Évaluation in vivo de l’autorisation mucociliaire chez la souris

Les cils sont des organites cellulaires à base de microtubules conservés dans toute l’histoire de l’évolution, des algues aux humains. Ils émanent des surfaces cellulaires et ont un certain nombre^{de fonctions 1}, allant de la reconnaissance des signaux sensoriels environnementaux locaux à la motilité, fonctions qui peuvent être retracées de l’homme aux premiers organismes eucaryotes unicellulaires^2,3. Les cils peuvent être non motiles et servir d’antenne spécialisée d’une cellule pour traiter les signaux environnementaux; ou motile et multiple, battant en ondes métaclronales synchronisées pour générer un flux fluide, comme dans la paroi des trompes de Fallope et des voies respiratoires supérieures et inférieures, à l’exception des bronchioles terminales menant aux alvéoles^1,2.

La vaste surface épithéliale des voies respiratoires est exposée à un barrage constant de contamination sous la forme d’une variété de polluants et d’agents pathogènes inhalés potentiellement dangereux, nécessitant une défense. Un mécanisme de défense clé est l’appareil mucociliaire de l’arbre trachéobronchial, où un flux continu de mucus sécrété est mécaniquement transporté hors des voies respiratoires par le battement des cils motiles multiples tapissant les surfaces apical des cellules épithéliales trachéo-bronchiques. Ceux-ci fonctionnent pour piéger les contaminants inhalés, et par leur battement continu et synchrone, les transportent cephalad^4,5.

Il a été démontré que les cils ont des rôles clés tels que dans le développement du modelage gauche-droite dans le développement d’embryons, où les cils motiles à la symétrie embryonnaire de rupture^{de nœud 6}. Les mutations dans les gènes liés aux cils ont été liées à des maladies telles que les maladies cardiaques congénitales (CHD) dues à la structure asymétrique du^{cœur 6}. Des études récentes ont rapporté une incidence élevée de dysfonctionnement ciliaire dans les voies respiratoires des patients atteints de CHD, ainsi qu’une prévalence accrue de complications respiratoires postopératoires et de symptômes chroniques des voies respiratoires dans les voies respiratoires^{supérieures et inférieures 7,8,9,10}. Il a été démontré que les patients atteints de CHD et de dysfonction ciliaire, avec ou sans hétérotaxie, avaient un risque accru de complications respiratoires et de résultats respiratoires négatifs^{postopératoirement 5,8,10}. Au-delà de leur rôle dans la signalisation et le développement, l’importance des cils des voies respiratoires a été démontrée par des ciliopathies, dont un excellent exemple est la dyskinésie ciliaire primaire (PCD). La PCD est un désordre congénital résultant d’un certain nombre de mutations affectant les cils respiratoires motiles, menant aux infections pulmonaires récurrentes, à la bronchiectasie, et potentiellement au besoin de transplantation pulmonaire^11. En outre, même si les cils sont normaux dans la fibrose kystique (CF), désordre congénital le plus commun dans la population caucasienne, MCC est altéré dû au mucus épais et visqueux résultant des mutations dans le gène de CFTR^12. Il existe plusieurs modèles muraux de PCD et de CF, ainsi qu’un nombre sans cesse croissant de modèles de CHD. En fin de compte, les cils sont des structures polyvalentes avec de nombreux rôles clés, et une méthode pour évaluer la fonction des cils respiratoires motiles in vivo peut être utile pour l’étude préclinique, et l’évaluation des effets des mutations ainsi que des médicaments sur le dégagement mucociliaire (MCC)¹³. La méthode serait également utile pour évaluer les effets de nouveaux médicaments, thérapie génique ou interventions sur mcc dans ces modèles de souris.

