Article de méthode

Modification génétique basée sur l’électroporation de cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant

DOI :

10.3791/61987

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4 février 2021

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1Department of Ophthalmology, University Hospital RWTH Aachen, 2Experimental Ophthalmology, University of Geneva, 3Department of Ophthalmology, University Hospitals of Geneva, 4Université de Paris, CNRS, INSERM, UTCBS, Unité des technologies Chimiques et Biologiques pour la Santé, 5Chimie ParisTech, PSL Research University, 6Max Delbrück Center for Molecular Medicine in the Helmholtz Association, 7Division of Medical Biotechnology, Paul-Ehrlich-Institute

Dans cet article

Résumé

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Nous avons développé un protocole pour transfecter les cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires par électroporation avec le gène codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) à l’aide du système de transposon de la Belle au bois dormant (SB). La réussite de la transfection a été démontrée par la réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR), l’immunoblot et le dosage immuno-enzymatique (ELISA).

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Notre société de plus en plus vieillissante entraîne une incidence croissante de maladies neurodégénératives. Jusqu’à présent, les mécanismes pathologiques sont mal compris, ce qui empêche la mise en place de traitements définis. Les thérapies géniques additives cellulaires pour l’expression accrue d’un facteur de protection sont considérées comme une option prometteuse pour traiter les maladies neurodégénératives, telles que la dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA). Nous avons développé une méthode pour l’expression stable du gène codant pour le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF), qui est caractérisé comme une protéine neuroprotectrice et anti-angiogénique dans le système nerveux, dans le génome des cellules épithéliales pigmentaires humaines primaires (PE) en utilisant le système de transposon de la Belle au bois dormant (SB). Les cellules PE primaires ont été isolées des yeux de donneurs humains et maintenues en culture. Après avoir atteint la confluence, 1 x 104 cellules ont été suspendues dans 11 μL de tampon de remise en suspension et combinées avec 2 μL d’une solution purifiée contenant 30 ng de plasmide transposase SB hyperactif (SB100X) et 470 ng de plasmide de transposon PEDF . La modification génétique a été réalisée avec un système d’électroporation capillaire utilisant les paramètres suivants: deux impulsions d’une tension de 1 100 V et d’une largeur de 20 ms. Les cellules transfectées ont été transférées dans des plaques de culture contenant un milieu complété par du sérum fœtal bovin; Des antibiotiques et des antimycotiques ont été ajoutés avec le premier échange de milieu. Une transfection réussie a été démontrée dans des expériences réalisées indépendamment. La réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) a montré l’expression accrue du transgène PEDF . La sécrétion de PEDF était significativement élevée et restait stable, telle qu’évaluée par immunoblotting, et quantifiée par dosage immuno-enzymatique (ELISA). Le transfert médié par SB100X a permis une intégration stable du gène PEDF dans le génome des cellules PE et a assuré la sécrétion continue de PEDF , ce qui est essentiel pour le développement d’une thérapie génique à base de cellules pour traiter la DMLA ou d’autres maladies dégénératives de la rétine. De plus, l’analyse du profil d’intégration du transposon PEDF dans les cellules PE humaines a indiqué une distribution génomique presque aléatoire.

Introduction

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L’âge avancé est décrit comme le principal risque de maladies neurodégénératives. La dégénérescence maculaire liée à l’âge (DMLA), une maladie polygénique entraînant une perte de vision sévère chez les patients âgés de plus de 60 ans, fait partie des quatre causes les plus fréquentes de cécité et de déficience visuelle1 et devrait atteindre 288 millions de personnes en 20402. Les dysfonctionnements de l’épithélium pigmentaire rétinien (EPR), une couche unique de cellules étroitement emballées situées entre le choriocapillaris et les photorécepteurs rétiniens, contribuent à la pathogenèse de la DMLA. L’EPR remplit de multiples tâches essentielles à une fonction rétinienne normale3 et sécrète une variété de facteurs de croissance et de facteurs essentiels pour maintenir l’intégrité structurelle de la rétine et de la choriocapillaris, soutenant ainsi la survie des photorécepteurs et fournissant une base pour la circulation et l’apport de nutriments.

