Method Article

Assemblage rapide de constructions multigéniques à l’aide du clonage modulaire golden gate

DOI:

10.3791/61993

February 5th, 2021

In This Article

Summary

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L’objectif de ce protocole est de fournir un guide détaillé, étape par étape, pour l’assemblage de constructions multigéniques à l’aide du système modulaire de clonage basé sur le clonage Golden Gate. Il formule également des recommandations sur les étapes critiques pour assurer un assemblage optimal en fonction de nos expériences.

Abstract

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La méthode de clonage golden gate permet l’assemblage rapide de plusieurs gènes dans n’importe quel arrangement défini par l’utilisateur. Il utilise des enzymes de restriction de type IIS qui coupent en dehors de leurs sites de reconnaissance et créent un court surplomb. Ce système modulaire de clonage (MoClo) utilise un flux de travail hiérarchique dans lequel différentes parties de l’ADN, telles que les promoteurs, les séquences de codage (CDS) et les terminateurs, sont d’abord clonées dans un vecteur d’entrée. Les vecteurs à entrées multiples se rassemblent ensuite en unités de transcription. Plusieurs unités de transcription se connectent alors à un plasmide multigénique. La stratégie de clonage golden gate est d’un énorme avantage car elle permet un assemblage sans cicatrice, directionnel et modulaire dans une réaction d’un pot. Le flux de travail hiérarchique permet généralement le clonage facile d’une grande variété de constructions multigéniques sans avoir besoin de séquençage au-delà des vecteurs d’entrée. L’utilisation d’abandons de protéines fluorescentes permet un dépistage visuel facile. Ces travaux fournissent un protocole détaillé, étape par étape pour l’assemblage de plasmides multigéniques à l’aide du kit modulaire de clonage de levures (MoClo). Nous montrons des résultats optimaux et sous-optimaux de l’assemblage de plasmides multigéniques et fournissons un guide pour le dépistage des colonies. Cette stratégie de clonage est très applicable pour l’ingénierie métabolique de levure et d’autres situations dans lesquelles le clonage plasmide multigénique est exigé.

Introduction

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La biologie synthétique vise à concevoir des systèmes biologiques avec de nouvelles fonctionnalités utiles pour les industries pharmaceutiques, agricoles et chimiques. L’assemblage d’un grand nombre de fragments d’ADN d’une manière à haut débit est une technologie fondamentale en biologie synthétique. Un processus aussi compliqué peut se décomposer en plusieurs niveaux avec une complexité décroissante, un concept emprunté aux sciences fondamentales del’ingénierie 1,2. En biologie synthétique, les fragments d’ADN s’assemblent généralement hiérarchiquement en fonction de la fonctionnalité : (i) Niveau de partie ....

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Protocol

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REMARQUE : Le protocole hiérarchique de clonage offert dans cette boîte à outils peut être divisé en trois étapes principales : 1. Clonage des plasmides de la partie; 2. Unités de transcription du clonage (ET); 3. Clonage de plasmides multigéniques (Figure 1). Ce protocole commence à partir de la conception de l’amorce et se termine par des applications du plasmide multigénique cloné.

1. Conception d’amorce pour clonage de la partie plasmide (pYTK001) :

  1. Concevoir les amorces avant et arrière contenant des nucléotides flanqués TTT à l’extrémité 5', un site de reconnaissance BsmBI avec un nucléotide sup....

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Results

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Voici les résultats de quatre plasmides multigéniques réplicateurs pour la production de β-carotène (jaune) et de lycopène (rouge). Un plasmide multigénique intégratif pour perturber le locus ADE2 a été construit, dont les colonies sont rouges.

Clonage des CDS dans le vecteur d’entrée (pYTK001)
ERG20 a été amplifié à partir du génome de levure et les trois gènes caroténoïdes crtE, <.......

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Discussion

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Le kit de clonage moclo développé par Lee et coll. fournit une excellente ressource pour l’assemblage rapide d’une à cinq unités de transcription dans un plasmide multigénique, soit pour la réplication ou l’intégration dans le génome de la levure. L’utilisation de ce kit élimine le goulot d’étranglement de clonage qui prend beaucoup de temps qui existe fréquemment pour exprimer plusieurs gènes dans la levure.