Il existe de nombreux modèles différents qui ont été utilisés pour évaluer mcc. Une méthode notable implique l’utilisation du colorant bleu méthylène qui a été inculqué dans la bronche, avec dégagement mesuré par mesure fibreoptique du mouvement de^{colorant 14.} Cette méthode est limitée par la capacité d’observer le mouvement du colorant, qui est plus routinier chez l’homme que dans les modèles précliniques de souris. Une autre méthode notable est l’imagerie par rayons X à contraste de phase synchrotron (PCXI), qui peut être utilisée pour suivre les particules individuelles dans les voies respiratoires. Cette méthode est relativement nouvelle et peu accessible¹⁵. Il existe de nombreuses méthodes ex vivo d’évaluation des voies respiratoires en excisant une trachée pour la vidéo-microscopie, mais ces modèles fournissent peu d’utilité chez les patients humains¹⁶. Les techniques de haute résolution pour l’imagerie cils telles que la tomographie par cohérence optique sont limitées de la même^{manière 17}.

Dans cet article, nous présentons une méthode reproductible pour mesurer mcc in vivo qui a été employé pour mesurer des dégagements de poumon dans une myriade de modèles animaux, aussi bien qu’étudier MCC dans la maladie pulmonaire obstructive chronique et évaluer les effets des drogues immunosuppressrices^18,19. Cette méthode suit le dégagement du colloïde radiopharmaceutique ^{de 99m}technétium-soufre^(99mTc-Sc), un radiotraceur de particules insolubles, après instillation dans les poumons. Le radionucléide peut ensuite être suivi à l’aide d’une tomographie calculée par émission de photons (SPECT)^18,20. Nous avons encore affiné cette technique pour mesurer mcc en utilisant la double modalité SPECT et la tomographie calculée (CT) imagerie avec co-localisation des comptes de radioisotope pour les poumons et de mesurer la diminution de ces comptes sur 6 heures. L’imagerie à double modalité, avec co-enregistrement des images CT et SPECT, permet une localisation précise du nombre de radiations dans notre région d’intérêt, les poumons. Bien que nous décrivions en détail la méthode de mesure du MCC chez la souris, le protocole peut être ajusté pour étudier le MCC chez les rats. Les collimateurs devraient être ajustés ainsi que la dose de rayonnement. À notre avis, les balayages de MCC de souris sont plus techniquement provocants en raison de la petite taille animale, mais plus utiles que des rats en raison du grand nombre de modèles établis de souris d’un certain nombre de désordres humains. De plus, en raison de leur coût et de leur coût d’entretien plus faibles dans les colonies animales, une plus grande taille d’échantillon est plus réalisable chez la souris.

Le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Pittsburgh a approuvé tous les protocoles animaux spécifiés dans cette publication avant d’entreprendre l’une ou l’autre de ces expériences sur les animaux.

REMARQUE : Ce protocole détaille comment effectuer des études in vivo de dégagement mucociliary utilisant l’imagerie de radionucléide avec un scanner SPECT/CT à double modalité. Les techniques démontrées sont l’étalonnage du système, l’anesthésie des souris, l’intubation trachéale des souris, l’instillation de l’isotope dans les poumons, l’imagerie à double modalité, la co-enregistrement de ces images et l’analyse.

1. Configuration du système SPECT/CT

1. Concevoir un flux de travail approprié et mettre en place avant d’exécuter des expériences à l’aide d’animaux vivants.
   1. Utilisez une acquisition SPECT composée de 60 projections d’une taille d’étape de 6^{o entre} les projections avec un rayon de rotation de 40 cm. L’acquisition de CT se compose de 220 projections avec un angle de 1,6^o entre les projections.
2. Assurez-vous que le système a les collimateurs MWB corrects pour les souris et l’imagerie SPECT en place. Si les collimateurs inappropriés sont installés, utilisez l’assistant collimateur pour installer les corrects.
3. Exécutez les étalonnages système nécessaires pour préparer le système à l’utilisation.
   REMARQUE : Les composants SPECT et CT du scanner ont besoin d’étalonnage. Calibrez les composants CT à l’aide d’un conditionnement source et d’un étalonnage Dark/Light (D/L) une fois par jour, d’un étalonnage Center Offset (COS) toutes les 2 semaines et évaluez le matériel à rayons X chaque mois. Les composants SPECT doivent être calibrés une fois par an.
   1. Pour évaluer le matériel à rayons X, cochez la boîte matérielle Evaluate X-ray pendant les étalonnages CT(Menu d’étalonnage CT supplémentaire).
   2. Pour effectuer le conditionnement source, cochez la boîte de conditionnement source Perform pendant les étalonnages CT(Menu d’étalonnage CT supplémentaire).
   3. Pour effectuer un étalonnage D/L, cochez la case D/L à côté du protocole d’acquisition CT utilisé lors d’expériences pendant les étalonnages CT. Décochez tous les autres protocoles(Menu d’étalonnage CT supplémentaire).
   4. Pour effectuer un étalonnage cos, remplacez le lit par l’outil anneau d’étalonnage, ajustez les paramètres de type lit pour correspondre aux paramètres de commande de mouvement et cochez la case COS à côté du protocole d’acquisition de CT utilisé lors d’expériences pendant les étalonnages CT. Décochez tous les autres protocoles(Menu d’étalonnage CT supplémentaire, Anneau d’étalonnage supplémentaire).