Dans les yeux sains, le facteur dérivé de l’épithélium pigmentaire (PEDF) est responsable de l’équilibre des effets du facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) et protège les neurones contre l’apoptose, empêche la prolifération des cellules endothéliales et stabilise l’endothélium capillaire. Un rapport VEGF-/ PEDF décalé est lié à la néovascularisation oculaire, qui a été observée dans les modèles animaux4,5 ainsi que dans des échantillons de patients atteints de néovascularisation choroïdienne (CNV) due à la DMLA et à la rétinopathie diabétique proliférante 6,7,8,9,10 . La concentration accrue de VEGF est la cible du traitement standard actuel. Les produits pharmaceutiques anti-VEGF bevacizumab, ranibizumab, aflibercept et, plus récemment, brolucizumab améliorent l’acuité visuelle chez environ un tiers des patients atteints de CNV ou plutôt stabilisent la vision dans 90% des cas11,12,13. Cependant, les injections intravitréennes fréquentes, souvent mensuelles, comportent un risque d’événements indésirables14, nuisent à l’observance du patient et représentent un fardeau économique important pour les systèmes de santé15. De plus, un certain pourcentage de patients (2%-20%) ne répondent pas ou ne réagissent que mal au traitement anti-VEGF16,17,18,19. Ces concomitants négatifs nécessitent le développement de traitements alternatifs, par exemple, des implants intraoculaires, des approches thérapeutiques cellulaires et/ou géniques.

La thérapie génique a évolué en tant que traitement prometteur pour les maladies héréditaires et non héréditaires et vise à restaurer les séquences de gènes non fonctionnelles ou à supprimer celles qui ont mal fonctionné. Pour les maladies polygéniques, où l’identification et le remplacement des facteurs de causalité sont difficilement possibles, les stratégies visent l’administration continue d’un facteur de protection. Dans le cas de la DMLA, diverses thérapies additives ont été développées, telles que l’expression stable de l’endostatine et de l’angiostatine20, l’antagoniste du VEGF soluble de la tyrosine kinase-1 (sFLT-1)21,22, le groupe de protéines régulatrices du complément de différenciation 59 (CD59)23 ou PEDF 24,25 . L’œil, et en particulier la rétine, est une excellente cible pour un médicament à base de gènes en raison de sa structure fermée, de sa bonne accessibilité, de sa petite taille et de son privilège immunitaire, permettant ainsi une administration localisée de faibles doses thérapeutiques et rendant les greffes moins sensibles au rejet. De plus, l’œil permet une surveillance non invasive et la rétine peut être examinée par différentes techniques d’imagerie.

Les vecteurs viraux sont, en raison de leur grande efficacité de transduction, le principal véhicule pour délivrer des gènes thérapeutiques dans les cellules cibles. Cependant, selon le vecteur viral utilisé, différents effets indésirables ont été décrits, tels que les réponses immunitaires et inflammatoires26, les effets mutagènes et oncogènes 27,28, ou la dissémination dans d’autres tissus29. Les limitations pratiques comprennent une taille d’emballage restreinte30 ainsi que des difficultés et des coûts associés à la production de lots de qualité clinique31,32. Ces inconvénients ont favorisé le développement de vecteurs plasmidiques non viraux qui sont transférés via des lipo / polyplexes, des ultrasons ou des électroporations. Cependant, l’intégration génomique du transgène dans le génome de l’hôte n’est généralement pas favorisée avec les vecteurs plasmidiques, ce qui entraîne une expression transitoire.

Les transposons sont des fragments d’ADN naturels qui changent de position dans le génome, une caractéristique qui a été adoptée pour la thérapie génique. Grâce à un mécanisme d’intégration actif, les systèmes vectoriels basés sur les transposons permettent une expression continue et constante du transgène inséré. Le transposon de la Belle au bois dormant (SB), reconstitué à partir d’un ancien transposon de type Tc1/marin trouvé chez les poissons33 et encore amélioré par l’évolution moléculaire aboutissant à la variante hyperactive SB100X34, a permis une transposition efficace dans diverses cellules primaires et a été utilisé pour la correction phénotypique dans différents modèles de maladie35. À l’heure actuelle, 13 essais cliniques ont été lancés à l’aide du système de transposons SB . Le système de transposons SB100X se compose de deux composants: le transposon, qui comprend le gène d’intérêt flanqué de répétitions inversées terminales (TIR), et la transposase, qui mobilise le transposon. Après l’administration de l’ADN plasmidique aux cellules, la transposase lie les TIR et catalyse l’excision et l’intégration du transposon dans le génome de la cellule.

