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Article de méthode

Différenciation des cellules précurseurs neuronales induites par le champ électrique dans les appareils microfluidiques

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DOI :

10.3791/61917

⸱

14 avril 2021

 ,  , 
1Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica, 2Institute of Biophotonics, National Yang Ming Chao Tung University, 3Department of Mechanical and Mechatronic Engineering, National Taiwan Ocean University, 4College of Engineering, Chang Gung University

Dans cet article

Résumé

Dans cette étude, nous présentons un protocole pour la différenciation des cellules souches neurales et progénitrices (PNJ) uniquement induite par la stimulation par impulsions à courant direct (DC) dans un système microfluidique.

Résumé

Les champs électriques physiologiques (EF) jouent un rôle vital dans la migration cellulaire, la différenciation, la division et la mort. Cet article décrit un système microfluidique de culture cellulaire qui a été employé pour une étude à long terme de différenciation cellulaire utilisant la microscopie. Le système microfluidique se compose des principaux composants suivants : une puce électrotaxique optiquement transparente, un chauffe-eau transparent à oxyde d’indium-étain (ITO), une pompe de remplissage des médias de culture, une alimentation électrique, un amplificateur de puissance à haute fréquence, un multiplexeur EF, un stade motorisé X-Y-Z programmable et un microscope à contraste de phase inversé équipé d’un appareil photo numérique. Le système microfluidique est bénéfique pour simplifier la configuration expérimentale globale et, à son tour, le reagent et la consommation d’échantillons. Ces travaux impliquent la différenciation des cellules souches neurales et progénitrices (PNJ) induites par la stimulation pulsée à courant direct (DC). Dans le milieu d’entretien des cellules souches, les PNJ de souris se sont différenciés en neurones, astrocytes et oligodendrocytes après la stimulation par impulsions DC. Les résultats suggèrent que le traitement simple d’impulsion de DC pourrait contrôler le sort des mNPCs et pourrait être employé pour développer des stratégies thérapeutiques pour des désordres de système nerveux. Le système peut être utilisé pour la culture cellulaire dans plusieurs canaux, pour la stimulation à long terme ef, pour l’observation morphologique cellulaire, et pour l’acquisition automatique d’image time-lapse. Ce système microfluidique raccourcit non seulement le temps expérimental requis, mais augmente également la précision du contrôle sur le microenvironnement.

Introduction

Les cellules précurseurs neurales (PNJ, également connues sous le nom de cellules souches neurales et progénitrices) peuvent être un candidat prometteur pour la stratégie thérapeutiqueneurodégénérative 1. Les PNJ indifférenciés ont une capacité d’auto-renouvellement, une multi-puissance et une capacité proliférative2,3. Une étude précédente a rapporté que la matrice extracellulaire et les médiateurs moléculaires régulent la différenciation du PNJ. Le facteur de croissance épidermique (FEM) et le facteur de croissance fibroblaste de base (bFGF) favorisent la prolifération des PNJ, maintenant ainsi l’état indifférencié4.

Des études antérieures ont rapporté que la stimulation électrique peut réguler les activités physiologiques cellulaires telles que la division5,la migration6,7,8, la différenciation1,9,10, et la mort cellulaire11. Les champs électriques (FE) jouent un rôle vital dans le développement et la régénération du développement du système nerveux central12,13,14. De 2009 à 2019, ce laboratoire a étudié les réponses cellulaires à l’application de l’EF dans le système microfluidique1,6,7,8,15,16,17. Une puce électrotaxique multicanal, optiquement transparente et électrotaxique (MOE) a été conçue pour convenir à la coloration par immunofluorescence pour la microscopie confocale. La puce avait une grande transparence optique et une bonne durabilité et a permis la conduite simultanée de trois expériences de stimulation indépendantes et plusieurs conditions immunotachées dans une seule étude. Le système microfluidique est bénéfique pour simplifier la configuration expérimentale globale et, à son tour, le reagent et la consommation d’échantillons. Cet article décrit le développement d’un système de culture cellulaire microfluidique qui a été utilisé pour une étude de différenciation cellulaire à long terme.

