De nombreuses caractéristiques de l’eusocialité des insectes reposent sur la communication au sein de la colonie et la division du travail. La manipulation génétique des gènes régulateurs clés dans les embryons de fourmis par micro-injection et mutagénèse médiée par CRISPR donne un aperçu de la nature du comportement altruiste chez les insectes eusociaux.
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Article de méthode
Injections d’embryons pour la mutagenèse médiée par CRISPR dans le saltateur Harpegnathos de fourmi
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les traits uniques des insectes eusociaux, tels que le comportement social et la division reproductive du travail, sont contrôlés par leur système génétique. Pour comprendre comment les gènes régulent les traits sociaux, nous avons développé des fourmis mutantes via l’administration du complexe CRISPR dans de jeunes embryons au cours de leur phase syncytiale. Ici, nous fournissons un protocole de mutagénèse médiée par CRISPR dans Harpegnathos saltator, une espèce de fourmi ponérine qui présente une plasticité phénotypique frappante. Les fourmis H. saltator sont facilement élevées en laboratoire. Les embryons sont collectés pour la micro-injection avec des protéines Cas9 et des petits ARN guides synthétisés in vitro (ARNsg) à l’aide d’aiguilles de quartz faites maison. Les embryons post-injection sont élevés à l’extérieur de la colonie. Après l’émergence de la première larve, tous les embryons et les larves sont transportés dans un nichoir avec quelques travailleurs infirmiers pour un développement ultérieur. Ce protocole convient pour induire la mutagénèse pour l’analyse de la physiologie spécifique à la caste et du comportement social chez les fourmis, mais peut également être appliqué à un spectre plus large d’hyménoptères et d’autres insectes.
Introduction
L’évolution de l’eusocialité chez les insectes, à savoir ceux des ordres Hymenoptera et Blattodea (anciennement Isoptera), a abouti à des traits comportementaux uniques et souvent sophistiqués qui se manifestent à la fois au niveau individuel et au niveau de la colonie. La division reproductive du travail, un trait caractérisant les groupes les plus avancés d’insectes sociaux, implique souvent des systèmes de castes composés de plusieurs groupes comportementaux et souvent morphologiquement distincts. Cette diversité comportementale et morphologique entre les castes est contrôlée non seulement par leur système génétique, mais aussi souvent par l’environnement 1,2,3,4, faisant des insectes eusociaux des sujets attrayants pour la recherche génétique et épigénétique.
La capacité de manipuler le système génétique des insectes eusociaux s’est avérée difficile, car de nombreuses espèces ne s’accouplent pas et ne se reproduisent pas en laboratoire. La plupart des insectes eusociaux ont également très peu d’individus reproducteurs dans une colonie, ce qui limite le nombre de descendants pouvant être produits et, par conséquent, limite la taille de l’échantillon pour la manipulation génétique5. De plus, de nombreux insectes eusociaux ont des temps de génération longs par rapport aux insectes couramment utilisés pour les études génétiques (tels que la drosophile), ce qui ajoute à la difficulté d’établir des lignées génétiques5. Certaines espèces eusociales, cependant, peuvent générer une grande proportion d’individus actifs sur le plan de la reproduction dans une colonie, ce qui atténue les défis et offre des possibilités d’établir des lignées mutantes ou transgéniques.
Dans le cas de l’espèce de fourmi ponérine, Harpegnathos saltator, toutes les travailleuses peuvent devenir actives sur le plan reproductif à la mort d’une reine ou à l’isolement social. Ces ouvrières sont appelées « gamégates » et peuvent être utilisées pour générer de nouvelles colonies6. De plus, il peut y avoir plus d’un gamergate présent dans une colonie, augmentant ainsi la production de progéniture 5,7,8. Jusqu’à présent, des lignées mutantes et/ou transgéniques ont été développées chez l’abeille européenne Apis mellifera, et chez les espèces de fourmis, H. saltator, Ooceraea biroi et Solenopsis invicta 9,10,11,12,13,14,15 . Les analyses génétiques chez les abeilles sociales et les fourmis ont ouvert la voie à une meilleure compréhension de l’eusocialité, offrant un éventail d’opportunités pour étudier les gènes et leurs impacts sur le comportement des insectes eusociaux et la physiologie spécifique à la caste.
