUE: Il sera nécessaire de travailler rapidement car les gouttelettes de petit volume peuvent s’évaporer. Les cristaux récoltés risquent également de se dessécher lorsqu’ils sont exposés à l’atmosphère. Il peut être nécessaire d’ajouter une solution réservoir à la goutte de protéines pour empêcher les cristaux de se dessécher dans de petits volumes de gouttes de cristallisation.

4. Montage en cristal

REMARQUE: Les protocoles de montage capillaire varient selon les préférences des expérimentateurs. Pour éviter d’endommager les cristaux, les capillaires qui doivent être raccourcis doivent être marqués avec une pierre de taille ou du papier de verre pour assurer une rupture en douceur.

Remplir une extrémité d’un capillaire à quartz de 2 mm de diamètre et de 50 mm de longueur avec un tampon de réservoir par action capillaire ou en pipetant directement ~ 10 μL de tampon de réservoir dans le capillaire (Figure 3A).
REMARQUE: Les utilisateurs sont encouragés à utiliser des tubes capillaires en quartz car, en plus de leur résistance mécanique, il est essentiel de limiter l’absorption du faisceau de neutrons et de réduire les contributions de fond du capillaire. Les capillaires en verre introduisent un fond élevé et absorbent les neutrons, ce qui compromet la qualité des données.
Placez délicatement le cristal dans le tampon du réservoir dans le capillaire de quartz à l’aide de la boucle de montage (Figure 3B et Figure 3C).
Tapotez doucement le tube pour déplacer le tampon du réservoir et le cristal immergé dans celui-ci dans le capillaire (Figure 3D).
Placer le cristal à moins de 13,5 mm et pas plus loin à 27,5 mm d’une extrémité du capillaire; ce sera l’extrémité de montage (Figure supplémentaire 6).
Aspirer la solution tampon autour du cristal à l’aide d’une longue pointe de pipette mince, en laissant le cristal légèrement humide. Ne touchez pas le cristal (figure supplémentaire 7A).
Sécher les parois capillaires à l’aide d’une mèche en papier mince (figure supplémentaire 7B).
Pipette 20-50 μL de solution tampon deutérée dans l’extrémité du capillaire opposé à l’extrémité de montage (Figure 4A).
Faites fondre la cire d’abeille avec une « baguette » chaude et insérez doucement le capillaire dans cette cire d’abeille fondue. Répétez l’opération jusqu’à ce qu’un joint étanche à l’air se forme (Figure 4B et Figure 4C).
Pipeter une très petite quantité de tampon deutéré, environ 5 μL dans l’extrémité de montage du capillaire pour agir comme un « dissipateur de chaleur » pour la cire d’abeille chaude. Trempez cette extrémité dans de la cire d’abeille fondue pour générer un joint étanche à l’air comme décrit précédemment pour former un capillaire scellé aux deux extrémités (Figure 4D).
Inspectez le cristal monté à l’aide d’un microscope après le montage pour vous assurer de son étanchéité à l’air (Figure 4E).
Fixez soigneusement les cristaux montés avec des lingettes Kim dans un récipient tel qu’un tube Falcon de 15 ml ou une boîte de Petri et conservez-les horizontalement à la température à laquelle les cristaux ont été cultivés (Figure 4F).

5. Échange de vapeur

Remplacez le tampon deutéré par un tampon frais deux jours après le montage du cristal.
Faites fondre le joint de cire le plus éloigné du cristal avec une boucle chauffante et utilisez une pipette et des mèches en papier pour retirer le tampon.
Remplissez le capillaire avec 20 à 50 μL de solution tampon deutérée et scellez avec de la cire.
Répétez le remplacement du tampon deutéré deux fois de plus à des intervalles de quatre jours pour vous assurer que l’échange de vapeur tampon deutéré est terminé et permettre l’échange de vapeur pendant au moins deux semaines.

6. Diffraction des protéines neutroniques

REMARQUE : Les lecteurs intéressés par les détails de la ligne de faisceau IMAGINE sont encouragés à consulter Meilleur et al. 2013, Meilleur et al. 201810,47.

Collecte de données sur la température ambiante à la ligne de faisceau IMAGINE au HFIR
1. Montage d’échantillons
  1. Fixez le cristal monté sur le capillaire sur le goniomètre avec du mastic.
  2. Montez le goniomètre sur le bâton d’échantillonnage et centrez le cristal dans le faisceau à l’aide de la station d’alignement hors ligne.
  3. Fixez le bâton d’échantillonnage sur l’étage d’échantillonnage de l’instrument (figure supplémentaire 1B).
  4. Assurez-vous que le clapier expérimental est libéré et ouvrez l’obturateur de ligne de faisceau pour la collecte de données neutroniques.
2. Collecte de données
  1. Ouvrez le programme d’acquisition de données sur l’ordinateur de contrôle de ligne de faisceau et cliquez sur l’onglet Configuration pour configurer la stratégie de collecte de données. Sous Paramètres de l’expérience, tapez le nom de l’échantillon en regard de Nom de l’échantillon et entrez le numéro de proposition en regard de Proposition. Sous Dénomination de l’image, sélectionnez Modèle de dossier et définissez la destination des données acquises à enregistrer, puis sélectionnez Préfixe d’image et tapez le nom de cadre approprié (figure supplémentaire 8).
  2. Ouvrez l’interface graphique Optique et cliquez sur 2,78 pour _λmin et 4,78 pour _λmax pour définir la plage quasi-Laue pour la collecte de données (Figure supplémentaire 9).
  3. Basculez vers l’onglet Collecter et sous Paramètres de numérisation suivants , insérez le temps d’exposition en secondes sous Exposition, le nombre d’images sous N Images et les angles de collecte de données sous Δ φ/Image. Nommez le cadre à collecter sous Préfixe d’image et lancez la collecte de données en cliquant sur le bouton Démarrer l’analyse (Figure supplémentaire 10).
  4. Les neutrons diffractés seront détectés par le détecteur de plaque d’image. À la fin de chaque exposition, la plaque d’image sera lue et le motif affiché sur l’interface graphique d’acquisition de données (figure supplémentaire 11).
  5. Les trames sont indexées, intégrées, normalisées en longueur d’onde et mises à l’échelle à l’aide de Lauegen, ^Lscale50 et Scala par le scientifique responsable de la ligne de faisceau, qui fournira à l’utilisateur le fichier de réflexion fusionné après la collecte des données (figure supplémentaire 12).
    REMARQUE: La collecte de données à IMAGINE et MaNDi sera effectuée en mode quasi-Laue, en utilisant la méthodologie et le logiciel développés pour la collecte de données de diffraction de Laue tels que développés par Helliwell et ^al.48 et Nieh et ^al.49.
  6. Recueillir un ensemble de données de rayons X correspondant sur le même cristal à la même température après la collecte de données de diffraction neutronique (figure supplémentaire 13).
    REMARQUE: Un cristal cultivé à partir de la même goutte ou dans les mêmes conditions de cristallisation peut également être utilisé pour collecter des données de diffraction des rayons X pour le raffinement conjoint neutron/rayons X.
Collecte de données cryogéniques à la ligne de faisceau MaNDi au SNS
REMARQUE : Les lecteurs intéressés par les détails de la ligne de faisceau sont encouragés à consulter Coates et al. (2015), Meilleur et al. 201810,11.
1. Montage d’échantillons
  1. Préparer la solution de trempage à l’ascorbate deutérée pour la réduction des cristaux et du cryoprotecteur deutéré. Placez des gouttes de 20 μL de chacune de ces solutions dans des puits de goutte assis dans une plaque de cristallisation.
    REMARQUE: La solution cryoprotectrice est généralement le cryoprotecteur qui s’est avéré efficace pour la collecte de données de diffraction des rayons X cryo-température préparée dans _D2O. Ce cryoprotecteur peut être optimisé davantage (par exemple, la concentration) pour la collecte de données neutroniques si nécessaire.
  2. Sélectionnez les boucles pour le montage de l’échantillon et fixez-les à une cryobase magnétique en suivant les directives MaNDi (Figure supplémentaire 14).
  3. Remplissez une mousse cryo-Dewar avec de l’azote liquide. Placez un manchon de cryoprotection métallique dans l’azote liquide pour refroidir (figure supplémentaire 15A).
  4. Retirez les bouchons de cire des deux extrémités du capillaire et tapotez le capillaire pour déplacer le bouchon tampon afin que le cristal monté soit immergé dans le tampon. Lavez le cristal dans la goutte de solution de réservoir de 20 μL dans le puits de goutte assis (figure supplémentaire 15B et figure supplémentaire 15C).
    REMARQUE: Cette étape n’est pas nécessaire si l’échange H / D a été effectué par équilibrage des gouttes de cristallisation contre un tampon deutéré ou par trempage direct du cristal dans un tampon deutéré.
  5. Immerger le cristal dans la solution de trempage à l’ascorbate pendant deux heures. Montez le cristal dans un microloop attaché à une cryobase magnétique. Immergez le cristal monté dans le cryoprotecteur pendant 10 secondes et plongez le cristal et le cryo dans l’azote liquide pour le congeler (figure supplémentaire 15D).
  6. Une fois le cristal congelé, utilisez une pince à goupille cryo pré-refroidie et montez le cristal sur l’étage d’échantillonnage MaNDi équipé d’un cryo-flux. Ouvrez doucement la pince à goupille cryogénique et assurez-vous que le cristal reste dans le cryo-flux (Figure supplémentaire 2C).
2. Collecte de données
  1. Ouvrez le logiciel de collecte de données dans lequel les informations de l’expérience auront été remplies automatiquement.
  2. Cliquez sur le centre du cristal pour le centrer avec le goniomètre contrôlé par ordinateur (figure supplémentaire 16).
  3. Sous Tableau, établissez la stratégie de collecte de données en saisissant les angles de collecte de données sous « phi » ainsi que l’exposition totale au faisceau de neutrons par image sous Valeur (Figure supplémentaire 17).
  4. Cliquez sur Soumettre pour commencer la collecte de données.
  5. Au fur et à mesure que les données s’accumulent, les neutrons diffractés seront visibles (figure supplémentaire 17). Les points de diffraction deviendront plus clairs à mesure que le temps d’exposition augmentera, ce qui améliorera le rapport signal/bruit (Figure 5).
  6. Les trames seront indexées, intégrées, la longueur d’onde normalisée et mise à l’échelle à l’aide de Mantid et de Lauenorm par le scientifique responsable de la ligne de faisceau, qui fournira à l’utilisateur le fichier d’intensité fusionné après la collecte des ^données51.