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Protocole

1. Conception et fabrication de la puce MOE

  1. Dessiner des motifs pour les couches individuelles de méthacrylate polyméthyle (PMMA) et le ruban adhésif à double face à l’aide d’un logiciel approprié (Figure 1A, Tableau des matériaux). Coupez à la fois les feuilles PMMA et le ruban adhésif à double face à l’aided’un scriber de machine laser CO 2 (Figure 1B).
    1. Allumez lescriber laser CO 2 et connectez-le à un ordinateur personnel. Ouvrez le fichier de motifs conçu à l’aide du logiciel.
    2. Placez les feuilles PMMA (275 mm x 400 mm) ou le ruban adhésif à double face (210 mm x 297 mm) sur la plate-forme du scriber laser (figure 2A). Concentrez le laser sur la surface des feuilles PMMA ou sur le ruban adhésif à double face à l’aide de l’outil de mise au point automatique.
    3. Sélectionnez le scriber laser comme imprimante, puis « imprimez » le motif à l’aide du scriber laser pour commencer l’ablation directe sur la feuille PMMA ou le ruban adhésif à double face et obtenir des motifs individuels sur la feuille ou le ruban PMMA (figure 2B).
  2. Retirez le film protecteur des feuilles pmma et nettoyez la surface à l’aide de gaz azoté.
    REMARQUE : Le dessin du modèle PMMA et l’usinage direct de la feuille pmma ont été effectués selon un rapport précédent17.
  3. Pour lier plusieurs couches de feuilles PMMA, empilez trois morceaux de feuilles PMMA de 1 mm (couches 1, 2 et 3) et les lier sous une pression de 5 kg/cm2 dans un obligataire thermique pendant 30 min à 110 °C pour former l’assemblage du canal de stimulation électrique(figure 2C).
    REMARQUE : Différents lots de feuilles PMMA obtenues commercialement ont une température de transition du verre légèrement différente (Tg). La température optimale de liaison doit être testée à des incréments de 5 °C près du Tg.
  4. Adhérez 12 pièces d’adaptateurs aux ouvertures individuelles de la couche 1 de l’assemblage de puces MOE avec de la colle cyanoacrylate à action rapide.
    REMARQUE : Les adaptateurs sont faits de PMMA par moulage par injection. Les surfaces plates en bas sont pour se connecter à la puce MOE. Les adaptateurs portant 1/4W-28 fil de vis femelle sont pour connecter les bouchons blancs finger-tight, connecteurs à fond plat, ou adaptateurs Luer. Soyez prudent lorsque vous utilisez de la colle cyanoacrylate à action rapide. Évitez de vous éclabousser dans les yeux.
  5. Désinfectez les substrats PMMA de 1 mm (couches 1-3), le ruban à double face (couche 4) et le PMMA optique de 3 mm (couche 5) à l’aide de l’irradiation ultraviolette (UV) pendant 30 minutes avant d’assembler la puce (figure 1A).
  6. Adhérez aux substrats PMMA de 1 mm (couches 1-3) sur le PMMA optique de 3 mm (couche 5) avec le ruban à double face (couche 4) pour compléter l’assemblage PMMA (couches 1-5) (figure 1A).
  7. Préparer le verre de couverture propre pour l’assemblage sur la puce.
    1. Remplissez une dilution décuplé du détergent dans un bocal à taches (voir la table des matériaux)et nettoyez le verre de couverture dans ce détergent à l’aide d’un nettoyant à ultrasons pendant 15 min.
    2. Rincer soigneusement le bocal à taches sous l’eau courante du robinet pour enlever toutes les traces du détergent.
    3. Continuer le rinçage avec de l’eau distillée pour enlever toutes les traces d’eau du robinet, et répéter l’étape 1.7.2 deux fois.
    4. Séchez le verre de couverture nettoyé en le soufflant avec du gaz azoté.
  8. Désinfecter l’assemblage pmma (couches 1-5), le ruban à double face (couche 6) et le verre de couverture (couche 7) à l’aide d’irradiation UV à l’intérieur d’une armoire de biosécurité pendant 30 minutes avant d’assembler la puce (figure 1A).
  9. Adhérez au verre de couverture nettoyé (couche 7) à l’assemblage PMMA (couches 1-5) avec le ruban adhésif à double face (couche 6) (figure 1A).
  10. Incuber la puce MOE dans une chambre à vide pendant la nuit; utiliser l’assemblage des puces MOE pour les procédures ultérieures( figure 3).