Ici, nous fournissons un protocole de modification génétique via le système CRISPR / Cas9 dans H. saltator. Plus précisément, cette technique a été utilisée pour générer une mutation germinale chez l’orco, le gène codant pour le corécepteur obligatoire de tous les récepteurs odorants (OR)10. Les gènes OR ont été remarquablement développés chez les insectes eusociaux hyménoptères16, et l’orco joue un rôle essentiel dans l’olfaction des insectes; en son absence, les RO ne s’assemblent pas et ne fonctionnent pas normalement. Les mutations du gène orco perturbent donc la sensation olfactive, le développement neuronal et les comportements sociaux associés 9,10.
Dans ce protocole, les protéines Cas9 et les petits ARN guides (ARNg) sont introduits dans les embryons de fourmis par micro-injection dans le but d’induire la mutagénèse d’un gène cible. Ici, nous décrirons la procédure de micro-injection en détail ainsi que les instructions concernant les soins des colonies et des embryons injectés. Ces méthodes sont appropriées pour induire la mutagénèse dans une variété de gènes différents chez les fourmis H. saltator et peuvent être appliquées à un spectre plus large d’insectes hyménoptères.
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Protocole
1. Entretien régulier des colonies de salateurs d’Harpegnathos
- Maintenir des colonies sauvages de H. saltator dans des boîtes en plastique transparent dans une salle d’élevage de fourmis à 22-25 °C et une photopériode de 12 heures de lumière : 12 heures d’éclairage sombre (12L:12D).
- Utilisez de petites boîtes (9,5 x 9,5 cm2) pour élever des ouvrières individuelles ou de petites colonies. Utilisez des boîtes moyennes (19 x 13,5 cm 2) ou de grandes boîtes (27 x 19 cm2) pour élever de plus grandes colonies (figure 1).
- Pour créer des nichoirs, utilisez du plâtre pour faire des planchers pour les nichoirs. Pendant que le plâtre humide sèche dans le milieu et les grandes boîtes, pressez un bloc de mousse dans le plâtre à quelques centimètres de profondeur et à quelques centimètres de l’arrière de la boîte pour désigner une région de nidification inférieure. Une fois le plâtre séché, couvrez la région de nidification désignée avec un morceau de verre carré.
REMARQUE: Dans les petites boîtes, il n’est pas nécessaire de désigner une région de nidification inférieure. Si les fourmis négligent d’utiliser la région de nidification inférieure désignée, il peut être utile de recouvrir le verre d’un morceau carré de cellophane rouge. Cela donne l’impression d’un espace souterrain sombre ressemblant à des nids que H. saltator utilise dans la nature et peut les encourager à déplacer leur couvain dans la région désignée.
- Nourrissez les colonies avec des grillons vivants deux fois par semaine.
NOTE: Les colonies doivent être nourries suffisamment pour consommer tous les grillons avant leur prochaine alimentation. Nourrissez les fourmis isolées et les colonies de fourmis mutantes avec des grillons pré-piqués par les ouvrières d’une colonie régulière 2 à 3 fois par semaine. - Appliquez régulièrement de l’eau sur le sol de la boîte à nid en plâtre à l’aide d’un biberon.
REMARQUE: Le plâtre doit être suffisamment humide pour ne pas être poussiéreux au toucher, mais il doit être suffisamment sec pour que toute l’eau ajoutée soit absorbée par le plâtre. Il est important que les nids ne soient pas arrosés excessivement. En moyenne, les nichoirs auront besoin d’une petite quantité d’eau ajoutée une fois par semaine. - Chaque fois qu’il y a de l’alimentation, enlevez les ordures et les personnes mortes. Congeler tous les déchets et les fourmis mortes pendant la nuit à -30 °C avant de les jeter comme ordures ordinaires.
- Ajouter périodiquement une pincée de sciure de bois séchée aux colonies; Cela aide les larves lorsqu’elles subissent la nymphose et aide les ouvrières à garder le nichoir propre.
2. Préparation des aiguilles de micro-injection en verre de quartz
- Utilisez un extracteur de micropipettes pour tirer les aiguilles de micro-injection en verre.
- Sélectionnez le verre à tirer. Assurez-vous que le verre utilisé a été stocké dans un environnement propre et exempt de poussière.