Nous avons développé une thérapie additive non virale à base de cellules pour le traitement de la DMLA néovasculaire. L’approche comprend l’insertion par électroporation du gène PEDF dans les cellules épithéliales pigmentaires primaires (PE) au moyen du système de transposons SB100X 36,37,38. L’information génétique de la transposase et de la PEDF est fournie sur des plasmides séparés, permettant ainsi l’ajustement du rapport transposon SB100X / PEDF idéal. L’électroporation est réalisée à l’aide d’un système de transfection capillaire à pipette qui se caractérise par une taille d’espace maximisée entre les électrodes tout en minimisant leur surface. Il a été démontré que le dispositif atteignait d’excellents taux de transfection dans un large éventail de cellules de mammifères 39,40,41. La petite surface de l’électrode fournit un champ électrique uniforme et réduit les différents effets secondaires de l’électrolyse42.

La fonctionnalité anti-angiogénique de la PEDF sécrétée par les cellules épithéliales pigmentaires transfectées a été démontrée dans diverses expériences in vitro analysant la germination, la migration et l’apoptose des cellules endothéliales de la veine ombilicale humaine43. De plus, la transplantation de cellules transfectées par PEDF dans un modèle de lapin de néovascularisation cornéenne44 ainsi qu’un modèle de rat de CNV43,45,46 ont montré un déclin de la néovascularisation.

Ici, nous décrivons un protocole détaillé pour l’insertion stable du gène PEDF dans les cellules RPE humaines primaires via le système de transposon SB100X en utilisant un système de transfection capillaire. Les cellules transfectées ont été conservées en culture pendant 21 jours, puis analysées en termes d’expression du gène PEDF par réaction en chaîne de la polymérase quantitative (qPCR) et en termes de sécrétion de protéines PEDF par immunoblot et dosage immuno-enzymatique (ELISA, Figure 1).

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Protocole

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Les yeux de donneurs humains ont été obtenus auprès de la Banque de cornée d’Aix-la-Chapelle du Département d’ophtalmologie (Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle) après avoir obtenu un consentement éclairé conformément aux protocoles de la Déclaration d’Helsinki. Les procédures de prélèvement et d’utilisation des échantillons humains ont été approuvées par le comité d’éthique de l’établissement.

1. Isolement des cellules EPR humaines primaires

  1. Disposez des vêtements et des gants de protection stériles. Placer un champ stérile sous un flux laminaire.
  2. Placez les instruments de préparation stérile et tout autre équipement stérile nécessaire sous le flux laminaire.
  3. Enregistrez la réception des globes oculaires, le début de la préparation ainsi que les anomalies possibles. Inscrivez l’âge, le sexe, la cause du décès du donneur et la période entre le moment du décès et le prélèvement oculaire.
  4. Placez le globe oculaire dans une compresse de gaze stérile et tenez-le dans une main.
  5. Séparer le segment antérieur du segment postérieur par une coupe circonférentielle d’environ 3,5 mm en arrière du limbe à l’aide d’un scalpel et d’un ciseau extra-fin pour les yeux pointus.
  6. Après avoir incliné le segment postérieur vers le bas, retirez délicatement le vitré et la rétine à l’aide d’une pince colibri.
  7. Réarrangez discrètement le complexe RPE/choroidea effondré à l’aide d’une pince à iris droite et maintenez-le ensuite en position avec une pince à iris incurvée.
  8. Remplissez la coupelle postérieure avec 1 mL de mélange nutritionnel Modified Eagle’s Medium/Ham’s F-12 (DMEM/F12) de Dulbecco, complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS), 80 U/mL de pénicilline et 80 μg/mL de streptomycine (Pen/Strep) et 2,5 μg/mL d’amphotéricine B (AmphoB).
    REMARQUE: Contrairement à l’isolement des cellules RPE primaires des yeux de porc ou de bovin36,37, la coupelle oculaire postérieure n’a pas besoin d’être remplie et incubée avec de la trypsine.
  9. Récoltez les cellules EPR en brossant doucement l’épithélium pigmentaire rétinien du nerf optique vers le limbe avec une pipette Pasteur en verre incurvé poli au feu, tout en fixant le complexe EPR / choroidea au limbe à l’aide d’une pince colibri. Transférer la suspension cellulaire dans une boîte de Pétri.
  10. Répétez les étapes 1.8 et 1.9 et collectez toutes les cellules de la boîte de Pétri. Remettez soigneusement en suspension la cellule en la pipetant de haut en bas à l’aide d’une pipette à canal unique (100-1 000 μL).
  11. Ensemencer la suspension cellulaire EPR de chaque globe oculaire dans trois puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits et les remplir jusqu’à 1 mL de DMEM/F12 complété par FBS, Pen/Strep et AmphoB.
  12. Maintenir les cultures cellulaires EPR à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 95 % d’air et de 5 % de CO2 jusqu’à ce que la confluence soit atteinte. Changez le milieu de culture cellulaire deux fois par semaine.