2. Revêtement poly-L-lysine (PLL) sur le substrat dans les régions de culture cellulaire

  1. Préparer le tube en polytétrafluoroéthylène, le connecteur à fond plat, le connecteur cône, l’adaptateur cone-Luer, le bouchon blanc serré au doigt (aussi appelé bouchon), l’adaptateur Luer, la seringue à serrure Luer et le bung en caoutchouc noir(figure 4A, tableau des matériaux). Stériliser tous les composants ci-dessus dans une autoclave à 121 °C pendant 30 min.
  2. Sceller les ouvertures des adaptateurs du pont d’agar (Figure 1A) avec les bouchons blancs serrés aux doigts. Connectez le connecteur à fond plat à l’assemblage des puces MOE via les adaptateurs d’entrée et de sortie moyens (Figure 4B). Connectez l’adaptateur cône-Luer aux robinets d’arrêt à trois sens.
  3. Ajouter 2 mL de solution PLL de 0,01 % à l’aide d’une seringue de 3 mL qui se connecte au robinet d’arrêt à 3 sens de l’entrée moyenne (figure 4B- figure-protocol-1 ).
  4. Connectez une seringue vide de 3 mL au robinet d’arrêt à 3 sens de la prise moyenne (figure 4B- figure-protocol-2 ).
  5. Remplissez les régions de culture cellulaire avec la solution PLL. Pompez manuellement la solution de revêtement dans les deux sens lentement. Fermez les deux robinets à trois pour sceller la solution à l’intérieur des régions de culture.
  6. Incuber la puce MOE à 37 °C pendant la nuit dans un incubateur rempli d’une atmosphère de CO2 à 5 %.

3. Préparation du réseau de ponts salés

  1. Après l’étape 2.6, ouvrez les deux robinets d’arrêt à trois voies et chassez les bulles dans les canaux en pompant manuellement la solution de revêtement dans les deux sens dans le canal à l’aide des deux seringues.
  2. Dessiner 3 mL de milieu complet (milieu d’entretien des cellules souches composé du mélange d’nutritifs moyen/jambon modifié de Dulbecco F-12 (DMEM/F12), supplément de 2 % B-27, 20 ng/mL EGF, et 20 ng/mL bFGF) dans une seringue de 3 mL qui se connecte au robinet d’arrêt à 3 sens de l’entrée moyenne (figure 4B- figure-protocol-3 et figure 4B- figure-protocol-4 ).
  3. Ajouter 3 mL de milieu complet pour remplacer la solution de revêtement dans les régions de culture cellulaire. Connectez une seringue vide de 5 mL au robinet d’arrêt à 3 sens de la prise moyenne (figure 4B- figure-protocol-5 ).
  4. Préparer le réseau de ponts salés( figure 5).
    1. Couper l’élastique en caoutchouc noir pour produire un espace, et insérer les électrodes de chlorure d’argent (Ag)/argent (AgCl) à travers le cachot en caoutchouc noir et dans la seringue de verrouillage Luer (Figure 4A).
    2. Remplacez le bouchon fingertight blanc par l’adaptateur Luer et injectez 3% d’agarose chaude pour remplir l’adaptateur Luer.
      REMARQUE : Pour la préparation de l’agarose chaude, dissoudre 3 g de poudre d’agarose dans 100 mL de solution saline tamponnée de phosphate (PBS) et stériliser dans une autoclave à 121 °C pendant 30 min.
    3. Connectez la seringue luer à l’adaptateur Luer. Injecter 3% d’agarose chaude à travers la bouse en caoutchouc noir pour remplir la seringue de verrouillage Luer à l’aide de la seringue avec l’aiguille. Laisser refroidir et solidifier de 10 à 20 minutes pour que l’agarose refroidisse et se solidifie.
      REMARQUE : Afin d’augmenter la capacité de volume de l’agarose, la seringue de verrouillage Luer est montée sur l’adaptateur Luer (figure 4 et figure 5). Ensuite, les grosses électrodes sont insérées dans la seringue de verrouillage Luer. L’électrode est capable de fournir une stimulation électrique stable pour l’expérience à long terme.