NOTE: Ici, du verre de quartz filamenteux à paroi mince avec un diamètre extérieur de 1,0 mm, un diamètre intérieur de 0,5 mm et une longueur de 7,5 cm a été utilisé pour produire des aiguilles de micro-injection. En cas d’injection d’un embryon à corps mou, des aiguilles borosilicatées peuvent également être applicables, mais les aiguilles borosilicates ne peuvent pas pénétrer le chorion dur. - Définissez les paramètres de l’extracteur. Utiliser un procédé en deux étapes pour prélever des aiguilles de micro-injection pour les embryons de H. saltator : les paramètres de la première étape comprennent une chaleur de 575, un filament de 3, une vitesse de 35, un retard de 145 et une traction de 75; Les paramètres de la deuxième étape comprennent une chaleur de 425, un filament de 0, une vitesse de 15, un retard de 128 et une traction de 200. Après la deuxième étape, assurez-vous que l’aiguille résultante a une conicité de 2 mm et une pointe de 0,5 μm (figure 2).
REMARQUE : Cet ensemble de paramètres, ainsi que les paramètres pour d’autres types d’aiguilles, se trouvent dans le Manuel d’utilisation17. Les manuels pour les extracteurs de pipettes fournissent souvent des paramètres recommandés pour une variété de techniques. Certains essais et erreurs peuvent être nécessaires pour déterminer quels paramètres génèrent les meilleures aiguilles pour des besoins spécifiques. Une conicité courte est idéale pour les injections de H. saltator, car elle peut pénétrer dans le chorion dur des embryons de H. saltator. Si vous injectez un embryon mou, tel qu’un embryon qui a été déchorionné (par exemple, la drosophile), une conicité plus longue autour de 10 mm peut donner de meilleurs résultats. Les manuels d’utilisation des extracteurs de pipettes fournissent généralement des paramètres spécifiques pour les aiguilles de traction adaptées à différents besoins. Il est important de porter des gants lors de la manipulation de filaments de verre et de la traction d’aiguilles. Les huiles à mains nues peuvent être transférées dans le verre si les gants ne sont pas portés. - Une fois les paramètres définis, utilisez un extracteur de micropipette pour tirer les aiguilles pour la micro-injection. Assurez-vous que les aiguilles sont conservées dans un environnement propre et exempt de poussière jusqu’à ce qu’elles soient utilisées.
REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser des aiguilles de micro-injection fraîchement tirées. Si des aiguilles prétirées sont utilisées, elles doivent être rangées correctement dans une boîte pour éviter d’endommager les extrémités des aiguilles et de les contaminer potentiellement. Les aiguilles qui ont subi un stockage à long terme ne sont pas recommandées pour les injections d’embryons.
3. Préparation du micro-injecteur
- Utilisez un micro-injecteur pour injecter le matériel souhaité dans les embryons de fourmis.
- Préparer le mélange de micro-injection de protéines Cas9 et de petits ARN guides synthétisés in vitro (ARNs)10. Gardez le mélange sur la glace jusqu’à ce qu’il soit temps de charger une aiguille de micro-injection. Lorsqu’il n’est pas utilisé, conserver le mélange pour microinjection à -80 °C.
NOTE: Les concentrations varient selon les espèces. Une concentration élevée peut entraîner une mortalité élevée, tandis qu’une faible concentration peut réduire l’efficacité. Nous utilisons 0,2 μg/μL de protéines Cas9 et 0,2 μg/μL d’ARNg pour l’injection d’embryons H. saltator. La conception de nos sgRNAs a suivi un protocole préalablement établi18. Les séquences de gènes ont été obtenues à partir de bases de données ADN. La séquence génomique de H. saltator a également été précédemment rapportée19,20. - Ajuster les paramètres d’injection pour les embryons de H. saltator : une pression d’injection de 140 hectopascal (hPa), une pression constante de 70 hPa et un temps de 0,4 seconde. Ajustez la pression constante de manière à ce que le matériau ne circule que dans une direction. Ajustez la pression et le temps d’injection uniquement si aucune matière ne s’écoule de l’aiguille dans l’embryon.
REMARQUE: Si vous injectez un autre type d’embryon, le paramètre principal qui peut changer est la pression constante, qui est responsable de s’assurer que le liquide de l’embryon ne retourne pas dans l’aiguille. Le volume n’est pas contrôlé dans ce protocole. Le réglage des paramètres du micro-injecteur est suffisant pour obtenir des injections cohérentes. - Charger une aiguille de microinjection avec 2 μL du mélange à l’aide d’embouts de pipette de microchargeur. Faites-le lentement pour vous assurer qu’aucune bulle ne se forme dans le mélange.