7. Raffinement de la structure

Raffinement conjoint des données sur les rayons X et les neutrons
1. Préparation de la structure
  1. Affiner les données radiographiques pour obtenir une structure protéique à l’aide du progiciel phenix.refine et de Coot pour la construction manuelle afin d’obtenir une structure complète.
  2. Ouvrez CCP4 et sélectionnez le programme Convertir en/modifier/étendre MTZ pour faire correspondre les indicateurs de données sans R des données neutroniques à ceux des données de rayons X. Sélectionnez cette option pour importer le fichier de réflexion au format MTZ . Sous En télécharger le fichier MTZ de neutrons obtenu et télécharger le fichier mtz de rayons X sous Import FreeR MTZ (Figure supplémentaire 18). Donnez un nom au nouveau fichier MTZ sous Sortie et cliquez sur Exécuter.
  3. Ouvrez le progiciel Phenix et cliquez sur ReadySet sous Outils d’affinement. À côté du fichier PDB , téléchargez le fichier de coordonnées PDB affiné par rapport aux données radiographiques. Sélectionnez Ajouter des hydrogènes au modèle en cas d’absence et sélectionnez H/D sur les sites échangeables, H ailleurs dans le menu déroulant. Sélectionnez Ajouter des deutériums aux molécules de solvant et laissez les options restantes sur leurs valeurs par défaut (Figure supplémentaire 19A).
    REMARQUE: Si une protéine perdeuterated est utilisée, sélectionnez l’option Ajouter des hydrogènes au modèle en cas d’absence et sélectionnez H / D sur les sites échangeables, D ailleurs.
2. Raffinement de la structure
  1. Ouvrez le programme phenix.refine sous l’onglet Raffinement pour configurer le raffinement à l’aide de données de rayons X et de neutrons. Dans l’onglet Configurer dans Fichiers d’entrée, entrez le fichier PDB de la structure de rayons X qui a été traité avec ReadySet et le fichier de retenue CIF nécessaire pour tous les ligands pertinents. Téléchargez le fichier MTZ à partir des données neutroniques avec les indicateurs Rfree attribués à l’aide de CCP4 et attribuez-le comme « Données neutroniques » et « Sans neutrons » sous l’en-tête Type de données. Téléchargez le fichier MTZ à partir des données de rayons X et attribuez-le comme « Données de rayons X » et « Sans rayons X R » sous l’en-tête Type de données. Les étiquettes Groupe Espace et Données se remplissent automatiquement une fois les données téléchargées (Figure supplémentaire 19B).
    REMARQUE: Lors de l’affinement et de la saisie des informations sur les cristaux, utilisez la cellule unitaire déterminée à partir des données radiographiques.
  2. Sous l’onglet Configurer dans les paramètres d’affinement , conservez la stratégie d’affinement standard. Augmenter le nombre de cycles à cinq (figure supplémentaire 20)
  3. Sélectionnez Tous les paramètres, cliquez sur Avancé et sélectionnez Hydrogènes.... Remplacez le modèle d’affinement de l’hydrogène par un modèle individuel et désactivez l’adp de conduite De force (figure supplémentaire 20).
  4. Sélectionnez Tous les paramètres et ouvrez l’option Paramètres de recherche . Recherchez le mot nucléaire et sélectionnez Utiliser les distances nucléaires pour X-H/D (Figure supplémentaire 20).
  5. Sélectionnez Exécuter pour lancer l’affinement.
3. Modélisme
  1. Suite au raffinement de Phenix, cliquez sur Ouvrir dans Coot dans l’onglet Résultats pour visualiser les cartes de densité d’électrons de rayons X et de neutrons SLD. Cliquez sur l’onglet Gestionnaire d’affichage et sous Cartes, cliquez sur Supprimer la carte à côté des cartes _neutron pour supprimer les cartes neutroniques (figure supplémentaire 21). Cliquez sur Fichier > Ouvrir MTZ, mmCIF fcf ou phs.... Sélectionnez les fichiers d’affinement actuels et ouvrez le fichier .mtz. Pour l’option Amplitudes et Phases, sélectionnez les données 2FOFC WT_no_fill_neutron dans le menu déroulant. Répétez cette opération et ouvrez les données _FOFC WT_neutron. Ouvrez le Gestionnaire d’affichage et basculez sur Défilement pour les cartes à neutrons et à rayons X 2FOFCWT, puis faites défiler pour réduire le rmsd des cartes 2FOFCWT à 1,00 (Figure supplémentaire 21). Basculez vers Scroll pour les cartes FOFCWT à neutrons et à rayons X et faites défiler pour réduire le rmsd des cartes _FOFCWT à 3.00.
  2. Effectuez une inspection visuelle des résidus pour déterminer si le modèle correspond aux données. Déterminez l’orientation correcte et l’occupation H/D de tous les sites échangeables en analysant les pics de la carte de densité de différence. Cela inclut les groupes hydroxyles des sérines, des thréonines et des tyrosines; l’azote de l’histidine, de la glutamine, de l’asparagine et de la lysine; le sulfhydryle de la cystéine; les groupes carboxyle de l’aspartate et du glutamate; groupes amides de l’épine dorsale; ligands; les cofacteurs et tout résidu fonctionnalisé potentiel (figure 6).
  3. Réorientez les molécules d’eau en fonction de la densité neutronique et des interactions de liaison hydrogène en les faisant pivoter à l’aide de la fonction Rotation de la zone de traduction/chaîne/molécule (figure supplémentaire 22A et figure supplémentaire 22B). Ajustez les positions des sites échangeables H/D des résidus de protéines à l’aide de l’outil Modifier les angles Chi et de la fonction Rotation de la zone/chaîne/molécule (Figure supplémentaire 22C et Figure supplémentaire 22D).
Raffinement de la structure – raffinement des données neutroniques uniquement
1. Préparation de la structure
  1. Ouvrez Phenix et sélectionnez « Remplacement moléculaire » et sélectionnez « Phaser-MR (complet) » pour dériver la phase des intensités mises à l’échelle fournies par le scientifique de l’instrument par remplacement moléculaire pour générer un fichier de coordonnées de départ au format pdb. Entrez la structure pdb de départ dans l’onglet « Entrée et options générales » et complétez les options Ensembles, Contenu ASU et Procédure de recherche .
  2. Ouvrez Outils de modèle et sélectionnez Outils PDB. Insérez le fichier pdb en tant que fichier d’entrée. Accédez à l’onglet Options et, sous Supprimer la sélection d’atomes , sélectionnez les noms du solvant, des ligands, des cofacteurs et des métaux. Cela élimine toutes les molécules d’eau, les cofacteurs, les ligands et les ions métalliques pour générer un modèle minimal. En outre, sélectionnez l’option Supprimer d’autres conformateurs du modèle (Figure supplémentaire 23).
  3. Sélectionnez Raffinement dans Phenix et ouvrez ReadySet. Entrez le fichier de coordonnées pdb modifié à côté du fichier PDB. Sélectionnez Ajouter des hydrogènes au modèle en cas d’absence et sélectionnez H/D sur les sites échangeables, H ailleurs dans le menu déroulant des options de raffinage des neutrons (Figure supplémentaire 23).
2. Raffinement de la structure
  1. Ouvrez le programme phenix.refine sous l’onglet Raffinement de Phenix. Dans l’onglet Configurer , entrez le fichier PDB qui a été traité avec ReadySet dans la zone Fichiers d’entrée . Dans la zone Fichiers d’entrée , téléchargez le fichier MTZ à partir des données neutroniques et attribuez-le en tant que données de rayons X et sans rayons X R sous la colonne Type de données , même s’il s’agit de données neutroniques. La configuration d’affinement mise en place à l’étape suivante sera utilisée pour traiter le fichier de réflexion comme des données neutroniques. Le groupe Espace et les étiquettes Données seront remplis automatiquement une fois les données téléchargées (Figure supplémentaire 24A).
  2. Sous l’onglet Configurer dans les paramètres d’affinement , conservez la stratégie d’affinement standard. Augmentez le nombre de cycles à cinq. Sous Autres options , sélectionnez neutron dans le menu déroulant Tableau de diffusion . Désélectionnez l’option Mettre à jour les eaux (Figure supplémentaire 24B).
  3. Sélectionnez Tous les paramètres > Avancé >Hydrogènes. Dans la nouvelle fenêtre, sélectionnez Individuel dans le menu déroulant Modèle d’affinement de l’hydrogène et désactivez l’adp Force (Figure supplémentaire 20).
  4. Sélectionnez Tous les paramètres > Paramètres de recherche... option. Recherchez le mot nucléaire et sélectionnez Utiliser les distances nucléaires pour X-H/D (Figure supplémentaire 20).
  5. Sélectionnez Exécuter pour lancer l’affinement.
    REMARQUE: Après le raffinement initial, il sera nécessaire d’inspecter visuellement les cartes SLD neutroniques et d’effectuer la construction manuelle de modèles dans Coot. Il peut être nécessaire d’insérer des ligands/cofacteurs présents dans le modèle. Les améliorations ultérieures nécessiteront le fichier de restrictions CIF nécessaire pour tous les ligands pertinents et ceux-ci doivent être téléchargés dans l’onglet Configurer de phenix.refine.
3. Modélisme
  1. Après le raffinement dans Phenix, cliquez sur Ouvrir dans Coot dans l’onglet Résultats pour visualiser les cartes et la structure des neutrons SLD. Cliquez sur l’onglet Gestionnaire d’affichage et sous Cartes, cliquez sur Supprimer la carte pour supprimer les cartes 2FFFCWT et _FOFCWT (figure supplémentaire 25). Cliquez sur Fichier > Ouvrir MTZ, mmCIF fcf ou phs.... Sélectionnez le dossier d’affinement actuel et sélectionnez le fichier .mtz. Pour l’option Amplitudes et Phases, sélectionnez les données 2FOFC WT_no_fill dans le menu déroulant. Répétez l’opération en cliquant sur Fichier > Ouvrir MTZ, mmCIF fcf ou phs... et sélectionnez les données FOFCWT dans le menu déroulant pour l’option Amplitudes et Phases. Ouvrez le Gestionnaire d’affichage et basculez sur Défilement pour la carte 2FOFC WT_no_fill puis faites défiler pour réduire le rmsd des données _2FOFC WT_no_fill à 1,00 (Figure supplémentaire 25). Basculez vers Scroll pour la carte _FOFCWT et faites défiler pour réduire le rmsd des données _FOFCWT à 3.00.
  2. Effectuez une inspection visuelle de la structure protéique pour déterminer si le modèle correspond à la carte SLD des neutrons.
  3. Comme décrit au point 7.1.3.2, déterminer l’orientation correcte et l’occupation H/D des résidus et des groupes avec des sites échangeables H/D. Ajustez les positions des résidus à l’aide de l’outil Rotation traduire et Modifier les angles Chi (Figure 6). Si nécessaire, Real Space Refine Zone peut être utilisé. Correction manuelle des atomes D qui explosent du résidu à l’aide de l’éditeur de texte pour insérer les coordonnées correctes de l’atome
    REMARQUE : La zone de raffinage de l’espace réel n’est pas optimisée pour les cartes SLD neutroniques dans Coot et peut entraîner des longueurs de liaison irrégulières pour les atomes liés à D, appelés résidus explosants (figure supplémentaire 26). Il est préférable d’éditer manuellement les coordonnées atomiques nécessaires et d’éviter l’utilisation de Real Space Refine Zone.
  4. Insérer et réorienter les molécules d’eau en fonction de la densité neutronique. Pour ajouter de l’eau dans Coot, sélectionnez l’icône Placer l’atome au pointeur et sélectionnez pour insérer une molécule d’eau (Figure supplémentaire 27A). Coot insérera un atome O à cette position par défaut.
  5. Pour ajouter des atomes D aux atomes O des eaux insérées dans Coot, utilisez Phenix. Ouvrez le menu Affinement et cliquez sur ReadySet. À côté de Options de raffinement des neutrons , sélectionnez uniquement l’option Ajouter des deutériums aux molécules de solvant. Désélectionnez Ajouter des hydrogènes au modèle en cas d’absence (Figure supplémentaire 27B et Figure supplémentaire 27C).
    REMARQUE: La construction de modèles utilisant des données à neutrons uniquement diffère de la construction de modèles d’une structure conjointe rayons X / neutrons car il n’y a pas de données de rayons X pour contribuer à l’affinement des coordonnées de l’épine dorsale et des atomes plus lourds. Dans un raffinement articulaire, la carte de densité d’électrons est initialement utilisée pour déterminer l’épine dorsale de la protéine et les coordonnées de la chaîne latérale. Ce modèle est ensuite utilisé dans un raffinement conjoint des données rayons X/neutrons dans lequel l’orientation et l’occupation des atomes H/D sont dérivées de la carte SLD neutronique. Dans un raffinement uniquement neutronique, toute la structure est dérivée de l’analyse des cartes SLD neutroniques, nécessitant la construction des molécules d’eau, de l’épine dorsale, des chaînes latérales et des ligands en plus des atomes H / D (Figure 6). Le rapport données-paramètre est faible en termes d’améliorations par rapport aux seules données neutroniques et il convient de veiller à ne pas surajuster les données.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les données de diffraction neutronique sur les cristaux d’une polysaccharide lytique monooxygénase de Neurospora crassa (NcLPMO9D) ont été collectées sur IMAGINE au HFIR à température ambiante et sur MaNDi au SNS dans des conditions cryogéniques suivant le protocole décrit ci-dessus. Des cristaux de la protéine hydrogénée cultivés dans un tampon à base de _H2O d’un volume supérieur à 0,1 ^mm3 ont été utilisés (des exemples illustratifs de gros cristaux sont présentés dans la figure supplémentaire 4 et les figures suivantes). Les cristaux ont été montés dans des capillaires de quartz et l’échange de vapeur avec le tampon à base de _D2O a été effectué pendant trois semaines avant la collecte des données (Figure 4).