4. Préparation des MNPC

  1. Culture des mNPCs1 dans le milieu complet dans un flacon de culture cellulaire 25T à 37 °C dans un incubateur rempli de 5% d’atmosphère de CO2. Sous-culture des cellules tous les 3-4 jours, et effectuer toutes les expériences avec des cellules qui ont subi 3-8 passages de la source d’origine.
  2. Transférer la suspension cellulaire dans un tube conique de 15 mL et faire tourner les neurosphères à 100 × g pendant 5 min. Aspirez le supernatant et lavez les neurosphères avec le PBS (DPBS) de Dulbecco. Faites tourner les neurosphères à 100 × g pendant 5 min.
  3. Aspirer le 1x DPBS, puis résusquer les neurosphères dans le milieu complet. Bien mélanger et délicatement.
  4. Ajouter 1 mL de suspension neurosphère à l’aide d’une seringue de 1 mL qui se connecte au robinet d’arrêt à 3 sens de la prise (Figure 4B- figure-protocol-6 ).

5. Configuration du système microfluidique pour la stimulation par impulsions DC (Figure 6)

  1. Installez la puce MOE ensemencée sur le chauffe-eau ITO transparent qui est fixé sur un stade motorisé X-Y-Z programmable.
    REMARQUE : La température de surface de l’ITO est contrôlée par un contrôleur dérivé intégral proportionnel et maintenue à 37 °C. Un thermocouple de type K est serré entre la puce et le chauffe-eau ITO pour surveiller la température des régions de culture cellulaire à l’intérieur de la puce. La puce MOE est installée sur une scène motorisée X-Y-Z programmable et convient à l’acquisition automatique d’images en accéléré dans différentes sections de canaux. La fabrication du chauffe-eau ITO et la configuration du système de chauffage de culture cellulaire ont été décritesprécédemment 18,19.
  2. Infuser les mNPCs en pompant manuellement dans la puce MOE via la prise moyenne. Incuber la puce MOE ensemencée sur le chauffe-eau ITO de 37 °C pendant 4 h.
  3. Après 4 h, pomper le milieu complet à travers la puce MOE via l’entrée moyenne à un débit de 20 μL/h à l’aide d’une pompe à seringues.
    REMARQUE : Les mNPC sont cultivés et maintenus dans la puce pendant 24 h supplémentaires avant la stimulation ef pour permettre l’attachement et la croissance cellulaires. Le liquide de déchets est recueilli dans une seringue vide de 5 mL reliée au robinet d’arrêt à trois sens de la prise, présentée comme des « déchets » à la figure 6A. La configuration du système microfluidique MOE est indiquée dans la figure 6. Ce système microfluidique fournit un approvisionnement continu en nutrition aux cellules. Le milieu frais complet est continuellement pompé dans la puce MOE pour maintenir une valeur de pH constante. Par conséquent, les cellules peuvent être cultivés en dehors d’un incubateur de CO2.
  4. Utilisez des fils électriques pour connecter un multiplexeur EF à la puce MOE via les électrodes Ag/AgCl sur la puce. Connectez un multiplexeur EF et un générateur de fonction à un amplificateur pour produire des impulsions DC à ondes carrées d’une magnitude de 300 mV/mm à une fréquence de 100 Hz à 50 % de cycles de service (50 % de temps de repos et 50 % de temps libre) (figure 6B).
    1. Connectez les fils électriques au multiplexeur EF. Connectez les fils électriques à la puce MOE via les électrodes Ag/AgCl.
    2. Connectez le multiplexeur EF à l’amplificateur à l’aide de fils électriques. Connectez le générateur de fonction à l’amplificateur et à l’oscilloscope numérique.
      REMARQUE : Le multiplexeur EF est un circuit qui inclut l’impedance de la chambre culturelle du circuit et relie toutes les chambres individuelles dans un réseau électronique parallèle. Chacune des trois chambres de culture est reliée électriquement en série à une résistance variable (Vr) et à un ammètre (indiqué sous le nom de μA dans la figure 6A)dans le multiplexeur. Le courant électrique à travers chaque chambre de culture est varié en contrôlant le Vr, et le courant est indiqué sur l’ammètre correspondant. La force du champ électrique dans chaque région de culture cellulaire a été calculée par ohm’s Law, I= νEA, où je suis le courant électrique, σ (fixé comme 1,38 S·m-1 pour DMEM/F1220) est la conductivité électrique du milieu de culture, E est le champ électrique, et A est la zone transversale de la chambre électrotaxique. Pour la dimension de la région de culture cellulaire indiquée à la figure 1,le courant électrique est de ~87 mA et ~44 mA pour l’impulsion DC et DC à 50% de cycle de service, respectivement.
  5. Soumettons les mNPCs à des impulsions carrées de DC d’une magnitude de 300 mV/mm à la fréquence de 100 Hz pendant 48h. Pompez continuellement le milieu complet à un taux de 10 μL/h pour fournir une nutrition adéquate aux cellules et maintenir une valeur constante de pH dans le milieu.