Nous avons testé cinq conditions différentes pour les cycles de digestion/ligature du.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Ces travaux ont été financés par la Research Foundation de l’Université d’État de New York (Prix #: 71272) et le Prix IMPACT de l’Université à Buffalo (Prix #: 000077).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,5 mm Perles de verreProduits de recherche RPI9831Pour la lyse des cellules
de levure Bacto AgarBD & Entreprise214010Composant du milieu synthétique complet de levure (CSM)
Bacto PeptoneBD& Société211677Composant de l’extrait de levure peptone dextrose milieu (YPD)
BsaI-HFv2New England BiolabsR3733Sune version très efficace de l’enzyme de restriction BsaI
CarbenicillineFisher Bioreagents4800-94-6Antibiotique pour le criblage au niveau de l’unité de transcription
ChloramphénicolFisher Bioreagents56-75-7Antibiotique pour le criblage au niveau de vecteur d’entrée
CSM-HisSunrise Sciences1006-010Supplément d’acides aminés du milieu synthétique complet de levure (CSM)
DextroseFisher ChemicalD16-500Source de carbone du milieu synthétique complet de levure (CSM)
Base d’azote de levure Difco sans acides aminésBD & Entreprise291940Source d’azote du milieu synthétique complet de levure (CSM)
dNTP mixPromegaU1515dNTPs pour PCR
Esp3INew England BiolabsR0734Sun isoschizomère très efficace de BsmBI
Frozen-EZ Yeast Trasformation II KitZymo ResearchT2001Pour la transformation de la levure
HexanesFisher ChemicalH302-1Pour l’extraction de caroténoïdes à partir de cellules de levure
KanamycinFisher Bioreagents25389-94-0Antibiotique pour le criblage au niveau du plasmide multigénique
LB Agar, MillerFisher BioreagentsBP1425-2Milieu gélosé lysogénique pour E. coli culture
LB Broth, MillerFisher BioreagentsBP1426-2Milieu liquide lysogénique pour E. coli culture de
lycopèneProduits chimiques des CaïmansNC1142173Pour la quantification du lycopène
MoClo YTKAddgene1000000061Laboratoire de dépôt : John Deuber
Monarch Plasmid Miniprep KitNew England BiolabsT1010LPour la purification des plasmides à partir de E.coli
Nanodrop SpectrophotomètreThermo ScientificND2000cPour mesurer des concentrations d’ADN précises
NotI-HFNew England BiolabsR3189SEnzyme de restriction pour la linéarisation intégrative du plasmide multigénique
NourseothricinSulfate GoldbioN-500-100Antibiotique Marqueur de sélection pour le plasmide pCAS utilisé dans cette étude
Tampon de réaction Phusion HF (5X)New England BiolabsB0518STampon pour PCR à l’aide de la phusion polymérase
Phusion High Fidelity DNA PolymeraseNew England BiolabsM0530SPolymérase haute fidélité pour toutes les réactions PCR
pLM494Addgene100539Plasmide utilisé pour amplifier crtI, crtYB et crtE utilisé dans cette étude
Cuvette de quartzThermo Electron10050801Pour quantifier les caroténoïdes
T4 ligaseNew England BiolabsM0202SLigase pour Golden
ThermocycleurBIO-RAD1851148Pour effectuer toutes les réactions de PCR et de clonage
Homogénéisateur de tissusBullet BlenderModèle : BBX24Pour l’homogénéisation des cellules de levure
Spectrophotomètre UV-VisThermo ScientificGenesys 150Pour quantifier les caroténoïdes
Extrait de levure FisherBioréactifsBP1422-500Composant de l’extrait de levure peptone dextrose milieu (YPD)
&bêta ;-carotèneAlfa AesarAAH6010603Pour la quantification du &bêta ;-carotène

References

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Endy, D. Foundations for engineering biology. Nature. 438 (7067), 449-453 (2005).
  2. Engler, C., Gruetzner, R., Kandzia, R., Marillonnet, S. Golden gate shuffling: a one-pot DNA shuffling method based on type IIs restriction enzymes. PLoS One. 4 (5), 5553(2009).
  3. ....

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Golden Gate CloningModular CloningMulti Gene AssemblyYeast MoClo KitType IIS EnzymesEntry Vector CloningTranscription Unit AssemblyFluorescent Protein ScreeningDH5 Alpha TransformationUV Transilluminator Screening

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