La collecte de données sur la température ambiante a été effectuée sur la ligne de faisceau IMAGINE (figure 1). Un test de quatre heures au faisceau blanc a conduit à une diffraction à haute résolution suggérant que le cristal était de taille et de qualité appropriées pour la collecte d’un ensemble de données complet. En plus de fournir des informations préliminaires sur la qualité de diffraction du cristal, l’exposition initiale à large bande passante peut être utilisée pour indexer le motif de diffraction et déterminer la matrice d’orientation du cristal. Compte tenu du groupe d’espace _P21 du cristal, une stratégie de collecte de données de 18 images avec un temps de collecte de 20 heures par image a été mise en œuvre. Comme pour la collecte de données de diffraction des rayons X, les groupes d’espace à symétrie plus élevée nécessitent moins de trames (c’est-à-dire moins de couverture angulaire) pour collecter un ensemble de données complet. Les données ont été collectées en mode quasi-Laue en utilisant une gamme de longueurs d’onde de 2,8 à 4,0 Å. Après la collecte des données, les données ont été indexées, intégrées à l’échelle et fusionnées pour donner un fichier SLD neutronique au format MTZ à une résolution de 2,14 Å. Les données ont été évaluées comme étant de qualité suffisante conformément à des lignes directrices similaires pour l’analyse des données aux rayons X, bien qu’une exhaustivité de 80 % et un _CC1/2 d’au moins 0,3 aient été jugés acceptables puisque la diffraction des protéines neutroniques est une technique limitée par flux.

À la suite de la collecte de données sur la diffraction des neutrons à température ambiante, le même cristal a été utilisé pour recueillir un ensemble de données de diffraction des rayons X à température ambiante à une résolution de 1,90 Å (figure supplémentaire 13). Les données de rayons X ont été utilisées pour déterminer les positions des atomes « plus lourds », y compris C, N, O et S. La structure affinée par rapport aux seules données de rayons X a ensuite été utilisée comme modèle de départ pour effectuer un raffinement conjoint par rapport aux données de rayons X et de neutrons. Phenix ReadySet a été utilisé pour ajouter des atomes H sur des sites non échangeables, des atomes H et D sur des sites échangeables et des atomes D sur des molécules d’eau du modèle de rayons X de départ. À la suite de cette préparation du modèle, des améliorations itératives ont été effectuées sur les deux ensembles de données (figure supplémentaire 19 et figure supplémentaire 20). La construction de modèles interactifs a été réalisée à Coot en inspectant visuellement les cartes de densité pour orienter les chaînes latérales et les molécules d’eau en conséquence (figure supplémentaire 22). Les données neutroniques ont été principalement utilisées pour déterminer les états de protonation et l’orientation des molécules d’eau. La comparaison de la carte de densité électronique des résidus tels que la sérine et le tryptophane et de la carte SLD neutronique correspondante illustre les informations qui peuvent être obtenues sur les états de protonation sur les sites échangeables H/D à partir de la diffraction des protéines neutroniques (Figure 7). Une superposition cartographique de cartes SLD d’électrons et de neutrons pour les molécules d’eau indique également que, bien que les interactions entre les liaisons hydrogène puissent être déduites des données de rayons X, les neutrons fournissent des informations claires concernant l’orientation de ces liaisons hydrogène (Figure 8). Des cartes d’omission _FO-FC de neutrons SLD ont été générées pour déterminer les états de protonation et l’orientation H/D des chaînes latérales. Illustrées sont les cartes neutroniques SLD obtenues pour les résidus de tyrosine et de thréonine, dans lesquelles les cartes neutroniques _Fo-FC indiquent clairement des pics positifs signifiant la présence de H/D (Figure 9). Les données de diffraction neutronique recueillies ont également fourni des informations précieuses sur plusieurs états de protonation, tels que le groupe -_ND3⁺ de Lys (Figure 10). Les statistiques d’affinement (_Rwork et _Rfree) ont été étroitement surveillées lors de l’optimisation du modèle afin d’éviter un ajustement excessif. Les statistiques finales ont donné un _Rwork aux rayons X de 12,77 % et un _Rfree de 18,21 %, et un _Rwork neutronique de 14,48 % et un _Rfree de 21,41 % avec 389 molécules d’eau présentes (figure supplémentaire 28).

Des données sur la cryotemporation ont été recueillies sur le NcLPMO9D à la suite d’un trempage d’ascorbate afin de réduire le site actif du cuivre de ^CuII à ^CuI sur la ligne de faisceau MaNDi (figure supplémentaire 2 et figure supplémentaire 15)⁴⁵. Les données ont été recueillies en mode TOF Laue à la suite d’un test de diffraction neutronique utilisant une exposition de 4 heures pour vérifier la qualité de la diffraction. Compte tenu du groupe spatial du cristal, une stratégie de collecte de données de 18 images avec une dose de collecte de 80 Coulombs par image a été conçue. Les données ont été collectées en mode TOF-Laue dans une gamme de longueurs d’onde de 2,0 à 4,0 Å. Après la collecte des données, les données ont été indexées, intégrées, mises à l’échelle et fusionnées pour donner un fichier de réflexion au format MTZ à une résolution de 2,40 ^Å51,52.

Après la collecte des données, l’ensemble de données de diffraction des neutrons NcLPMO9D à température cryogénique de 2,40 Å a été utilisé pour affiner les données sur les neutrons uniquement. Les données neutroniques ont été échelonnées par remplacement moléculaire en utilisant PDB 5TKH comme modèle de départ. Phenix ReadySet a été utilisé pour ajouter des atomes H sur des sites non échangeables et des atomes H/D avec des occupations partielles sur des sites échangeables. Les molécules d’eau ont été retirées du modèle de départ à l’aide d’outils PDB (figure supplémentaire 23). La préparation du modèle a été suivie d’un raffinement avec phenix.refine à l’aide du tableau de diffusion des neutrons (figure supplémentaire 24). La construction de modèles interactifs a été réalisée à Coot, avec des molécules d’eau ajoutées à l’aide des pics positifs de la carte _FO-Fc et positionnées en fonction des interactions potentielles de liaison hydrogène (Figure 11A et Figure 11B). Lors de l’analyse des cartes SLD neutroniques, les molécules d’eau sont clairement visibles si elles sont très ordonnées, mais leur densité peut être sphérique ou ellipsoïdale si elles ne sont pas bien ordonnées (Figure 11C-E). Les cartes neutroniques SLD ont été utilisées pour fournir des informations précieuses sur l’orientation des résidus tels que l’asparagine, dans laquelle la différenciation entre les groupes carbonyle et amino peut être difficile lors de l’utilisation des données de diffraction des rayons X seules (Figure 12A et Figure 12B). Les pics dans les cartes O-FC neutroniques SLD omises ont également été très instructifs pour déterminer les états de protonation des résidus _{d’histidine} en position N δ ou N _ε (Figure 12C et Figure 12D). L’état de protonation des résidus avec plusieurs sites échangeables H/D peut également être déterminé à l’aide de cartes SLD neutroniques. Cela a été clairement illustré par une carte SLD de neutron _fO-FC omettant l’arginine, qui est connue pour avoir une charge positive (figure 12E et figure 12F). Comme auparavant, le sur-ajustement a été évité en surveillant _Rwork et _Rfree. Les statistiques finales ont donné un _Rwork de 22,58 % et un _Rfree de 30,84 % (figure supplémentaire 29). Étant donné que la diffraction des protéines neutroniques est une technique à flux limité dans laquelle la longueur de diffusion négative et le grand facteur de diffusion incohérent de H doivent être pris en compte, on peut s’attendre à ce qu’un raffinement uniquement des données neutroniques ait des statistiques plus médiocres qu’un raffinement conjoint rayons X/neutrons avec moins de molécules d’eau visibles (figure supplémentaire 28 et figure supplémentaire 29).