6. Analyses d’immunofluorescence des mNPCs après stimulation pulsée de DC

REMARQUE : Dans cette étape, tout le réaccente est pompé par l’entrée moyenne à l’aide d’une pompe à seringues.

  1. Après 3, 7 ou 14 jours de culture in vitro (DIV) après l’ensemencement1,laver les cellules avec 1x PBS à un débit de 25 μL/min pendant 20 min.
  2. Fixer les cellules avec 4% de paraformaldéhyde (PFA). Pompez 4% PFA dans la puce à un débit de 25 μL/min pendant 20 min pour remplacer le 1x PBS. Pour remplacer le PFA de 4 %, lavez les cellules avec 1x PBS à un débit de 25 μL/min pendant 20 min.
  3. Pompez 0,1% Triton X-100 dans la puce à un débit de 50 μL/min pendant 6 min pour perméabiliser les cellules. Réduisez le débit à 50 μL/h pendant 30 minutes supplémentaires pour réagir avec les cellules. Pour remplacer le Triton X-100 de 0,1 %, lavez les cellules avec 1x PBS à un débit de 50 μL/min pendant 6 min.
  4. Bloquer les cellules avec PBS contenant 1% d’albumine de sérum bovin (BSA) pour réduire la liaison anticorps non spécifique. Pompez 1% BSA dans la puce à un débit de 50 μL/min pendant 6 min. Réduisez le débit à 100 μL/h et pompez pendant 1 h.
  5. Pomper les anticorps pour une double immunostaining dans la puce à un débit de 50 μL/min pendant 6 min, et incuber la puce pendant 18 h à 4 °C. Laver les cellules avec 1x PBS à un débit de 50 μL/min pendant 15 min.
  6. Pomper les anticorps secondaires conjugués Alexa Fluor dans la puce à un débit de 50 μL/min pendant 6 min. Réduisez le débit à 50 μL/h et pompez les anticorps pendant 1 h à température ambiante dans l’obscurité. Laver les cellules avec 1x PBS à un débit de 50 μL/min pendant 15 min.
  7. Pour la coloration nucléaire, pomper Hoechst 33342 dans la puce à un débit de 20 μL/min pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité. Laver les cellules avec 1x PBS à un débit de 50 μL/min pendant 15 min.
  8. Après immunostaining, observez les cellules à l’aide d’un microscope à fluorescence confoccale.

7. Analyse d’image et traitement de données

  1. Analyser les images fluorescentes à l’aide d’un logiciel à l’aide d’outils de mesure intégrés (voir le Tableau des matériaux).
  2. Comparez les noyaux hoechst-contre-tachés (nombre total de cellules) dans les groupes de contrôle et de traitement, et calculez le pourcentage de cellules exprimant chaque marqueur phénotypique.