2. Électroporation des cellules EPR humaines primaires

  1. Préparation du mélange plasmide transposase/transposon SB100X
    1. Purifier la transposase SB100X et l’ADN plasmidique du transposon PEDF à l’aide des kits de purification plasmidique habituels, qui sont identifiés comme étant adaptés à une utilisation dans des applications telles que la transfection, conformément au protocole du fabricant.
    2. Quantifier le contenu de l’ADN plasmidique à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume et l’ajuster à une concentration de 250 ng/μL avec 10 mM de Tris-HCl (pH 8,5).
    3. Mélanger une portion d’ADN plasmidique transposase SB100X de 250 ng/μL (p. ex. 2,5 μL) avec 16 portions d’ADN plasmidique de transposon PEDF de 250 ng/μL (p. ex. 40 μL). Le mélange plasmidique résiduel peut être conservé à -20 °C.
      REMARQUE : Les cycles répétés de congélation et de décongélation répétés du mélange plasmidique doivent être évités.
    4. Placer 2 μL du mélange plasmidique transposase SB100X/transposon PEDF, contenant 29,4 ng de plasmide transposase SB100X et 470,6 ng de plasmide transposonique PEDF, dans un tube microcentrifuge stérile de 1,5 mL. Garder sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit mélangée avec des cellules.
  2. Mise en place du système de transfection capillaire
    REMARQUE: L’électroporation des cellules EPR humaines primaires a été réalisée via un système de transfection capillaire utilisant le kit de 10 μL selon le protocole du fabricant. Le système comprend le dispositif de transfection, la pipette de transfection et la station de pipette. Le kit contient des embouts de transfection de 10 μL, des tubes tampons, un tampon électrolytique E (tampon E) et un tampon de remise en suspension R (tampon R).
    1. Connectez la station de pipette au dispositif de transfection.
    2. Remplissez un tube tampon avec 3 ml de tampon E et insérez-le dans la station de pipette jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre.
      REMARQUE: Assurez-vous que l’électrode latérale du tube tampon est connectée au piston à bille latérale de la station de pipette.
    3. Pour l’électroporation des cellules EPR humaines primaires, réglez les conditions d’impulsion suivantes sur le dispositif de transfection : 1 100 V (tension d’impulsion), 20 ms (largeur d’impulsion), deux impulsions (nombre d’impulsions).
  3. Préparation des cellules EPR humaines primaires cultivées
    1. Documenter la forme et la morphologie des cultures cellulaires primaires de l’EPR par microscopie à contraste de phase. Prenez des micrographies à faible grossissement pour démontrer la croissance des cellules EPR en une monocouche confluente et intégrée, ainsi que des micrographies à fort grossissement pour souligner la morphologie pavée typique des cellules EPR.
    2. Aspirer le milieu de culture cellulaire et laver les cellules deux fois avec une solution saline tamponnée de phosphate de 1 mL (PBS, pH 7,4).
    3. Trypsiniser les cellules humaines primaires d’EPR avec 0,5 mL 0,05% trypsine-EDTA à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 95% d’air et 5% de CO2 pendant 7-15 min (maximum). Vérifiez le détachement de la cellule au microscope.
    4. Arrêtez la trypsinisation avec 1 mL de DMEM/F12 complété par FBS. Prenez une partie aliquote de 20 μL pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger la suspension cellulaire RPE à 106 x g pendant 10 min.
    5. Mélanger la partie aliquote de 20 μL avec la solution de bleu de trypan de 20 μL. Pipeter 10 μL dans chaque moitié de l’hémocytomètre et compter les cellules au microscope à contraste de phase.
    6. Après centrifugation, remettre en suspension la pastille de cellule RPE dans 1 mL de PBS.
    7. Prendre 10 000 à 100 000 cellules EPR par réaction de transfection et les centrifuger à 106 x g pendant 10 min.
      NOTE: Outre les réactions de transfection avec application de champ électrique et ajout d’ADN plasmidique, chaque approche comprend également deux cultures témoins différentes: (1) sans application de champ électrique et sans ADN plasmidique; (2) avec application de champ électrique, mais sans ADN plasmidique.
    8. Resuspendre la pastille de cellule dans 11 μL de tampon R et la combiner avec 2 μL du mélange plasmidique transposase/transposon PEDF SB100X (voir étape 2.1.4).
      REMARQUE: Après remise en suspension dans le tampon R, les cellules doivent être traitées dans les 15 minutes pour éviter une réduction de la viabilité de la cellule et de l’efficacité de la transfection.
    9. Insérez la tête de la pipette de transfection dans l’embout de transfection de 10 μL jusqu’à ce que la pince capte complètement la tige de montage du piston. Aspirer la solution cellulaire/plasmidique dans l’embout de transfection.
      REMARQUE: Évitez la génération de bulles d’air et leur aspiration dans l’embout de transfection.
    10. Fournir 1 mL de DMEM/F12 complété par FBS, mais sans stylo/streptocoque et sans amphoB, dans le nombre requis de puits d’une plaque de culture cellulaire de 24 puits.
  4. Procédé d’électroporation
    1. Insérez la pipette de transfection dans le tube tampon placé dans la station de pipette (voir étape 2.2.2) jusqu’à ce qu’un clic se fasse entendre.
      REMARQUE : Assurez-vous que la tête métallique de la pipette de transfection est connectée au piston à billes à l’intérieur de la station de pipette et au tube tampon.
    2. Appuyez sur Démarrer sur l’écran tactile du dispositif de transfection. Avant l’application de l’impulsion électrique, l’appareil vérifie automatiquement si le tube tampon et la pipette de transfection sont correctement insérés. Après la livraison des impulsions électriques, Complete s’affiche sur l’écran tactile.
    3. Retirer délicatement la pipette de transfection de la station de pipette et libérer immédiatement les cellules électroporées de l’extrémité de transfection de 10 μL en pipetant la solution cellulaire/plasmidique dans les puits préparés de la plaque de culture cellulaire (voir étape 2.3.10).
    4. Maintenir les cultures cellulaires EPR transfectées à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 95 % d’air et de 5 % de CO2. Ajouter Pen/Strep et AmphoB avec le premier échange de milieu 3 jours après l’électroporation.

