Assemblage rapide de constructions multigéniques à l’aide du clonage modulaire golden gate

Summary

L’objectif de ce protocole est de fournir un guide détaillé, étape par étape, pour l’assemblage de constructions multigéniques à l’aide du système modulaire de clonage basé sur le clonage Golden Gate. Il formule également des recommandations sur les étapes critiques pour assurer un assemblage optimal en fonction de nos expériences.

Abstract

La méthode de clonage golden gate permet l’assemblage rapide de plusieurs gènes dans n’importe quel arrangement défini par l’utilisateur. Il utilise des enzymes de restriction de type IIS qui coupent en dehors de leurs sites de reconnaissance et créent un court surplomb. Ce système modulaire de clonage (MoClo) utilise un flux de travail hiérarchique dans lequel différentes parties de l’ADN, telles que les promoteurs, les séquences de codage (CDS) et les terminateurs, sont d’abord clonées dans un vecteur d’entrée. Les vecteurs à entrées multiples se rassemblent ensuite en unités de transcription. Plusieurs unités de transcription se connectent alors à un plasmide multigénique. La stratégie de clonage golden gate est d’un énorme avantage car elle permet un assemblage sans cicatrice, directionnel et modulaire dans une réaction d’un pot. Le flux de travail hiérarchique permet généralement le clonage facile d’une grande variété de constructions multigéniques sans avoir besoin de séquençage au-delà des vecteurs d’entrée. L’utilisation d’abandons de protéines fluorescentes permet un dépistage visuel facile. Ces travaux fournissent un protocole détaillé, étape par étape pour l’assemblage de plasmides multigéniques à l’aide du kit modulaire de clonage de levures (MoClo). Nous montrons des résultats optimaux et sous-optimaux de l’assemblage de plasmides multigéniques et fournissons un guide pour le dépistage des colonies. Cette stratégie de clonage est très applicable pour l’ingénierie métabolique de levure et d’autres situations dans lesquelles le clonage plasmide multigénique est exigé.

Introduction

La biologie synthétique vise à concevoir des systèmes biologiques avec de nouvelles fonctionnalités utiles pour les industries pharmaceutiques, agricoles et chimiques. L’assemblage d’un grand nombre de fragments d’ADN d’une manière à haut débit est une technologie fondamentale en biologie synthétique. Un processus aussi compliqué peut se décomposer en plusieurs niveaux avec une complexité décroissante, un concept emprunté aux sciences fondamentales de^{l’ingénierie 1,2}. En biologie synthétique, les fragments d’ADN s’assemblent généralement hiérarchiquement en fonction de la fonctionnalité : (i) Niveau de partie ....

Protocol

REMARQUE : Le protocole hiérarchique de clonage offert dans cette boîte à outils peut être divisé en trois étapes principales : 1. Clonage des plasmides de la partie; 2. Unités de transcription du clonage (ET); 3. Clonage de plasmides multigéniques (Figure 1). Ce protocole commence à partir de la conception de l’amorce et se termine par des applications du plasmide multigénique cloné.

1. Conception d’amorce pour clonage de la partie plasmide (pYTK001) :

1. Concevoir les amorces avant et arrière contenant des nucléotides flanqués TTT à l’extrémité 5', un site de reconnaissance BsmBI avec un nucléotide sup....

Results

Voici les résultats de quatre plasmides multigéniques réplicateurs pour la production de β-carotène (jaune) et de lycopène (rouge). Un plasmide multigénique intégratif pour perturber le locus ADE2 a été construit, dont les colonies sont rouges.

Clonage des CDS dans le vecteur d’entrée (pYTK001)
ERG20 a été amplifié à partir du génome de levure et les trois gènes caroténoïdes crtE, <.......

Discussion

Le kit de clonage moclo développé par Lee et coll. fournit une excellente ressource pour l’assemblage rapide d’une à cinq unités de transcription dans un plasmide multigénique, soit pour la réplication ou l’intégration dans le génome de la levure. L’utilisation de ce kit élimine le goulot d’étranglement de clonage qui prend beaucoup de temps qui existe fréquemment pour exprimer plusieurs gènes dans la levure.