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Résultats

La configuration détaillée de la puce MOE est indiquée à la figure 1. La puce microfluidique offre une approche bénéfique pour réduire la taille expérimentale de configuration, le volume de l’échantillon et le volume des réaccents. La puce MOE a été conçue pour effectuer trois expériences indépendantes de stimulation ef et plusieurs conditions d’immunostaining simultanément dans une seule étude (Figure 3). En outre, la puce MOE, ...

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Discussion

Lors de la fabrication de la puce MOE, les adaptateurs sont fixés à la couche 1 de la puce MOE avec de la colle cyanoacrylate à action rapide. La colle est appliquée sur 4 coins des adaptateurs, puis la pression est appliquée uniformément sur les adaptateurs. Une quantité excessive de colle doit être évitée pour assurer une polymérisation complète de la colle. De plus, l’assemblage de puces MOE complété est incubé dans une chambre à vide. Cette étape permet d’éliminer les bulles entre la couche PMMA, le ruban adhésif à d...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le professeur Tang K. Tang, de l’Institut des sciences biomédicales d’Academia Sinica, pour son aide dans la fourniture de cellules souches neurales et progénitrices (MNPCs) de souris. Les auteurs remercient également le professeur Tang K. Tang et Mme Ying-Shan Lee pour leur précieuse discussion sur la différenciation des MNPC.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Substrats PMMA de 1 mm (couches 1-3)BHTK2R20Polyméthacrylate de méthyle (PMMA), http://www.bothharvest.com/zh-tw/product-421076/Optical-PMMA-Non-Coated-BHT-K2Rxx-xx=-thickness-choices.html
tube en plastique de 15 mLProtech Technology Enterprise Co., LtdCT-15-PL-TWTube à fond conique avec bouchon, assemblé, préstérilisé
Seringue de 3 mLTERUMODVR-3413Seringues orales de 3 ml, sans aiguille
PMMA de qualité optique de 3 mm (couche 5)CHI MEI CorporationACRYPOLY FeuillePMMA
Robinet d’arrêt à 3 voiesNIPRONCN-3LSeringue stérile jetable à 3 voies
5 mLTERUMODVR-3410Seringues orales de 5 mL, sans aiguille
AdaptateurDong Zhong Co., Ltd.Adaptateur PMMApersonnalisé
AgaroseSigma-AldrichA9414Agarose, basse température de gélification
AmplificateurA.A. Lab Systems LtdA-304Amplificateur haute tension
Logiciel AutoCADAutodesk Version éducativeDessin
Supplément B-27Gibco12587-010Supplément B-27 (50x), moins vitamine A
Facteur de croissance des fibroblastes de base (bFGF)  ;PeprotechAF-100-18BAussi appelé FGF-basic humain recombinant
Bonde en caoutchouc noirTERUMODVR-3413À partir de seringues orales de 3 mL, sans aiguille
Albumine sérique bovine (BSA)Sigma-AldrichB4287Réactif bloquant  ;
CentrifugeuseHSIANGTAICV2060Centrifugeuse
CO2 scribe laserLaser Tools and Technics Corp.ILS-IIAcheté auprès de http://www.lttcorp.com/index.htm
connecteur coniqueIDEX Health & ScienceF-120XMonobloc étanche aux doigts 10-32 coned, pour 1/16" OD naturel
Cone-Lueradaptateur IDEX Health & ScienceP-659Luer Adaptateur 10-32 Femelle à Femelle Luer, PEEK
Microscope confocal à fluorescenceLeica MicrosystemsTCS SP5Leica TCS SP5 manuel d’utilisation, http://www3.unifr.ch/bioimage/wp-content/uploads/2013/10/User-Manual_TCS_SP5_V02_EN.pdf
Appareil photo numériqueOLYMPUSE-330Acquisition automatique d’images en accéléré
Oscilloscope numériqueTektronixTDS2024Mesurez les signaux de tension ou de courant au fil du temps dans un circuit ou un composant électronique pour afficher l’amplitude et la fréquence.