2. Intubation et instillation de souris

1. Pesez les souris à numériser. Si vous numérisez plusieurs souris, prenez soin de marquer les souris à des fins d’identification en utilisant des méthodes telles que le poinçonnage de l’oreille ou le marquage de la queue.
2. Anesthésier une souris à l’aide de 1,5 % d’isoflurane avec un débit de gaz de 2 L/min O₂ dans une chambre à gaz pendant ~5 minutes pour produire une anesthésie d’une profondeur suffisante, jusqu’à ce que la respiration ralentit à ~55-65 respirations par minute ¹⁶ (figure 1A).
3. Retirez la souris de la chambre et suspendez par les incisives avant sur un support d’intubation à une inclinaison de 45 o. Équiper le support d’intubation d’un cône avant pour s’assurer que la souris est anesthésiée pendant l’intubation (Figure 1B).
4. Connectez une extrémité d’un fil de fibre optique de 50 μm à une source lumineuse et enfilez une canule de calibre 20 sur elle à l’aide du fil pour servir de guide (Figure 1C).
5. Ouvrez la bouche de la souris et tirez la langue vers l’avant à l’aide de forceps contondants. Illuminez le fil du guide et utilisez-le pour visualiser les cordes vocales( Figure 1D).
6. Passez le fil de guidage à travers les cordes vocales de sorte que le fil est juste au-delà des cordes vocales et se reposant dans la trachée supérieure. Faites glisser la canule de 1 pouce vers l’avant le long du fil pour intuber la souris, en passant la canule assez profondément pour que le moyeu de celui-ci soit contre les incisives de l’animal (Figure 1E). Retirer le fil en laissant la canule en place.
7. Testez l’intubation en branchant brièvement la canule avec un doigt et en vérifiant les changements de respiration. L’arrêt de la respiration ou la respiration tendue lors du branchement et de la respiration accélérée à la libération sont des signes d’intubation trachéale appropriée. S’il n’y a aucun changement dans les modèles respiratoires en branchant la canule, ce dernier est probablement dans l’oesophage.
8. Préparer 0,2 mCi de colloïde de ^{99 m}de technétium-soufre^{(99 m}Tc-Sc) dans un volume de 10 μL, et pipette dans la canule. Laissez la souris l’inhaler spontanément dans les poumons pendant 1-2 min (Figure 1F). Retirez la canule avant de transférer la souris sur la palette du scanner.
   REMARQUE : Le radionucléide a été préparé et filtré par Cardinal Health.