Lors de l’analyse des cartes SLD neutroniques, il deviendra évident que l’annulation de la densité due à la longueur de diffusion neutronique négative de H se produira pour les protéines hydrogénées qui ont été soumises à un échange de vapeur avec un tampon de cristallisation contenant du _D2O. Pour cette raison, les cartes SLD neutroniques dans lesquelles des atomes H non échangeables sont attachés au carbone semblent incomplètes par rapport à leur homologue de carte de densité électronique (Figure 13A). L’effet de l’annulation est souvent plus apparent à des résolutions plus faibles, ce qui rend impératif l’obtention de cristaux de protéines de haute qualité. Il est donc préférable d’effectuer un raffinement conjoint d’un échantillon avec des données de rayons X et de neutrons dans lequel les données de rayons X peuvent être utilisées pour déterminer la position de l’épine dorsale protéique (Figure 13B). De plus, les atomes de soufre dans la cystéine et la méthionine peuvent être mal visibles, ce qui nécessite des données radiographiques pour le placement exact des atomes (figure 13C et figure 13D). Les métaux avec de faibles longueurs de diffusion des neutrons peuvent également être difficiles à modéliser dans les cartes SLD à neutrons, comme en témoignent nos cartes LPMO9D. La collecte d’un ensemble de données de rayons X à faible dose (exemptes de dommages causés par le rayonnement) sur le même cristal est donc utile, car elle permet le positionnement des atomes métalliques à l’aide de cartes de densité d’électrons (figure 13E et figure 13F).

figure-results-1
Figure 1 : Organigramme du flux de travail de cristallographie des protéines neutroniques. Production de protéines. Afin d’obtenir une structure neutronique, la protéine est d’abord exprimée. L’expression bactérienne dans les milieux à base de _{H2O ou de D2O} est généralement utilisée pour produire un rendement élevé de protéines recombinantes hydrogénées ou perdeutérées, respectivement. La protéine est purifiée dans un tampon à base de _H2O, puis cristallisée dans un tampon de cristallisation à _{base de} _{H2O ou de D2O} pour faire croître les cristaux jusqu’à une taille minimale de 0,1 ^mm3. Préparation de l’échantillon : Avant la collecte des données de diffraction des neutrons, les cristaux cultivés en _H2O subissent un échange H/D pour échanger les atomes H titrables de protéines avec D. L’échange H/D peut être effectué par trempage direct des cristaux dans un tampon de cristallisation deutéré, équilibration de la goutte de cristallisation avec un réservoir à base de _D2O, ou en montant les cristaux dans des capillaires de quartz pour l’échange de vapeur avec un tampon de cristallisation deutéré. Collecte de données sur les neutrons : Après l’échange H/D, les cristaux potentiels sont examinés pour déterminer la qualité de diffraction. Les cristaux avec une résolution minimale de 2,5 Å sont considérés comme appropriés pour un ensemble de données complet à collecter. Les cristaux sont montés dans des capillaires de quartz pour la collecte de données à température ambiante ou congelés dans une boucle cryogénique pour la collecte de données à température cryogénique. Un ensemble de données de rayons X est collecté sur le même cristal (ou un cristal identique) à la même température. Construction de modèles : Le raffinement est effectué à l’aide de phenix.refine par rapport aux données neutroniques et aux rayons X ou uniquement par rapport aux données neutroniques. La construction manuelle d’un modèle de la structure protéique est réalisée dans Coot à l’aide des cartes SLD neutroniques. Structure complète : Une fois la structure protéique terminée, le modèle de coordonnées est validé et déposé dans la banque de données sur les protéines. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Récolte de cristaux de protéines. (A) Les cristaux sont manipulés au microscope. (B) La boîte à sandwich scellée contenant la plaque de verre siliconé est ouverte. Le tampon du réservoir est pipeté sur des lames de verre siliconé. (C) Un cristal est récolté avec un microloop. (D) Le cristal est placé dans une goutte de liqueur mère pour laver tous les débris qui sont souvent récoltés avec le cristal. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Transfert du cristal au capillaire de quartz. (A) L’extrémité d’un capillaire de quartz est remplie de tampon de réservoir. (B) Le cristal est transféré dans le capillaire de quartz et (C) immergé dans le tampon du réservoir. (D) Le cristal est transporté dans le capillaire à l’aide d’un tampon réservoir. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-4
Figure 4 : Étanchéité du capillaire de quartz. (A) Un tampon deutéré est ajouté à l’extrémité du capillaire pour former un « bouchon ». (B) La cire est fondue avec une « baguette ». (C) Le capillaire est placé dans la cire fondue pour sceller. (D) Des bouchons de cire sont formés aux deux extrémités pour sceller le capillaire. (E) Le cristal après montage. (F) Le capillaire scellé est placé dans une boîte de Petri et maintenu en place avec du mastic. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-5
Figure 5 : Augmentation du signal au bruit du modèle de diffraction des neutrons. Au fur et à mesure que la collecte de données progresse, les taches diffractées deviennent plus intenses. (REMARQUE: les images de diffraction en direct présentées ici sont à titre d’illustration et ont été prises à partir de différents cristaux.) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-6
Figure 6 : Construction de modèles interactifs à l’aide de données neutroniques dans Coot. (A) Un pic positif de densité SLD de neutrons _FO-FC (vert) indiquant la sérine doit être réorienté en modifiant les angles chi. La carte SLD des neutrons 2FO-FC est affichée en violet et la carte de densité d’électrons 2FO-FC est affichée en bleu. (B) Sérine correctement positionnée. (C) Pics positifs et négatifs de densité SLD des neutrons _FO-FC (vert et rouge, respectivement) indiquant que le tryptophane doit être tourné/traduit pour correspondre au pic de densité de différence. (D) Tryptophane correctement orienté. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-7
Figure 7 : Informations supplémentaires provenant des cartes SLD à neutrons. (A) La carte de densité d’électrons 2FO-FC (bleu) affiche les positions des atomes « plus lourds » dans la sérine. (B) La carte SLD des neutrons _2FO-FC (violet) affiche clairement la position de l’atome D « plus léger » dans la sérine. (C) La carte de densité d’électrons _2FO-FC (bleu) affiche les positions des atomes « plus lourds » dans le tryptophane. (D) La carte SLD des neutrons _2FO-FC (violet) affiche clairement la position de l’atome D « plus léger » dans le tryptophane. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-8
Figure 8 : Positionnement des molécules d’eau. (A) La forme sphérique d’une carte de densité d’électrons _2FO-FC (bleue) pour l’eau. (B) La carte SLD des neutrons _2FO-FC (violet) fournit des informations sur l’orientation de l’eau et l’interaction de la liaison hydrogène. (C) Superposition cartographique des cartes SLD d’électrons et de neutrons de l’eau. La carte SLD des neutrons 2FO-FC est affichée en violet et la carte de densité d’électrons 2FO-FC est affichée en bleu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-9
Figure 9 : Cartes FO-FComit des neutrons SLD. (A) La carte _FO-FC des neutrons SLD (en vert) fournit des informations claires sur l’orientation H/D des résidus de tyrosine. La carte SLD des neutrons 2FO-FC est affichée en violet et la carte de densité d’électrons 2FO-FC est affichée en bleu. (B) Résidu de tyrosine avec orientation H/D correcte. (C) La carte SLD des neutrons _FO-FC (en vert) fournit des informations claires sur l’orientation H/D des résidus de thréonine. (D) Résidu de thréonine avec orientation H/D correcte. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-10
Figure 10 : Plusieurs états de protonation affichés avec des cartes SLD neutroniques. (A) La carte de densité électronique _2FO-FC (bleu) ne fournit que la position de l’atome N du groupe lysine ε-ammonium. (B-E) La carte O-O.N° SLD du neutron _FO-FC (vert) démontre clairement le groupe -_NH3 chargé positivement. La carte SLD des neutrons 2FO-FC est affichée en violet et la carte de densité d’électrons 2FO-FC est affichée en bleu. (F) Superposition de cartes de densité d’électrons et de neutrons SLD. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-11
Figure 11 : Apparition des molécules d’eau dans les cartes SLD neutroniques. (A) Les molécules d’eau sont positionnées selon les cartes SLD des neutrons _FO-FC (vert) et les liaisons hydrogène potentielles. La carte SLD des neutrons 2FO-FC est affichée en violet. (B) Molécule d’eau correctement positionnée. (C-E) Les différentes formes de cartes SLD neutroniques pour les molécules d’eau en fonction des facteurs B et des interactions de liaison hydrogène. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-12
Figure 12 : Informations sur l’orientation et la protonation des acides aminés fournies par les cartes SLD neutroniques. (A) Les pics de la carte _FO-FC du neutron SLD (vert) indiquent une orientation incorrecte d’un résidu d’asparagine. La carte SLD des neutrons 2FO-FC est affichée en violet et la carte de densité d’électrons 2FO-FC est affichée en bleu. (B) Carte SLD des neutrons _2FO-FC (violet) de l’orientation correcte des asparagines. (C) Le pic de la carte _FO-FC du neutron SLD (vert) indique une protonation unique de l’histidine à N _ε. (D) Carte SLD neutronique _2FO-FC (violet) de l’histidine N _{ε-protonation}. (E) Les pics de la carte omettre de neutrons SLD _FO-FC (vert) confirment la charge positive de l’arginine. (F) Carte SLD neutronique _2FO-FC (violet) de l’arginine chargée positivement. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-13
Figure 13 : Cartes SLD à neutrons discontinus. (A) Carte SLD neutronique _2FO-FC (violet) d’une protéine hydrogénée échangée par la vapeur H/D. L’acide glutamique affiche l’annulation de la carte SLD des neutrons en raison de la longueur de diffusion négative des atomes H non échangeables. (B) Une carte de densité d’électrons _2FO-FC superposée (bleu) affiche clairement la densité de l’acide glutamique. (C) L’atome de soufre dans la méthionine est mal visible dans les cartes SLD des neutrons _2FO-FC (violet). (D) Une carte de densité d’électrons superposée affiche clairement la densité de la méthionine. (E) Les atomes de métal, ici le cuivre, sont mal visibles dans les cartes SLD des neutrons _2FO-FC (violet). (F) Une carte de densité d’électrons _2FO-FC superposée (bleu) affiche clairement la densité de l’atome de cuivre coordonné. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Isotope	Longueur de diffusion cohérente (fm)	Longueur de diffusion incohérente (fm)
1H	-3.741	25.274
2H	6.671	4.04
12C	6.6511	0
14N	9.37	2
16O	5.803	0
23Na	3.63	3.59
24 Mg	5.66	0
31P	5.13	0.2
32S	2.804	0
35Cl	11.65	6.1
39 Ko	3.74	1.4
40Ca	4.8	0
55Mn	-3.73	1.79
56Fé	9.94	0
63Cu	6.43	0.22
64Zn	5.22	0

Tableau 1 : Longueurs de diffusion des neutrons et valeurs de diffusion incohérentes. Adapté de Sears, 199216.