REMARQUE: Si des bulles se forment, il peut être difficile de maintenir des micro-injections cohérentes. - Cassez juste le bout de l’aiguille en brisant le long du bord du ruban de manière à maintenir une conicité étroite. Assurez-vous que l’aiguille est cassée juste assez pour que la pointe soit ouverte, mais pas au point que la conicité soit cassée.
REMARQUE: Il est important de noter que si l’ouverture de l’aiguille est trop large après la rupture, l’utilisateur verra le liquide s’écouler de l’aiguille lorsqu’il est monté sur le micro-injecteur sous pression avant l’application de la pression d’injection. Certains protocoles de micro-injection conseillent de casser les aiguilles en coupant la pointe avec des ciseaux. Cette méthode n’est pas conseillée, car les ciseaux peuvent faire éclater la pointe de l’aiguille. Injecter des embryons avec une aiguille brisée sera très dommageable. - Montez l’aiguille sur le micromanipulateur
4. Injection d’embryons
- Sélectionner les embryons pour la microinjection à partir du stade syncytial: le temps au cours du développement où les noyaux se divisent sans cytocinèse.
NOTE: C’est le moment idéal pendant le développement pour l’édition du génome par micro-injection, comme découvert précédemment dans Drosophila21. Les embryons H. saltator passent le stade syncytial et atteignent la cellularisation environ 36 h après le dépôt de l’ovule10. Une plus grande efficacité est obtenue si des embryons plus jeunes sont utilisés pour les injections. - Tapisser les embryons sur un morceau de ruban adhésif double face collé à une lame de microscope en verre. Assurez-vous que les embryons sont bien fixés à la bande pour empêcher tout mouvement pendant l’injection. Posez les embryons dans une orientation verticale, de sorte que le côté latéral de l’embryon soit au bord de la bande (Figure 3). Placez la lame et les embryons doublés sur la scène du microscope à un poste de travail de micro-injection désigné.
REMARQUE: Il est recommandé que les embryons soient disposés de manière à ce que les injections successives puissent être effectuées en déplaçant la lame sur la scène au lieu d’ajuster la position de l’aiguille à chaque injection. Cela permet d’effectuer des injections successives plus efficacement. - Aligner l’aiguille avec le premier embryon à injecter à l’aide du micromanipulateur (Figure 4a).
- Percer latéralement l’aiguille dans le premier embryon le long de son axe dorsal/ventral au microscope.
- Injectez le mélange de micro-injection. Recherchez un léger mouvement de l’embryon, indiquant une augmentation de la pression interne due au liquide injecté. De plus, surveillez la formation d’une petite gouttelette contenant une trace visible de tissu et/ou de lipides sur la membrane externe de l’embryon (Figure 4b).
REMARQUE : La présence de traces de tissu et/ou de lipides dans la gouttelette indique que l’aiguille a perforé avec succès la membrane du chorion et de la vitelline de l’embryon. Si aucune trace de ces matériaux n’est présente, l’injection n’a pas été effectuée avec succès et doit être répétée. Après quelques secondes, la gouttelette sera réabsorbée par l’embryon et ne sera plus visible. - Retirez doucement l’aiguille de l’embryon immédiatement et passez à la suivante en ajustant la position de la lame de microscope. Répétez jusqu’à ce que tous les embryons aient été injectés.
- Une fois que tous les embryons de la lame ont été injectés avec succès, transférez la lame dans une boîte humide pendant 1 heure pour donner aux embryons le temps de récupérer du processus d’injection avant d’être retirés de la lame.
5. Élevage d’embryons injectés
- Après 1 heure d’incubation dans une boîte humide, retirez délicatement les embryons injectés de la bande à l’aide de pinces poids plume et transférez-les dans un tube rempli d’une petite quantité d’éthanol à 70%. Retourner le tube plusieurs fois pour transférer les embryons au fond du tube. Répétez le lavage à l’éthanol une fois, suivi de trois lavages à l’eau autoclavée.
- À l’aide d’un petit pinceau souple, transférer tous les embryons injectés dans des plaques de gélose à 1% contenant 2% d’antibiotiques-antimycotiques. Appliquer l’antibiotique-antimycotique après que les plaques de gélose versées ont refroidi en étalant sur la surface de la plaque à l’aide d’un épandeur de cellules. Scellez la plaque de gélose avec un parafilm pour empêcher la dessiccation de la gélose.