Ruban adhésif double face3M  ;PET 8018Acheté chez http://en.thd.com.tw/
Dulbecco' Eagle modifié' s moyen/Mélange nutritif de jambon F-12 (DMEM/F12)Gibco12400024DMEM/F-12, poudre,
solution saline tamponnée au phosphate HEPES DulbeccoGibco21600010DPBS, poudre, sans calcium, sans
magnésium multiplexeur EFAsiatic Sky Co., Ltd.PersonnaliséSurveillez et contrôlez le courant électrique dans des canaux individuels
Facteur de croissance épidermique (EGF)PeprotechAF-100-15Aussi appelé EGF humain recombinant
Colle cyanoacrylate à action rapide3M  ;7004TRésistance adhésif instantané (liquide)
Connecteur à fond platIDEX Santé & ScienceP-206Écrou mâle sans bride Delrin, 1/4-28 à fond plat, pour 1/16" OD bleu
Générateur de fonctionAgilent Technologies33120AHaute performance 15 MHz synthétisé  ; générateur de fonctions  ; avec capacité de forme d’onde arbitraire intégrée
Chèvre anti-souris IgG H& L (Alexa Fluor 488)Abcamab150117Chèvre anti-souris IgG H& L (Alexa Fluor 488) préadsorbé
Chèvre anti-lapin IgG H& L (Alexa Fluor 555)Abcamab150086Anticorps secondaire polyclonal de chèvre contre les IgG de lapin - H& L (Alexa Fluor 555), préadsorbé
Hoechst 33342InvitrogenH3570Coloration nucléaire
Logiciel ImageJInstitutes of Health1.48vAnalyser les images fluorescentes  ;
Indium&ndash ; étain&ndash ; verre d’oxyde (ITO)Merck300739Pour chauffage ITO
Microscope à contraste de phase inverséOLYMPUSCKX41Pour l’observation de la morphologie cellulaire
Thermocouple de type KTecpelTPK-02ATempérature  ; thermocouples
Adaptateur LuerIDEX Santé & ScienceP618-01Adaptateur Luer femelle Luer vers 1/4-28 polypropylène mâle
SeringueLuer lock TERUMODVR-3413Pour ponts de sel de gélose
Souris anti-GFAPeBioscience14-9892Marqueur d’astrocytes
Oligodendrocyte   ; marqueur  ; O4  ; anticorpsR& D SystemsMAB1326Marqueur d’oligodendrocytes
Paraformaldéhyde (PFA)Sigma-AldrichP6148Fixing  ; agent
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Basic LifeBL2651Solution de lavage
Poly-L-Lysine (PLL)SIGMAP4707Solution de revêtement
Verres de protection de précision épaisseur n° 1,5HMARIENFELD107242https://www.marienfeld-superior.com/precision-cover-glasses-thickness-no-1-5h-tol-5-m.html
Platine motorisée programmable X-Y-ZTanlian IncPersonnaliséAcheté auprès de http://www.tanlian.tw/ndex.files/motort.htm
Proportionnel&ndash ; intégral&ndash ; contrôleur dérivé (PID)Toho ElectronicsTTM-J4-R-ABRégulateur de température  ;
Tube PTFEProfessional Plastics Inc. Taiwan BrancheDiamètre extérieur 1/16 poucesTube en PTFE translucide blanc
Rabbit anti-Tuj1Abcamab18207Neuron marker
Pompe à seringueNew Era Systems IncNE-1000NE-1000 Pompe à seringue unique programmable
TFD4 détergentFRANKLABTFD4Nettoyant pour vitres
ThermocolleurKuan-MIN Tech Co.PersonnaliséAcheté chez
http://kmtco.com.tw/ Triton X-100Sigma-AldrichT8787Solution perméabilisée
Nettoyeur à ultrasonsLEO LEO-300SNettoyeur à ultrasons
Chambre à videDENG YNG INSTRUMENTS CO., Ltd.DOV-30Four de séchage sous vide
Bouchon étanche blancIDEX Santé & ScienceP-3161/4-28 à fond plat, https://www.idex-hs.com/store/fluidics/fluidic-connections/plug-teflonr-pfa-1-4-28-flat-bottom.html
de en PMMA de qualité optique de National

Références

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  3. Rajnicek, A. M., Robinson, K. R., McCaig, C. D. The direction of neurite growth in a weak DC electric field depends on the substratum: contributions of adhesivity and net surface charge. Developmental biology. 203 (2), 412-423 (1998).
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