Figure supplémentaire 1 : L’instrument IMAGINE du réacteur à isotopes à haut flux. (A) L’instrument IMAGINE dans la salle de guidage des neutrons froids. (B) Échantillon monté dans un capillaire à quartz fixé avec du mastic au goniomètre. La table d’échantillonnage et de détecteur se ferme pour positionner le cristal et la plaque d’image cylindrique dans le faisceau de neutrons. Modifié avec l’autorisation de l’Union internationale de ^{cristallographie53}. Images fournies avec la permission de Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 2 : L’instrument MaNDi à la source de neutrons de spallation. (A) Le réseau de détecteurs de caméra MaNDi Anger. Reproduit avec l’autorisation de l’Union internationale de ^{cristallographie11}. (B) Étage d’échantillonnage mobile MaNDi. (C) Échantillon monté dans un capillaire de quartz monté sur le goniomètre de MaNDi pour la collecte de données à température ambiante. Images fournies avec la permission de Genevieve Martin, Oak Ridge National Laboratory. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 3 : Structure du polysaccharide lytique monooxygénase NcLPMO9D. Le site actif cuivre NcLPMO9D est situé sur une surface plane de liaison polysaccharidique. Le cuivre est coordonné par deux résidus d’histidine dans un « corset d’histidine » classique ainsi que par un résidu axial de tyrosine. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 4 : Cristal avec un volume suffisant dans le bac de cristallisation des gouttes assises. (A) Les gros cristaux sont cultivés dans des gouttes assises placées dans des plaques de verre siliconées à 9 puits. (B et C) Les cristaux sont mesurés pour identifier ceux dont le volume > 0,1 ^mm3. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 5 : pH-mètre configuré pour les lectures de tampons deutérés. L’électrode de pH est trempée dans du _D2O avant utilisation. NaOD et DCl sont utilisés pour ajuster le pH des tampons deutérés. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 6 : Instructions de montage des échantillons MaNDi. Dimensions maximales du capillaire de quartz et position de l’échantillon pour la collecte de données à température ambiante.
Reproduit à partir de : https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 7 : Élimination de l’excès de tampon. (A) L’excès de tampon est aspiré à partir du capillaire de quartz avec des pointes microcapillaires. (B) Le tampon restant est retiré avec une mèche en papier mince pour sécher complètement le capillaire. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 8 : L’interface graphique d’acquisition de données. Fenêtre de saisie des « Paramètres de l’expérience » pour la collecte de données. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 9 : Interface graphique optique. Sélection de la gamme quasi-Laue pour la collecte de données et la surveillance du taux de comptage des neutrons. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 10 : Collecte de données dans l’interface graphique d’acquisition de données. Le temps d’exposition, le nombre d’images et les angles de collecte des données sont spécifiés dans l’onglet « Collecter ». La collecte des données est ensuite lancée à l’aide de « Start Scan ». Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 11 : Neutrons diffractés détectés et affichés. À la fin du temps d’exposition, le détecteur de plaque d’image sensible aux neutrons est lu et le motif de diffraction est affiché dans l’interface graphique d’acquisition de données. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 12 : Traitement des données après diffraction des neutrons. Les trames sont indexées, intégrées, normalisées en longueur d’onde et mises à l’échelle à l’aide de Lauegen, Lscale et Scala pour générer un fichier de réflexion fusionné après la collecte des données. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 13 : Collecte de données radiographiques. Générateur de rayons X de source domestique configuré avec un cristal monté sur capillaire de quartz pour la collecte de données à température ambiante. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 14 : Instructions de montage pour la collecte de données cryogéniques MaNDi. Dimensions des CrystalCaps et hauteur des broches pour la collecte de données cryogéniques chez MaNDi.
Reproduit à partir de : https://neutrons.ornl.gov/mandi/sample-environment Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 15 : Congélation éclair pour la collecte de données de diffraction des neutrons cryogéniques. (A) Configuration pour le trempage des cristaux, la récolte avec un microloop et la congélation dans de l’azote liquide à l’aide d’un récipient cryocompatible tel qu’un Dewar en mousse. Le cristal monté est transféré directement sur le cryo-goniomètre à ligne de faisceau à l’aide de pinces à goupille cryo prérefroidies. (B) Le joint de cire est fondu pour l’élimination des cristaux. (C) Le cristal est rincé jusqu’à l’extrémité du capillaire de quartz pour la récolte. (D) Le cristal est trempé séquentiellement dans un tampon de trempage d’ascorbate, puis cryoprotecteur suivi d’une congélation éclair dans de l’azote liquide. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 16 : Exemple d’interface d’alignement. L’alignement des cristaux dans le faisceau de neutrons, représenté par la croix bleue, se fait par centrage pointer-cliquer. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 17 : L’interface graphique CSS pour la collecte de données. La stratégie de collecte des données, y compris les doses et les angles d’exposition, est téléchargée dans l’interface graphique CSS. Au fur et à mesure de la collecte des données, les neutrons diffractés détectés sur le détecteur en temps réel seront affichés dans le panneau supérieur. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 18 : Correspondance des indicateurs sans R dans CCP4. Les indicateurs sans R des données neutroniques sont mis en correspondance avec les indicateurs sans R des données de rayons X collectées sur le même cristal ou sur un cristal identique pour le raffinement des articulations. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 19 : Préparation et raffinement de la structure. (A) L’outil Phenix ReadySet est utilisé pour ajouter une double occupation H/D sur des sites échangeables. (B) Les données sur les neutrons et les données sur les rayons X sont utilisées pour un raffinement conjoint, tandis que le modèle d’entrée initial a été affiné par rapport à l’ensemble de données de rayons X recueilli sur le même cristal ou un cristal identique. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 20 : Configuration des paramètres d’affinement. Le modèle de raffinement ainsi que les distances nucléaires sont configurés pour le raffinement conjoint des données rayons X/neutrons. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 21 : Sélection des données pour la construction de modèles Coot. La sortie du fichier phenix MTZ contenant des données de rayons X et de neutrons non remplies est ouverte dans Coot pour générer des cartes SLD d’électrons et de neutrons pour la construction de modèles interactifs. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 22 : Construction de modèles interactifs à Coot lors d’un raffinement conjoint. (A) Un pic de densité SLD de neutrons _FO-FC positif et négatif (vert et rouge, respectivement) indiquant que l’eau doit être réorientée par rotation/translation. La carte SLD des neutrons 2FO-FC est affichée en violet et la carte de densité d’électrons 2FO-FC est affichée en bleu. (B) Eau correctement positionnée. (C) Un pic positif de la carte SLD des neutrons _FO-FC (vert) indique que la thréonine doit être tournée pour correspondre au pic de densité de différence en modifiant les angles chi. (D) Thréonine correctement orientée. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 23 : Préparation de la structure pour l’affinement des données uniquement neutroniques. Le fichier de coordonnées de départ est préparé pour être affiné par élimination des atomes d’eau dans PDBTools et par ajout d’une double occupation H/D sur les sites échangeables. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 24 : Raffinement des données neutroniques uniquement. (A) Les données neutroniques sont téléchargées ainsi que le modèle de départ préparé. (B) Les paramètres d’affinement des données neutroniques utilisent le tableau de diffusion des neutrons. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 25 : Sélection des données pour la construction de modèles Coot. Les données neutroniques non remplies sont ouvertes dans Coot pour la construction de modèles interactifs. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 26 : Raffinement de l’espace réel dans la foulque pour les résidus deutérés. (A) Pics positifs et négatifs de densité de neutrons _FO-FC SLD (vert et rouge, respectivement) indiquant qu’un résidu d’arginine doit être déplacé pour s’adapter au pic de densité _FO-FC. La carte SLD des neutrons 2FO-FC est affichée en violet et la carte de densité d’électrons 2FO-FC est affichée en bleu. (B) L’utilisation de Real Space Refine entraîne l’explosion d’atomes D en raison de l’absence de bibliothèques de retenue géométrique Coot. (C) Les atomes D ne se déplacent pas avec le reste des atomes résiduels. (D) Les positions des atomes D peuvent être fixées manuellement à l’aide d’un éditeur de texte. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 27 : Ajout de molécules d’eau. (A) Les molécules d’eau peuvent être ajoutées manuellement aux pics positifs de densité de la carte SLD des neutrons _FO-FC (vert). Les molécules d’eau insérées seront initialement représentées par un atome O dans Coot. (B) Phenix ReadySet est utilisé pour ajouter des atomes D aux atomes O pour les molécules d’eau. (C) La molécule d’eau deutérée est ajoutée avec succès. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 28 : Statistiques d’affinement. Statistiques finales d’affinement des données après le raffinement conjoint rayons X/neutrons. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Figure supplémentaire 29 : Statistiques d’affinement. Statistiques finales d’affinement des données après l’affinement des données neutroniques uniquement. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette figure.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cristallographie des protéines neutroniques est une technique très sensible pour sonder les états de protonation et l’orientation des molécules d’eau dans les protéines. Cette information met en lumière les mécanismes catalytiques des protéines, car les changements dans les interactions de protonation et de liaison hydrogène sont souvent au cœur de la chimie enzymatique10. La cristallographie des protéines neutroniques, bien qu’il s’agisse d’une technique informative, comporte un certain nombre de facteurs à prendre en considération avant de planifier une expérience de diffraction neutronique, à savoir:

La nécessité de gros cristaux de protéines pour la collecte de données.
Les propriétés de diffusion de l’hydrogène et d’autres éléments, tels que les ions métalliques.
Limitations dans le logiciel d’affinement de la structure et de construction de modèles lors de l’utilisation d’échantillons deutérés.