3. Imagerie SPECT/CT

1. Transférer la souris sur une palette de 25 mm avec un cône avant et fixer avec du ruban adhésif, en prenant soin de ne pas tapisser la poitrine et l’abdomen trop étroitement pour éviter d’altérer la respiration. Prenez soin d’enlever les étiquettes d’oreille métalliques attachées à la souris.
2. Préparez un fantôme radioactif composé de 0,05 mCi en 200 μL et placez cette quantité dans un tube PCR de 0,2 mL. Placez le tube en tapant sur la palette sous le bas-ventre de la souris, en évitant le chevauchement avec les poumons.
   REMARQUE : Le fantôme est utilisé dans le but de co-enregistrer des images CT et SPECT, ainsi qu’un contrôle négatif pour l’autorisation.
3. Insérez la souris dans le système SPECT/CT, sélectionnez le workflow d’imagerie et exécutez Setup.
4. Configurez le positionnement des détecteurs sur la souris et exécutez le flux de travail d’imagerie.
5. Préparez une cage pour les souris qui ont reçu de la radioactivité après la procédure, avec un accès illimité à la nourriture et à l’eau, et un étiquetage clair à l’aide d’un autocollant de sécurité radiologique.
6. À la fin du flux de travail, retirez la souris de la palette d’imagerie et laissez-la récupérer dans la cage préparée pendant une durée de 6 heures entre les scans (fin de l’analyse 1 au début de l’analyse 2) avec accès ad libitum à la nourriture et à l’eau. 6 h a été choisi car il correspond à la période pendant laquelle le dégagement linéaire selon la fonction des cils a lieu avec très peu de dégagement alvéolaire.
7. Après 6 heures, anesthésier à nouveau la souris et numériser, avec le fantôme, en utilisant le même flux de travail pour mesurer la quantité d’isotope dégagée des voies respiratoires.
   REMARQUE: Il est essentiel de permettre à la souris de récupérer comme anesthésie ininterrompue avec isoflurane pendant 6 heures conduira à un effet cils-dépresseur significatif, résultant en des dégagements mucociliary près de zéro.

4. Analyse

1. Après l’imagerie, effectuez le post-traitement pour reconstruire des images complètes de pile 3D.
   1. Histogramme les images SPECT en utilisant les paramètres standard de l’usine ^{pour 99m}Tc, puis reconstruire à l’aide d’un algorithme MAP3D et la fonction de propagation de points (PSF) reconstruction.
      REMARQUE : La reconstruction a été effectuée à l’aide de 8 itérations et de 6 sous-ensembles. Une reconstruction efficace nécessite un rapport de sous-ensembles aux projections à 1:10 ou diviser uniformément en nombre de projections, de sorte que 6 sous-ensembles ont été utilisés en raison de l’acquisition à l’aide de 60 projections.
   2. Reconstruisez les images CT à l’aide de l’algorithme Feldkamp et d’un filtre Shepp-Logan.
      REMARQUE : La reconstruction a été effectuée à l’aide de 4 itérations.
2. Traiter les images CT et SPECT dans FIJI ImageJ^{21 à l’aide} de l’outil de reslice pour générer des images de vue coronale à partir des images axiale par défaut. Effectuez ensuite une projection de somme z-stack sur l’image SPECT pour ajouter les données de comptage de chaque tranche et générer une seule image pour faciliter l’analyse.
3. Resize et co-enregistrer les images CT et SPECT en utilisant le tube fantôme d’Eppendorf comme référence (Figure 2A,B). Suivez et utilisez des mesures de resize cohérentes sur tous les échantillons.
4. Binarize l’image CT en utilisant le seuil automatique, suivie par l’inversion de la pile, et l’exécution d’une projection de somme z-stack pour générer un contour des poumons pour analyse (Figure 2C).
5. Faites pivoter les images CT et SPECT et fusionnez l’image à l’aide des outils du canal. Calculez mcc en tirant un retour sur investissement autour du poumon droit et en mesurant( Figure 2D).
   REMARQUE: Cette mesure sera du nombre total dans le poumon droit pour les points de temps de 0 et 6 heures, avec les images de 6 heures corrigées pour la désintégration radioactive en utilisant la formule: N(t) = N₀e^−t. ^{99m (99m)} Tc-Sc a une constante de décomposition de 3,21e^{−5 par} seconde avec une demi-vie d’environ 6 heures. Ces valeurs peuvent ensuite être utilisées pour calculer une autorisation en pourcentage.
   REMARQUE : Le poumon droit est choisi pour le dessin et la mesure du retour sur investissement, car le dégagement mucociliaire transportera la radioisotope hors des poumons jusqu’au pharynx d’où elle sera avalée et se retrouvera dans l’estomac. Assez fréquemment, les comptes peuvent être vus dans l’estomac qui peuvent se chevaucher avec le poumon gauche et donc produire des comptes erronés. Cette confusion peut être évitée en mesurant les comptes dans le poumon droit seulement.