3. Analyses de cellules EPR humaines primaires transfectées

  1. Préparation des échantillons
    1. Après un temps de culture de 3 semaines, incuber finalement les cultures cellulaires EPR dans un volume défini de 1,0 mL DMEM/F12 complété par FBS, Pen/Strep et AmphoB pendant une durée définie de 24 h.
    2. Prélever les surnageants de culture cellulaire et les conserver à -20 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités à un moment proche ou à -80 °C pour les échantillons thermiquement instables et le stockage à long terme.
    3. Trypsiniser des cultures cellulaires EPR transfectées avec 0,5 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 95 % d’air et de 5 % de CO2 pendant 10 min.
    4. Arrêtez la trypsinisation avec 1 mL de DMEM/F12 complété par FBS. Prélever de petites aliquotes pour le comptage cellulaire à l’aide d’un hémocytomètre (voir étape 2.3.5). Centrifuger les suspensions de cellules RPE à 106 x g pendant 10 min.
    5. Conserver les pastilles de cellules EPR à -80 °C jusqu’à la poursuite du traitement.
  2. Évaluation de la sécrétion de FDPE par transfert Western
    REMARQUE : Pour une évaluation qualitative, les surnageants de culture cellulaire (voir l’étape 3.1.2) sont analysés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium (SDS-PAGE) et par transfert Western subséquent. En fonction de l' PEDF transposon plasmidique ADN utilisé, les surnageants doivent être traités différemment.
    1. Purification des protéines de fusion PEDF marquées par His à partir de surnageants de culture cellulaire
      1. Prélever 30 μL de suspension d’acide nickel-nitrilotriacétique (Ni-NTA) par échantillon à l’aide d’une pointe conique et enduire la résine Ni-NTA en granulés par centrifugation (2 660 x g pendant 30 s).
      2. Remettez délicatement en suspension la résine Ni-NTA avec 200 μL de tampon d’incubation 1x (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0) et granulez-la par centrifugation (2 660 x g pendant 30 s).
      3. Répétez l’étape précédente.
      4. Remettez délicatement en suspension la résine Ni-NTA avec un tampon d’incubation 4x 40 μL (200 mM NaH 2 PO4,1,2M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8,0) par échantillon.
      5. Mélanger 900 μL de surnageant de culture cellulaire avec 260 μL de tampon d’incubation 4x et 55 μL de suspension de Ni-NTA prétraitée (voir étape 3.2.1.4).
      6. Incuber le mélange sur un agitateur à bascule à température ambiante pendant 60 min.
      7. Enduire la résine Ni-NTA par centrifugation (2660 x g pendant 60 s).
      8. Remettez délicatement en suspension la résine Ni-NTA avec 175 μL de tampon d’incubation 1x et de résine de pastilles par centrifugation (2 660 x g pendant 60 s).
      9. Répétez l’étape précédente.
      10. Remettez délicatement en suspension la résine Ni-NTA avec 30 μL de tampon d’élution (50 mMNaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8,0) et incuber le mélange sur un agitateur à bascule à température ambiante pendant 20 min.
      11. Enduire la résine Ni-NTA par centrifugation (2 660 x g pendant 30 s).
      12. Prenez soigneusement le surnageant et mélangez-le avec 2x tampon d’échantillonSDS 47.
      13. Chauffer le mélange à 95 °C pendant 5 min et séparer les protéines purifiées Ni-NTA sur un gel de polyacrylamide SDS à 10%.