La cristallographie des protéines neutroniques est une technique à flux limité. Contrairement aux ensembles de données de diffraction des rayons X, des facteurs R plus élevés et des rapports d’exhaustivité, de redondance et de signal/bruit plus faibles sont attendus pour les ensembles de données de neutrons en raison des limites inhérentes à la technique (flux limité, quasi-Laue, longueurs d’onde plus longues). La collecte de données d’une seule image dure généralement de 12 à 18 heures. Le succès d’une expérience dépend fortement de la taille et de la qualité de l’échantillon, les cristaux de 0,1 ^mm3 étant souvent l’exigence ^minimale3. La diffraction neutronique nécessite la production de grandes quantités de protéines pour mettre en place des gouttes de cristallisation allant de 10 à 800 μL. Le volume minimum pour la croissance de cristaux suffisamment gros peut être estimé à l’aide d’un calculateur de volume compte tenu des paramètres du cristal et de l’échantillon (https://neutrons.ornl.gov/imagine). La croissance de gros cristaux a été le plus souvent réalisée par diffusion de ^vapeur3. La cristallisation des gouttes suspendues permet la croissance des cristaux en grosses gouttes allant de 10 à 25 μL, tandis que des gouttes plus grandes allant jusqu’à ~ 50 μL peuvent être mises en place à l’aide d’équipements de chute assis disponibles dans le ^{commerce14,54}. Les plaques de verre siliconées à neuf puits peuvent être utilisées pour mettre en place de très grandes gouttes, avec des volumes allant jusqu’à 800 μL. Ces plaques de verre sont placées dans des « boîtes à sandwich » disponibles dans le commerce auprès de Hampton Research. D’autres techniques de cristallisation comprennent la cristallisation par lots, dans laquelle la limite de la taille de la goutte est dictée par le récipient. La mise en place d’une expérience de cristallisation par lots peut aller du microlitre au ^millilitre55. La cristallisation peut également être réalisée à l’aide de la technique de dialyse dans laquelle la protéine est équilibrée avec le précipitant via une membrane de dialyse ou par contre-diffusion le long d’un gradient de concentration de précipitant ou à travers un bouchon poreux tel que l’agarose56,57. L’ensemencement offre une autre alternative pour obtenir des cristaux du volume souhaité. Les micro- et macro-ensemencements ont été utilisés avec succès pour la croissance de gros cristaux, y compris le grand cristal de NcLPMO9D45. Certaines connaissances du diagramme de phase protéique, y compris l’influence de la température sur la solubilité, aident à la croissance de gros cristaux.

Lors de la planification d’une expérience de diffraction neutronique, l’optimisation de la préparation des protéines pour maximiser le rapport signal/bruit lors de la collecte de données de diffraction est ^essentielle7. Pour contourner l’annulation de la densité et la diffusion incohérente élevée causée par les atomes H, les cartes SLD neutroniques peuvent être améliorées en échangeant des atomes H contre son isotope D, qui possède une longueur de diffusion cohérente positive et une faible longueur de diffusion incohérente. Pour ce faire, l’échange de vapeur du cristal de protéine hydrogéné contre le tampon de cristallisation deutéré est effectué. Cela assure l’échange H/D des molécules de solvant et des atomes de protéine H labiles et titrables23. L’échange de vapeur est effectué en montant le cristal hydrogéné dans un capillaire de quartz avec des « bouchons » tampons de cristallisation deutérés à base de _D2O et il représente une technique efficace et douce qui est le plus souvent appliquée14,23,35. L’échange peut prendre plusieurs semaines et nécessite de préférence que le tampon deutéré soit fréquemment changé pour assurer un échange H/D maximal. L’échange H/D peut également être effectué en trempant directement le cristal dans un tampon deutéré. Pour éviter de placer le cristal sous contrainte en raison de l’exposition au _D2O, le processus de trempage doit être effectué progressivement en augmentant progressivement le rapport _D2O:_H2O58. En plus de cela, la cristallisation des protéines hydrogénées peut également être réalisée dans un tampon deutéré pour l’échange H/D sur des sites H ^labiles22,59. Il convient toutefois de noter que le tampon à base de _D2O a un effet sur la solubilité des protéines nécessitant un ajustement supplémentaire des conditions connues à base de H2O3,59. On a également observé que les tampons à base de _D2O conduisaient à des cristaux plus petits dans certains ^cas59. L’échange complet d’atomes H titrables et liés au carbone en D peut être réalisé en exprimant des protéines dans des milieux deutérés pour générer un échantillon perdeuterated20. Les cartes SLD neutroniques résultantes de l’échantillon perruqué seront considérablement améliorées, n’affichant plus l’annulation de densité de la contrepartie de l’échantillon hydrogéné. Ceci est bénéfique lors de la caractérisation de la liaison H / D à des sites non échangeables dans une protéine ou un cofacteur. Cependant, l’expression de la protéine perdeuterated est à la fois élevée en coût et faible en ^rendement60. Le Centre de biologie moléculaire structurale (CSMB) du Laboratoire national d’Oak Ridge (ORNL) offre une installation de deutération aux utilisateurs qui cherchent à générer un échantillon perdeuterated (https://www.ornl.gov/facility/csmb). L’expression perdeutérisée est généralement réalisée dans un bioréacteur sur l’échelle 1 L produisant environ 50 mg de protéines ^purifiées61.

Après la collecte des données de diffraction des neutrons, le raffinement et la construction de modèles interactifs sont effectués. Le raffinement peut être exécuté à l’aide de plusieurs suites logicielles, notamment phenix.refine, nCNS ou SHELXL28,31,32,33. La suite Phenix est le logiciel le plus couramment utilisé pour affiner les données de diffraction des neutrons en conjonction avec Coot qui est utilisé pour construire manuellement le modèle à partir des cartes SLD ^{neutroniques34}. Bien que Phenix et Coot permettent tous deux le traitement des données de diffraction des neutrons, ils peuvent manquer de certaines caractéristiques nécessaires pour traiter les idiosyncrasies associées aux données neutroniques et aux échantillons deutérés. Par exemple, Coot ne contient pas d’optimisation géométrique pour les résidus deutérés, ce qui peut entraîner des complications lors de la construction du modèle puisque la fonction « Real Space Refine » entraîne une « explosion » des résidus (Figure supplémentaire 26)⁶². Cela peut être résolu en générant des fichiers de contention pour tous les résidus deutérés. Cependant, il s’agit d’un processus intensif et ces bibliothèques ne sont actuellement pas accessibles au public. Lors de l’exécution des améliorations dans Phenix, les sites H/D échangeables seront initialement fixés à 0,50 occupation pour H et D. Au fur et à mesure des améliorations, l’occupation de H et D sera affinée en fonction des cartes SLD neutroniques. Lors de la construction de modèles interactifs, les cartes _Fo-Fc de densité de différence sont très informatives pour évaluer les occupations H / D. Les cartes peuvent être utilisées pour déterminer quels sites possèdent une occupation D élevée, ce qui est particulièrement instructif sur le site actif où les états de protonation sont catalytiquement ^pertinents63. Des situations ambiguës se présentent, cependant, lorsque le H:D l’occupation est proche de 0,70:0,30, ce qui entraîne l’annulation complète du signal dans les cartes SLD ^{neutroniques64}. Il faut également tenir compte du fait que les ensembles de données neutroniques quasi-Laue ont souvent une exhaustivité d’environ 80%, ce qui est inférieur aux ≥ 98% couramment observés pour les données de diffraction des rayons X. Lors de l’affinement des données de diffraction neutronique dans Phenix, les amplitudes observées manquantes (_Fo) sont donc calculées à partir du modèle pour compléter la liste de réflexion, introduisant ainsi un biais de modèle. Pour tenir compte de ce biais potentiel, les cartes « no_fill » devraient être examinées lors de la construction de modèles interactifs plutôt que les cartes « remplies ».

Les utilisateurs peuvent choisir d’effectuer un raffinement conjoint des données de rayons X / neutrons de leur structure, ou un raffinement des données neutroniques uniquement. La visualisation de cartes SLD neutroniques, en particulier à basse résolution, peut être initialement déconcertante, en particulier pour une protéine hydrogénée dans laquelle H est toujours présent sur des sites non échangeables malgré l’échange de vapeur H / D. Il en résulte des annulations de cartes de densité neutronique, donnant l’impression de cartes ^{discontinues65,66}. La collecte d’un jeu de données radiographiques correspondant complète avantageusement ces annulations dans un raffinement conjoint (Figure 13A et Figure 13B). Une stratégie de raffinement conjoint consiste généralement à affiner les coordonnées de l’épine dorsale des protéines par rapport aux données de rayons X, tandis que les données de diffraction des neutrons sont utilisées pour affiner la position et l’occupation des atomes H/D sur des sites ^{échangeables28}. Étant donné que l’introduction de l’occupation conjointe H/D sur les sites échangeables augmente le nombre de paramètres affinés, un raffinement conjoint avec des données radiographiques augmente également le rapport données-paramètres. Un raffinement conjoint nécessite qu’un ensemble de données de rayons X correspondant soit collecté à la même température sur le même cristal ou un cristal cultivé dans les mêmes conditions. Pour les données de diffraction neutronique recueillies à température ambiante (300 K), l’ensemble de données en rayons X correspondant doit être recueilli à température ambiante à l’aide d’une stratégie de collecte de données à faible dose pour limiter les dommages causés par les rayonnements. Les échantillons perdeuterated, en revanche, fournissent des cartes SLD neutroniques améliorées et continues car ils ne possèdent pas la même magnitude d’annulation du signal H / D. Cependant, la longueur de diffusion neutronique de certains éléments, y compris les métaux et le soufre, les rend mal visibles dans les cartes SLD neutroniques, même si la protéine a été perruquée (Figure 13C-F)¹⁸. Si un métal doit être caractérisé, il est préférable d’utiliser la diffraction des rayons X dans un raffinement conjoint ou d’appliquer des techniques spectroscopiques pour compléter les expériences de diffraction. Les raffinements des données neutroniques uniquement sont souvent effectués lorsque l’ensemble de données neutroniques a une résolution élevée ou si une protéine perdeuterated a été utilisée. En outre, le raffinement des données sur les neutrons uniquement est particulièrement utile si une protéine très sensible aux dommages causés par les rayonnements est à l’étude, car une structure dérivée des rayons X peut posséder des artefacts induits par les rayonnements. Si un raffinement des données neutroniques uniquement doit être effectué, il faut vérifier si l’ensemble de données neutroniques correspondant est suffisamment complet et résolution.