En utilisant ce protocole, nous avons anesthésié des souris dans une chambre isoflurane( Figure 1A). Après avoir atteint un niveau adéquat d’anesthésie, les souris ont été placées sur des supports verticaux (figure 1B) et les cordes vocales ont été visualisées à l’aide d’un fil guide lumineux (figure 1C-1D). Les souris ont été intubées et inculquées avec 0,2 mCi 99mTc-Sc en volumes de 10 μL à travers une canule et les souris autorisées à inhaler spontanément dans les poumons (Figure 1E-1F). Après l’acquisition et le traitement d’images, les images CT et SPECT ont été colocalisées (Figure 2A) en utilisant le tube fantôme comme point de repère (Figure 2B). Les masques des poumons ont été générés à partir de l’image CT (Figure 2C) et utilisés pour dessiner des IA autour du poumon droit pour analyse à 0 (Figure 2D) et 6 heures (Figure 2E-2F). Pour tester la reproductibilité du protocole, un total de 8 souris ont été numérisées deux fois à des jours différents avec des conditions expérimentales identiques, l’analyse utilisant un t-test apparié ne montrant aucune différence significative entre les balayages répétés (p-value=0,9904) (Figure 3A). Deux autres souris ont été numérisées trois fois à des jours différents avec des conditions expérimentales identiques, l’analyse utilisant anova uni-sens montrant l’appariement significatif entre les balayages répétés (p-valeur de 0.0041) (figure 3B). Au total, 8 souris ont été numérisées et deux images représentatives ont été affichées( figure 4).

Figure 1 : Intubation de souris et instillation d’isotopes. Images des étapes nécessaires pour intuber et inculquer l’isotope dans les voies respiratoires. R)La souris est anesthésiée dans une chambre. B) La souris anesthésiée est placée sur un support vertical, suspendu par les incisives avant. C) Un fil de fibre optique illuminé de 0,5 mm servant de fil de guidage est préparé en le faisant passer à travers une canule de 20 G. D)La bouche de la souris est ouverte à l’aide de forceps et éclairée à l’aide du fil de guidage éclairé pour visualiser les cordes vocales. E) La canule est poussée à travers les cordes vocales et guidewire est enlevé. F)L’isotope soluble est inculqué à la canule à l’aide d’une pipette et la souris est autorisée à inhaler spontanément l’isotope dans les poumons. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2 : Images SPECT/CT d’un scan MCC. A) Une image SPECT qui a été co-localisée avec une image CT. B) Une image CT avec un tube fantôme visible qui a été utilisé pour la co-localisation. C) Un masque des voies respiratoires dérivé en binarisant l’image CT et en effectuant une projection de somme z-stack. D) Le masque CT co-localisé avec l’image SPECT. Un retour sur investissement pour l’analyse a été dessiné autour du poumon droit. E) Un masque des voies respiratoires à 6 heures. F) Une image co-localisée CT et SPECT des voies respiratoires à 6 heures avec un retour sur investissement pour analyse. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Mesures de dégagement des mêmes souris sur plusieurs scans. A) Deux dégagements répétés individuels ont été mesurés pour 8 souris sans changement dans des conditions expérimentales. Un test t apparié a montré qu’il n’y avait pas de différence significative entre les balayages répétés avec une valeur p de 0,9904. B) Trois dégagements répétés individuels ont été mesurés pour deux souris sans changement dans des conditions expérimentales. Un ANOVA uni-sens a montré qu’il y avait correspondance significative entre les balayages répétés avec une valeur p de 0,0041. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Images co-localisées de SPECT/CT des voies respiratoires de 0 et 6 heures chez 2 souris avec des IDR dessinés à 0 et 6 heures décrivant le poumon droit. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure supplémentaire 1 : Une vidéo des cordes vocales éclairée par un fil de fibre optique avec l’effet de la respiration visualisée. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce chiffre.

Fichiers supplémentaires. S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ces fichiers.

Aucun n’était lié à ce travail.