      14. Effectuer le transfert Western à l’aide d’anticorps anti-Penta-His (monoclonal de souris, 1:500) et d’anticorps anti-souris conjugués à la peroxydase de raifort (HRP) (polyclonal de lapin, 1:1 000) comme décrit précédemment36,37.
    2. Analyse directe des protéines PEDF non marquées
      1. Prenez 15 μL de surnageant de culture cellulaire et mélangez-le avec 2x tampon d’échantillon SDS47.
      2. Chauffer le mélange à 95 °C pendant 5 min et séparer les protéines sur un gel de polyacrylamide SDS à 10%.
      3. Effectuer le Western blot en utilisant des anticorps anti-PEDF humains (polyclonal de lapin, 1:4 000) et des anticorps anti-lapin conjugués HRP (polyclonal de chèvre, 1:2 000) comme décrit précédemment38.
    3. Quantification de la sécrétion de PEDF par ELISA
      1. Analyser les surnageants de culture cellulaire (voir étape 3.1.2) à l’aide d’un kit ELISA PEDF humain selon le protocole du fabricant.
      2. Relier la quantité de PEDF sécrétée au temps et au nombre de cellules déterminés pour chaque réaction de transfection (voir étape 3.1.4).
    4. Analyse de l’expression du gène PEDF dans les cellules RPE transfectées
      1. Isoler l’ARN total des pastilles cellulaires d’EPR (voir étape 3.1.5) à l’aide d’une trousse disponible dans le commerce conformément au protocole du fabricant.
      2. Quantifier la teneur en ARN à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume.
      3. Effectuer la transcription inverse sur 0,1 μg d’ARN à l’aide d’un système de transcription inverse selon le protocole du fabricant.
      4. Effectuer une qPCR en temps réel comme décrit précédemment38.
    5. Analyse des sites d’insertion des transgènes dans les cellules EPR transfectées
      1. Isoler l’ADN génomique des granules cellulaires EPR (voir étape 3.1.5) à l’aide d’une trousse disponible dans le commerce conformément au protocole du fabricant.
      2. Quantifier le contenu de l’ADN à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume.
      3. Générez des bibliothèques de sites d’insertion à l’aide d’un schéma de PCR hémi-spécifique assisté par calcul, comme décrit précédemment38.
      4. Effectuer l’analyse informatique comme décrit précédemment38.

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Résultats

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Culture et électroporation de cellules EPR humaines primaires
Nous avons montré que l’ensemencement d’un nombre suffisant de cellules primaires EPR d’origine animale permet la culture et la croissance vers une monocouche intégrée de cellules pigmentées de forme hexagonale36,37,48. Leur capacité à former des jonctions serrées, à présenter une activité phagocytaire et à exprimer...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans notre projet, nous visons la production non virale de cellules EPR primaires humaines génétiquement modifiées qui surexpriment et sécrètent continuellement un facteur efficace afin d’utiliser les cellules transfectées comme thérapeutique à long terme pour l’établissement et le maintien d’un environnement protecteur. Nous avons établi l’introduction du gène codant pour la PEDF, une protéine multifonctionnelle omniprésente avec des fonctions anti-angiogéniques et neuroprotectrices. Le protocole décrit ici peut être ut...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Zoltán Ivics et Zsuzsanna Izsvák sont les inventeurs de plusieurs brevets sur la technologie de transposon SB