ORNL offre deux installations pour la collecte de données de diffraction neutronique : la ligne de faisceau IMAGINE au HFIR ainsi que la ligne de faisceau MaNDi au ^SNS36,67. Bien que les deux instruments fournissent des moyens efficaces de collecter un ensemble de données de diffraction neutronique utilisant des principes similaires, chaque instrument a des spécifications uniques qui doivent être prises en compte lors de l’application du temps de faisceau. IMAGINE collecte des données quasi-Laue et est optimisé pour la collecte de données à température ambiante sur des cristaux avec des cellules unitaires jusqu’à ~100 Å. MaNDi peut être utilisé pour la collecte de données de température ambiante et de cryo-température en utilisant la collecte TOF-Laue sur des cristaux avec des cellules unitaires jusqu’à ~ 300 Å. Avant de collecter un ensemble de données complet, un test est effectué sur le cristal pour évaluer la qualité du motif de diffraction obtenu dans lequel le cristal est exposé au faisceau de neutrons pour une seule image. Si le cristal est de qualité suffisante, un ensemble de données complet sur la diffraction des neutrons sera collecté, indexé, intégré, mis à l’échelle et fusionné dans un processus analogue au traitement des données par rayons X. IMAGINE utilise Lauegen et Lscale et MaNDi utilise le package Mantid et utilise un raccord de profil tridimensionnel48,50,51,68,69,70. Les scientifiques qui deviennent des utilisateurs de l’une ou l’autre de ces installations recevront un ensemble de données au format MTZ ou HKL pour une analyse plus approfondie.

La diffraction neutronique est une technique non destructive et très sensible pour sonder l’état de protonation et les interactions de liaison hydrogène des macromolécules biologiques. Il est particulièrement utile pour les protéines photosensibles et les métalloprotéines. Plusieurs considérations concernant la technique ainsi que le traitement des données doivent être prises en compte avant de mener une expérience, mais le résultat donne des résultats qui peuvent donner un aperçu précieux du mécanisme catalytique de la protéine d’intérêt. La cristallographie des protéines neutroniques complète les études computationnelles, structurelles, biochimiques et spectroscopiques, ce qui en fait un outil précieux dans la boîte à outils des techniques utilisées par le biologiste pour caractériser les macromolécules biologiques.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des expériences d’expression, de purification et de cristallisation des protéines ont été menées au Center for Structural Molecular Biology (CSMB), un centre d’utilisateurs de recherche biologique et environnementale du département de l’Énergie des États-Unis au Oak Ridge National Laboratory. Les données de diffraction des neutrons ont été recueillies au BL-11B MaNDi à la source de neutrons de spallation (SNS) de l’ORNL, qui est parrainée par la Division des installations pour les utilisateurs scientifiques, Office of Basic Energy Sciences, Département de l’énergie des États-Unis. Les auteurs remercient Brendan Sullivan pour son aide à la réduction des données. Les données de diffraction des rayons X ont été collectées dans les installations du Molecular Education, Technology, and Research Innovation Center (METRIC) de la North Carolina State University, qui est soutenue par l’État de Caroline du Nord. GCS reconnaît le soutien en partie de la National Research Foundation (NRF), de l’Afrique du Sud et du programme Graduate Opportunities (GO!) de l’ORNL. FM reconnaît le soutien de l’USDA NIFA Hatch 211001.

Materials

List of materials used in this article
Name	Company	Catalog Number	Comments
Pointe de papier absorbant Taille #30-#40, longueur 60 mm	DiaDent/DiaVet	218-292
Cire capillaire	Hampton	HR4-328
CCP4		Version 7.0.077
Tubes à centrifuger coniques (15 mL)Tubes à centrifuger	Corning	CLS430790
(50mL)	Corning	CLS430828
Coot		Version 0.8.9.2
CrystalCap ALS	Hampton	HR4-779
Pince à pointe incurvée	Mitegen	TW-CTF-1
Solution de chlorure de deutérium, 35 % en poids dans D2O, &ge ; 99 atomes % D	Sigma-Aldrich	543047
Oxyde de deutérium 99,9 atomes % D	Sigma-Aldrich	151882
Dual Thickness MicroLoops 1000 µ ; m	Mitegen	M5-L18SP-1000
FiveEasy pH-mètre F20-Std-Kit	Mettler Toledo	30266626
Foam Dewars Standard Vessel 800 ml	Spearlab	M-FD-800
Four Color Mounting Clay	Hampton	HR4-326
HEPES, BioUltra, pour la biologie moléculaire, &ge ; 99.5 % (T),	Sigma-Aldrich	54457
Diffractomètre à rayons X à anode tournante à haut flux avec détecteur EIGER 4M	Rigaku, Oxford Cryostream et Dectris	XtaLAB Synergy-R	Source domestique Diffractomètre à rayons X
Baguette magnétique Droite	Mitegen	M-R-1013198
Microloader, embout pour le remplissage de Femtotips et d’autres microcapillaires en verre (à des fins de recherche uniquement), 0,5 &ndash ; 20 et micro ; L, 100 mm, gris clair, 192 pièces (2 paniers & fois ; 96 pièces)	Eppendorf	930001007
Microtubes volume 1,5 mL	Eppendorf	Z606340
avec couvercle transparent 100 mm de diamètre	Fischerbrand	FB0875713
Phenix		Version 1.14-3260
Pin' Tong 18 mm	Mitegen	M-R-1013196
Pipette Volume 0.1-2.5 &mu ; L	Eppendorf Recherche	Z683779
Pipette Volume 100-1000 &mu ; L	Eppendorf Pipette	de recherche Z683825
Volume 10-100 &mu ; L	Eppendorf Pipette	de recherche Z683809
Volume 20-200 &mu ; L	Eppendorf Research	Z683817
Poly(éthylène glycol) BioXtra, poids molaire moyen 3 350, poudre	Sigma-Aldrich	P4338
Capillaire en quartz, diamètre intérieur de 1,00 mm, longueur de 80 mm	Hampton	HR6-146	Système de
stéréomicroscope de recherche	Olympus	SZX16
Bases de goniomètre réutilisables B3 (style SSRL/SAM)	Mitegen	GB-B3-R
Round - Tube miniature en verre creux (VitroTubes) Quartz fondu clair / 1,00 mm de diamètre intérieur, 100 mm de longueur	VitroCom	CV1012	capillaire à paroi épaisse
avec couvercle	Hampton	HR3-132
Plaque de verre siliconée à 9 puits	Hampton	HR3-134
Plaque de cristallisation à goutte assise (24 Big Well)	Mitegen	XQ-P-24S-A
Solution de deutéroxyde de sodium, 40 % en poids dans D2O, 99 % d’atomes D	Sigma-Aldrich	176788
Lames de couvercle circulaire siliconées épaisses (22 mm x 0,96 mm)	Hampton	HR3-247
Embouts de pipette universels, 0,1 - 10 & micro ; L	VWR	76322-528
Pointes de pipette universelles, 1 - 100 & micro ; L	VWR	76322-136
Pointes de pipette universelles, 100 - 1000 & micro ; L	VWR	76322-154
Pointes de pipette universelles, 20 - 200 & micro ; L	VWR	76322-150
Pointes de pipette universelles, 1 - 20 & micro ; L	VWR	76322-134
Stylo cire	Hampton	HR4-342