Nous avons testé cinq conditions différentes pour les cycles de digestion/ligature du.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5 mm Perles de verre	Produits de recherche RPI	9831	Pour la lyse des cellules
de levure Bacto Agar	BD & Entreprise	214010	Composant du milieu synthétique complet de levure (CSM)
Bacto Peptone	BD& Société	211677	Composant de l’extrait de levure peptone dextrose milieu (YPD)
BsaI-HFv2	New England Biolabs	R3733S	une version très efficace de l’enzyme de restriction BsaI
Carbenicilline	Fisher Bioreagents	4800-94-6	Antibiotique pour le criblage au niveau de l’unité de transcription
Chloramphénicol	Fisher Bioreagents	56-75-7	Antibiotique pour le criblage au niveau de vecteur d’entrée
CSM-His	Sunrise Sciences	1006-010	Supplément d’acides aminés du milieu synthétique complet de levure (CSM)
Dextrose	Fisher Chemical	D16-500	Source de carbone du milieu synthétique complet de levure (CSM)
Base d’azote de levure Difco sans acides aminés	BD & Entreprise	291940	Source d’azote du milieu synthétique complet de levure (CSM)
dNTP mix	Promega	U1515	dNTPs pour PCR
Esp3I	New England Biolabs	R0734S	un isoschizomère très efficace de BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II Kit	Zymo Research	T2001	Pour la transformation de la levure
Hexanes	Fisher Chemical	H302-1	Pour l’extraction de caroténoïdes à partir de cellules de levure
Kanamycin	Fisher Bioreagents	25389-94-0	Antibiotique pour le criblage au niveau du plasmide multigénique
LB Agar, Miller	Fisher Bioreagents	BP1425-2	Milieu gélosé lysogénique pour E. coli culture
LB Broth, Miller	Fisher Bioreagents	BP1426-2	Milieu liquide lysogénique pour E. coli culture de
lycopène	Produits chimiques des Caïmans	NC1142173	Pour la quantification du lycopène
MoClo YTK	Addgene	1000000061	Laboratoire de dépôt : John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep Kit	New England Biolabs	T1010L	Pour la purification des plasmides à partir de E.coli
Nanodrop Spectrophotomètre	Thermo Scientific	ND2000c	Pour mesurer des concentrations d’ADN précises
NotI-HF	New England Biolabs	R3189S	Enzyme de restriction pour la linéarisation intégrative du plasmide multigénique
Nourseothricin	Sulfate Goldbio	N-500-100	Antibiotique Marqueur de sélection pour le plasmide pCAS utilisé dans cette étude
Tampon de réaction Phusion HF (5X)	New England Biolabs	B0518S	Tampon pour PCR à l’aide de la phusion polymérase
Phusion High Fidelity DNA Polymerase	New England Biolabs	M0530S	Polymérase haute fidélité pour toutes les réactions PCR
pLM494	Addgene	100539	Plasmide utilisé pour amplifier crtI, crtYB et crtE utilisé dans cette étude
Cuvette de quartz	Thermo Electron	10050801	Pour quantifier les caroténoïdes
T4 ligase	New England Biolabs	M0202S	Ligase pour Golden
Thermocycleur	BIO-RAD	1851148	Pour effectuer toutes les réactions de PCR et de clonage
Homogénéisateur de tissus	Bullet Blender	Modèle : BBX24	Pour l’homogénéisation des cellules de levure
Spectrophotomètre UV-Vis	Thermo Scientific	Genesys 150	Pour quantifier les caroténoïdes
Extrait de levure Fisher	Bioréactifs	BP1422-500	Composant de l’extrait de levure peptone dextrose milieu (YPD)
&bêta ;-carotène	Alfa Aesar	AAH6010603	Pour la quantification du &bêta ;-carotène