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été soutenus par le septième programme-cadre de recherche, de développement technologique et de démonstration de l’Union européenne, la convention de subvention n° 305134. Zsuzsanna Izsvák a été financée par le Conseil européen de la recherche, ERC Advanced (ERC-2011-ADG 294742). Les auteurs tiennent à remercier Anna Dobias et Antje Schiefer (Département d’ophtalmologie, Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle) pour leur excellent soutien technique, ainsi que la Banque de cornée d’Aix-la-Chapelle (Département d’ophtalmologie, Hôpital universitaire RWTH Aix-la-Chapelle) pour avoir fourni les yeux du donneur humain.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Isolement des cellules primaires humaines RPE
24-Well Cell Culture PlateEppendorf, Hambourg, Allemagne0030722019
Amphotéricine B [250 µ ; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AllemagneA2942
Pince ColibriGeuder, Heidelberg, AllemagneG-18950
Pince à iris courbée  ;Geuder, Heidelberg, AllemagneG-18856
Scalpel jetable (n° 11)Feather, Osaka, Japon
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium/Ham' s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AllemagneP04-41150
Ciseaux à œil pointu extra fins  ;Geuder, Heidelberg, AllemagneG-19405
Sérum fœtal de bovin [0,2 & micro ; m Stérile filtré] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AllemagneP40-37500
Pipettes en verre Pasteurde marque, Wertheim, Allemagne747715
Pénicilline [10 000 unités/mL] et streptomycine [10 mg/mL] (Pen/Strep)Merck, Darmstadt, AllemagneP0781
Pointes de pipette (1000 µ ; L)Starlab, Hambourg, Allemagne
Pipette monocanal (100-1000 & micro ; L)Eppendorf, Hambourg, Allemagne
Drapé stérileLohmann & Rauscher, Rengsdorf, Allemagne
Compresse de gaze stérile  ;Fink-Walter, Merchweiler, Allemagne321063
Gants stérilesSempermed, Vienne, Autriche
Boîte de Pétri stérile (Falcon 60 mm x 15 mm)Corning, Corning, NY351007
Blouse chirurgicale stérileHalyard Health, Alpharetta, GA
Pince à iris droite  ;G-18855
Électroporation de cellules primaires humaines RPE
10 mM Tris-HCl (pH 8,5)
Plaque de culture cellulaire à 12 puitsThermo Fisher Scientific, Waltham, MA150628
Plaque de culture cellulaire à 24 puitsEppendorf, Hambourg, Allemagne
amphotéricine B [250 & micro ; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AllemagneA2942
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium/Ham' s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AllemagneP04-41150
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes (1,5 mL)Eppendorf, Hambourg, Allemagne
Sérum fœtal de bovin [0,2 & micro ; m Stérile filtré] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AllemagneP40-37500
Microscope inverséLeica Mikrosysteme, Wetzlar, AllemagneLeica DMi8
(spectrophotomètre NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Système de transfection capillaire (système de transfection au néon)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
MPK5000 Neon Transfection System 10 & micro ; L KitThermo Fisher Scientific, Waltham, MAMPK1096
hémocytomètre (chambre Neubauer)Paul Marienfeld, Lauda-Kö ; nigshofen, Allemagne0640110
PBS Dulbecco sans Ca2+ sans Mg2+Biochrom, Berlin, AllemagneL182-50
Pénicilline [10 000 unités/mL] et streptomycine [10 mg/mL] (Pen/Streptocoque)Merck, Darmstadt, AllemagneP0781
Pointes de pipette (10 µ ; L)Starlab, Hambourg, Allemagne
Pointes de pipette (1000 µ ; L)Starlab, Hambourg, Allemagne
Pointes de pipette (200 µ ; L)Starlab, Hambourg, Allemagne
Plasmid Maxi KitQiagen, Hilden, Allemagne12163
Pipette monocanal (0,1-10 & micro ; L)Eppendorf, Hambourg, Allemagne
Pipette monocanal (100-1000 & micro ; L)Eppendorf, Hambourg, Allemagne