coniques Boîtes de Pétri capillaire à paroi mince Boîte à sandwich

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Neumann, P., Tittmann, K. Marvels of enzyme catalysis at true atomic resolution: distortions, bond elongations, hidden flips, protonation states and atom identities. Current Opinion in Structural Biology. 29, 122-133 (2014).
Pynn, R. Neutron Scattering-A Non-destructive Microscope for Seeing Inside Matter. Neutron Applications in Earth, Energy and Environmental Sciences. , 15-36 (2009).
O'Dell, W. B., Bodenheimer, A. M., Meilleur, F. Neutron protein crystallography: A complementary tool for locating hydrogens in proteins. Archives of Biochemistry and Biophysics. 602, 48-60 (2016).
Niimura, N., Podjarny, A. Neutron Protein Crystallography: Hydrogen, Protons, and Hydration in Bio-macromolecules. , Oxford University Press. Oxford, UK. (2011).
Blakeley, M. P. P. Neutron macromolecular crystallography. Crystallography Reviews. 15 (3), 157-218 (2009).
Blakeley, M. P., Cianci, M., Helliwell, J. R., Rizkallah, P. J. Synchrotron and neutron techniques in biological crystallography. Chemical Society Reviews. 33 (8), 548-557 (2004).
Ashkar, R., et al. Neutron scattering in the biological sciences: progress and prospects. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (12), (2018).
Teixeira, S. C. M., et al. New sources and instrumentation for neutrons in biology. Chemical Physics. 345 (2-3), 133-151 (2008).
Furrer, A., Mesot, J., Strässle, T. Neutron Scattering in Condensed Matter Physics. , World Scientific Publishing Company. Singapore. (2009).
Meilleur, F., Coates, L., Cuneo, M. J., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. The neutron macromolecular crystallography instruments at Oak Ridge national laboratory: Advances, challenges, and opportunities. Crystals. 8 (10), 1-10 (2018).
Coates, L., et al. The Macromolecular Neutron Diffractometer MaNDi at the Spallation Neutron Source. Journal of Applied Crystallography. 48, 1302-1306 (2015).
Coates, L., Stoica, A. D., Hoffmann, C., Richards, J., Cooper, R. The macromolecular neutron diffractometer (MaNDi) at the Spallation Neutron Source, Oak Ridge: enhanced optics design, high-resolution neutron detectors and simulated diffraction. Journal of Applied Crystallography. 43 (3), 570-577 (2010).
Koetzle, T. F., Piccoli, P. M. B., Schultz, A. J. Single-crystal neutron diffraction studies of hydrogen-bonded systems: Two recent examples from IPNS. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 600 (1), 260-262 (2009).
Ng, J. D., et al. Large-volume protein crystal growth for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section F:Structural Biology Communications. 71, 358-370 (2015).
Blakeley, M. P., Langan, P., Niimura, N., Podjarny, A. Neutron crystallography: opportunities, challenges, and limitations. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 593-600 (2008).
Sears, V. F. Neutron scattering lengths and cross sections. Neutron News. 3 (3), 26-37 (1992).
Weik, M., Patzelt, H., Zaccai, G., Oesterhelt, D. Localization of glycolipids in membranes by in vivo labeling and neutron diffraction. Molecular Cell. 1 (3), 411-419 (1998).
Helliwell, J. R. Fundamentals of neutron crystallography in structural biology. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Niimura, N., Bau, R. Neutron protein crystallography: Beyond the folding structure of biological macromolecules. Acta Crystallographica Section A: Foundations of Crystallography. 64 (1), 12-22 (2008).
Hazemann, I., et al. High-resolution neutron protein crystallography with radically small crystal volumes: Application of perdeuteration to human aldose reductase. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (10), 1413-1417 (2005).
Niimura, N., Chatake, T., Ostermann, A., Kurihara, K., Tanaka, I. High resolution neutron protein crystallography. Hydrogen and hydration in proteins. Zeitschrift für Kristallographie - Crystalline Materials. 218 (2), (2003).
Meilleur, F., Contzen, J., Myles, D. A. A., Jung, C. Structural stability and dynamics of hydrogenated and perdeuterated cytochrome P450cam (CYP101). Biochemistry. 43 (27), 8744-8753 (2004).
Bennett, B. C., Gardberg, A. S., Blair, M. D., Dealwis, C. G. On the determinants of amide backbone exchange in proteins: A neutron crystallographic comparative study. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 64 (7), 764-783 (2008).
Meilleur, F., Kovalevsky, A., Myles, D. A. A. IMAGINE: The neutron protein crystallography beamline at the high flux isotope reactor. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Wang, X. P., et al. A suite-level review of the neutron single-crystal diffraction instruments at Oak Ridge National Laboratory. Review of Scientific Instruments. 89 (9), 092802(2018).
Wlodawer, A., Hendrickson, W. A. A procedure for joint refinement of macromolecular structures with X-ray and neutron diffraction data from single crystals. Acta Crystallographica Section A. 38 (2), 239-247 (1982).
Halle, B. Biomolecular cryocrystallography: Structural changes during flash-cooling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (14), 4793-4798 (2004).
Adams, P. D., Mustyakimov, M., Afonine, P. V., Langan, P. Generalized X-ray and neutron crystallographic analysis: More accurate and complete structures for biological macromolecules. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 65 (6), 567-573 (2009).
Berman, H. M., et al. The Protein Data Bank. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 58 (6), 899-907 (2002).
Liebschner, D., Afonine, P. V., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Evaluation of models determined by neutron diffraction and proposed improvements to their validation and deposition. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 800-813 (2018).
Afonine, P. V., Mustyakimov, M., Grosse-Kunstleve, R. W., Moriarty, N. W., Langan, P., Adams, P. D. Joint X-ray and neutron refinement with phenix.refine. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 66 (11), 1153-1163 (2010).
Brünger, A. T., et al. Crystallography & NMR system: A new software suite for macromolecular structure determination. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 54 (5), 905-921 (1998).
Gruene, T., Hahn, H. W., Luebben, A. V., Meilleur, F., Sheldrick, G. M. Refinement of macromolecular structures against neutron data with SHELXL2013. Journal of Applied Crystallography. 47 (1), 462-466 (2014).
Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica Section D Biological Crystallography. 66 (4), 486-501 (2010).
Lakey, J. H. Neutrons for biologists: A beginner's guide, or why you should consider using neutrons. Journal of the Royal Society Interface. 6, Suppl. 5 (2009).
Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, 778-786 (2018).
Halsted, T. P., et al. Catalytically important damage-free structures of a copper nitrite reductase obtained by femtosecond X-ray laser and room-temperature neutron crystallography. IUCrJ. 6, 761-772 (2019).
Meier, K. K., et al. Oxygen Activation by Cu LPMOs in Recalcitrant Carbohydrate Polysaccharide Conversion to Monomer Sugars. Chemical Reviews. 118 (5), 2593-2635 (2018).
Beeson, W. T., Vu, V. V., Span, E. A., Phillips, C. M., Marletta, M. A. Cellulose Degradation by Polysaccharide Monooxygenases. Annual Review of Biochemistry. 84 (1), 923-946 (2015).
Walton, P. H., Davies, G. J. On the catalytic mechanisms of lytic polysaccharide monooxygenases. Current Opinion in Chemical Biology. 31, 195-207 (2016).
Bertini, L., et al. Catalytic Mechanism of Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenases Investigated by First-Principles Calculations. Inorganic Chemistry. 57 (1), 86-97 (2018).
Hedegård, E. D., Ryde, U. Molecular mechanism of lytic polysaccharide monooxygenases. Chemical Science. 9 (15), 3866-3880 (2018).
Hangasky, J. A., Detomasi, T. C., Marletta, M. A. Glycosidic Bond Hydroxylation by Polysaccharide Monooxygenases. Trends in Chemistry. 1 (2), 198-209 (2019).
Bacik, J. P., et al. Neutron and Atomic Resolution X-ray Structures of a Lytic Polysaccharide Monooxygenase Reveal Copper-Mediated Dioxygen Binding and Evidence for N-Terminal Deprotonation. Biochemistry. 56 (20), 2529-2532 (2017).
O'Dell, W. B., Agarwal, P. K., Meilleur, F. Oxygen Activation at the Active Site of a Fungal Lytic Polysaccharide Monooxygenase. Angewandte Chemie - International Edition. 56 (3), 767-770 (2017).
O'Dell, W. B., Swartz, P. D., Weiss, K. L., Meilleur, F. Crystallization of a fungal lytic polysaccharide monooxygenase expressed from glycoengineered Pichia pastoris for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section:F Structural Biology Communications. 73 (2), 70-78 (2017).
Meilleur, F., et al. The IMAGINE instrument: First neutron protein structure and new capabilities for neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 69 (10), 2157-2160 (2013).
Helliwell, J. R., et al. The recording and analysis of synchrotron X-radiation Laue diffraction photographs. Journal of Applied Crystallography. 22 (5), 483-497 (1989).
Nieh, Y. P., et al. Accurate and highly complete synchrotron protein crystal Laue diffraction data using the ESRF CCD and the Daresbury Laue software. Journal of Synchrotron Radiation. 6 (5), 995-1006 (1999).
Arzt, S., Campbell, J. W., Harding, M. M., Hao, Q., Helliwell, J. R. LSCALE - The new normalization, scaling and absorption correction program in the Daresbury Laue software suite. Journal of Applied Crystallography. 32 (3), 554-562 (1999).
Sullivan, B., et al. Improving the accuracy and resolution of neutron crystallographic data by three-dimensional profile fitting of Bragg peaks in reciprocal space. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74 (11), 1085-1095 (2018).
Sullivan, B., et al. BraggNet: integrating Bragg peaks using neural networks. Journal of Applied Crystallography. 52 (4), 854-863 (2019).
Schröder, G. C., O'Dell, W. B., Myles, D. A. A., Kovalevsky, A., Meilleur, F. IMAGINE: Neutrons reveal enzyme chemistry. Acta Crystallographica Section D: Structural Biology. 74, (2018).
Blum, M. M., et al. Preliminary time-of-flight neutron diffraction study on diisopropyl fluorophosphatase (DFPase) from Loligo vulgaris. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 63 (1), 42-45 (2007).
Tomanicek, S. J., et al. Neutron and X-ray crystal structures of a perdeuterated enzyme inhibitor complex reveal the catalytic proton network of the Toho-1 β-lactamase for the acylation reaction. Journal of Biological Chemistry. 288 (7), 4715-4722 (2013).
Metcalfe, C., et al. The tuberculosis prodrug isoniazid bound to activating peroxidases. Journal of Biological Chemistry. 283 (10), 6193-6200 (2008).
Hughes, R. C., et al. Inorganic pyrophosphatase crystals from Thermococcus thioreducens for X-ray and neutron diffraction. Acta Crystallographica Section F: Structural Biology and Crystallization Communications. 68 (12), 1482-1487 (2012).
Bennett, B. C., Meilleur, F., Myles, D. A. A., Howell, E. E., Dealwis, C. G. Preliminary neutron diffraction studies of Escherichia coli dihydrofolate reductase bound to the anticancer drug methotrexate. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 61 (5), 574-579 (2005).
Snell, E. H., et al. Optimizing crystal volume for neutron diffraction: D-xylose isomerase. European Biophysics Journal. 35 (7), 621-632 (2006).
Golden, E., Attwood, P. V., Duff, A. P., Meilleur, F., Vrielink, A. Production and characterization of recombinant perdeuterated cholesterol oxidase. Analytical Biochemistry. 485, 102-108 (2015).
Munshi, P., et al. Rapid visualization of hydrogen positions in protein neutron crystallographic structures. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 68 (1), 35-41 (2012).
Logan, D. T. Interactive model building in neutron macromolecular crystallography. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Koruza, K., Lafumat, B., Végvári,, Knecht, W., Fisher, S. Z. Deuteration of human carbonic anhydrase for neutron crystallography: Cell culture media, protein thermostability, and crystallization behavior. Archives of Biochemistry and Biophysics. 645, 26-33 (2018).
Fisher, S. J., et al. Perdeuteration: Improved visualization of solvent structure in neutron macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 70 (12), 3266-3272 (2014).
Chen, J. C. H., Hanson, B. L., Fisher, S. Z., Langan, P., Kovalevsky, aY. Direct observation of hydrogen atom dynamics and interactions by ultrahigh resolution neutron protein crystallography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 109 (38), 15301-15306 (2012).
Cuypers, M. G., et al. Near-atomic resolution neutron crystallography on perdeuterated Pyrococcus furiosus rubredoxin: Implication of hydronium ions and protonation state equilibria in redox changes. Angewandte Chemie - International Edition. 52 (3), 1022-1025 (2013).
Coates, L., Sullivan, B. The macromolecular neutron diffractometer at the spallation neutron source. Methods in Enzymology. 634, Elsevier Inc. (2020).
Ren, Z., Kingman, N. G., Borgstahl, G. E. O., Getzoff, E. D., Moffat, K. Quantitative Analysis of Time-Resolved Laue Diffraction Patterns. Journal of Applied Crystallography. 29 (3), 246-260 (1996).
Campbell, J. W., Hao, Q., Harding, M. M., Nguti, N. D., Wilkinson, C. LAUEGEN version 6.0 and INTLDM. Journal of Applied Crystallography. 31 (3), 496-502 (1998).
Arnold, O., et al. Mantid - Data analysis and visualization package for neutron scattering and μ SR experiments. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 764, 156-166 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Collecte et traitement de données de cristallographie neutronique pour la modélisation des atomes d’hydrogène dans les structures protéiques

In This Article

Summary

Abstract

Introduction

Protocol

Results

Discussion

Disclosures

Acknowledgements

Materials

References

Reprints and Permissions

Tags

Related Articles