REMARQUE : N’essayez pas de retourner les embryons injectés dans une colonie après les injections, car les ouvrières peuvent détruire la plupart des embryons injectés. La survie est donc optimisée en permettant aux embryons de se développer sur des plaques de gélose en dehors d’un environnement de colonie normal. - Incuber les plaques de gélose à 25 °C pendant environ 4 semaines. Vérifiez régulièrement l’éclosion.
- Une fois que le premier embryon a éclos en larve, remettez tous les embryons et les larves dans un nichoir avec quelques jeunes infirmières pour s’occuper des nouveau-nés. Nourrissez-vous à l’aide de grillons piqués par une plus grande colonie de type sauvage, enlevez les déchets et ajoutez de l’eau en suivant le même protocole que celui décrit à la section 1.
NOTE: Les petites boîtes (9,5 x 9,5 cm2) sont idéales pour de telles colonies. H. saltator se reproduit bien en captivité. Par conséquent, les embryons mutants peuvent être élevés jusqu’à l’âge adulte. L’isolement du ou des adultes mutants induit une transition vers le stade de gamergate reproductive. Des croisements contrôlés sont utilisés pour établir des colonies mutantes avec des individus hétérozygotes ou homozygotes (Figure 5).
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Résultats
En utilisant le protocole fourni ici, l’édition du génome dans les embryons salateurs d’Harpegnathos a été réalisée avec succès. Ces résultats ont été validés par réaction en chaîne de la polymérase et clonage pGEM de l’ADN extrait d’embryons injectés, suivi d’un séquençage de l’ADN. L’efficacité de la mutagénèse somatique à l’aide de ce protocole a atteint environ 40%. Les mâles mutants F1 ont été accouplés à des femelles de type sauvage pour produire des femelles F2 hétérozygot...
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Discussion
L’évolution de l’eusocialité chez les insectes, y compris les fourmis, les abeilles, les guêpes et les termites, a entraîné l’apparition de nouveaux traits comportementaux et morphologiques, dont beaucoup sont influencés par une combinaison de facteurs environnementaux et génétiques 1,2,3,4. Malheureusement, l’attrait et l’utilité des insectes eusociaux en tant que modèles de recherche dans le ...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs remercient les laboratoires de Danny Reinberg et Claude Desplan à l’Université de New York et le laboratoire de Jürgen Liebig à l’Arizona State University pour leur soutien sur la génétique des fourmis. Hua Yan reconnaît le soutien de la National Science Foundation I / UCRC, du Center for Arthropod Management Technologies sous le numéro de subvention IIP-1821914 et des partenaires de l’industrie. Maya Saar a été soutenue par le Fonds binational de recherche et de développement agricoles États-Unis - Israël, Vaadia-BARD Postdoctoral Fellowship No. FI-595-19.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Antibiotique-Antimycosique (100X) | ThermoFisher | 15240-062 | |
| Protéine Cas9 avec NLS, haute concentration | PNA Bio | CP02 | |
| Rouleau de cellophane 20 pouces X 5 pieds | Hypogloss Produits | B00254CNJA | Le produit a de nombreuses variations de couleur. Achetez-le en rouge pour l’utiliser dans la fabrication de nids de fourmis. |
| Microscope droit Eclipse Ci-S ; | Nikon | Ci-S | |
| Pince poids plume, pointe étroite | BioQuip | 4748 | |
| FemtoJet ll micro-injecteur | Eppendorf | 920010504 | Ce produit n’est plus vendu ni pris en charge par Eppendorf. Un micro-injecteur comparable peut être utilisé à la place. |
| Pointes de pipette à microchargeur | Eppendorf | 930001007 | |
| base de données NCBI | National Center for Biotechnology Information | Gene ID : 105183395 ; | |
| P-2000 Extracteur de micropipette | Sutter Instruments | P-2000/G | |
| Boîtes en plastique (19 X 13,5 cm2) | Pioneer Plastics | 079C ; | |
| Boîtes en plastique (27 X 19 cm2) | Pioneer Plastics | 195C | |
| Boîtes en plastique (9,5 X 9,5 cm2) | Pioneer Plastics | 028C ; | |
| Verre de quartz sans filament | Sutter Instruments | Q100-50-7.5 | |
| Ciseaux Vannas, 8,5 cm | World Precision Instruments | 500086 | |
| Winsor & Newton Cotman Aquarelle Série 111 Pinceau Synthétique à Manche Court - Rond #000 | Winsor et Newton | 5301030 |
Références
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Réimpressions et autorisations