Pipette monocanal (10-200 & micro ; L)Eppendorf, Hambourg, Allemagne
Trypan Blue SolutionMerck, Darmstadt, AllemagneT8154
Trypsine-EDTA (0,05  ;%)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
Analyses de cellules EPR humaines primaires transfectées
10 % SDS-Polyacrylamide Gel
1x tampon d’incubation (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0)
2x tampon d’échantillon
4x tampon d’incubation (200 mM NaH2PO4, 1,2 M NaCl, 40 mM imidazole, pH 8,0)
Amersham Protran Soutenu 0,2 & micro ; m  ; Membrane buvardante nitrocellulosiqueCytiva, Marlborough, MA10600015
amphotéricine B [250 µ ; g/mL] (AmphoB)Merck, Darmstadt, AllemagneA2942
Anticorps anti-PEDF (polyclonaux de lapin)BioProducts, Middletown, MDAnticorps anti-penta-HIS AB-PEDF1
(monoclonal de souris)Qiagen, Hilden, Allemagne34660
Dulbecco' s Aigle modifié' s Medium/Ham' s F-12 Nutrient Mixture (DMEM/F12)PAN-Biotech, Aidenbach, AllemagneP04-41150
Tampon d’élution (50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8,0)  ;
Sérum fœtal bovin [0,2 & micro ; m Stérile Filtré] (FBS)PAN-Biotech, Aidenbach, AllemagneP40-37500
Hémocytomètre (Chambre Neubauer)Paul Marienfeld, Lauda-Kö ; nigshofen, Allemagne0640110
Anticorps anti-souris conjugués à la peroxydase de raifort (polyclonaux de lapin)Agilent Dako, Santa Clara, CAP0260
Anticorps anti-lapin conjugués à la peroxydase de raifort (polyclonaux de chèvre)Abcam, Cambridge, Royaume-Uniab6721
Kit ELISA PEDF humain  ;BioProducts, Middletown, MDPED613
LAS-3000 Système d’imagerieFujifilm, Minato, Japon
LightCycler 1.2 InstrumentRoche Life Science, Penzberg, Allemagne
LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green IRoche Life Science, Penzberg, Allemagne12239264001
LightCycler  ; Capillaires (20 &mu ; l)Roche Life Science, Penzberg, Allemagne4929292001
Spectrophotomètre à microvolume (spectrophotomètre NanoDrop)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA
Mini-PROTEAN  ; Module de coulée de cellules TetraBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Allemagne1658015
Mini-PROTEAN  ; Cellule d’électrophorèse verticale Tetra pour mini-gels préfabriqués, 4 gelsBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Allemagne1658004
Ni-NTA SuperflowQiagen, Hilden, Allemagne30410
PageRuler Échelle de protéines précoloréesThermo Fisher Scientific, Waltham, MA26616
Pénicilline [10 000 unités/mL] et streptomycine [10 mg/mL] (Pen/Streptocoque)Merck, Darmstadt, AllemagneP0781
Pointes de pipette (10 & micro ; L)Starlab, Hambourg, Allemagne
Pointes de pipette (1000 µ ; L)Starlab, Hambourg, Allemagne
Pointes de pipette (200 µ ; L)Starlab, Hambourg, Allemagne
PowerPac BasicPower Supply Bio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Allemagne1645050
QIAamp DNA Mini KitQiagen, Hilden, Allemagne51304
Système de transcription inverse  ;Promega, Madison, WIA3500
Ensemble DNase sans RNaseQiagen, Hilden, Allemagne79254
Mini Kit RNeasy  ;Qiagen, Hilden, Allemagne74104
Rocking ShakerCole-Parmer, Staffordshire, Royaume-UniSSM3
Safe-Lock (1,5 mL)Eppendorf, Hambourg, Allemagne
Tubes microcentrifuges Safe-Lock (2,0 mL)Eppendorf, Hambourg, Allemagne
Pipette monocanal (0,1-10 & micro ; L)Eppendorf, Hambourg, Allemagne
Pipette monocanal (100-1000 & micro ; L)Eppendorf, Hambourg, Allemagne
Pipette monocanal (10-200 & micro ; L)Eppendorf, Hambourg, Allemagne
Système de transfert turbo Trans-BlotBio-Rad Laboratories, Feldkirchen, Allemagne1704150
Trypan Blue SolutionMerck, Darmstadt, AllemagneT8154
Trypsine-EDTA (0,05  ;%)Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA25300054
0030722019 Spectrophotomètre microvolume SDS Tubes microcentrifuges

Références

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