Article de méthode

Ensemencement de cellules par étapes sur des échafaudages tessellés pour étudier les vaisseaux sanguins en germination

DOI :

10.3791/61995

⸱

14 janvier 2021

 ,  ,  , 
1Faculty of Biomedical Engineering, Technion, 2Department of Chemical Engineering and Biointerfaces Institute, University of Michigan, Ann Arbor

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les tissus modifiés s’appuient fortement sur des réseaux vasculaires appropriés pour fournir des nutriments et des gaz vitaux et éliminer les déchets métaboliques. Dans ce travail, un protocole d’ensemencement par étapes de cellules endothéliales et de cellules de soutien crée des réseaux vasculaires hautement organisés dans une plate-forme à haut débit pour étudier le développement du comportement des vaisseaux dans un environnement 3D contrôlé.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le système cardiovasculaire est un acteur clé de la physiologie humaine, fournissant de la nourriture à la plupart des tissus du corps; Les vaisseaux sont présents dans différentes tailles, structures, phénotypes et performances en fonction de chaque tissu perfusé spécifique. Le domaine de l’ingénierie tissulaire, qui vise à réparer ou à remplacer les tissus corporels endommagés ou manquants, repose sur l’angiogenèse contrôlée pour créer une vascularisation appropriée dans les tissus modifiés. Sans système vasculaire, des constructions machinées épaisses ne peuvent pas être suffisamment nourries, qui peuvent avoir comme conséquence la mort cellulaire, la greffe pauvre, et finalement l’échec. Ainsi, comprendre et contrôler le comportement des vaisseaux sanguins modifiés est un défi de taille dans le domaine. Ce travail présente un système à haut débit qui permet la création de réseaux de navires organisés et reproductibles pour étudier le comportement des navires dans un environnement d’échafaudage 3D. Ce protocole d’ensemencement en deux étapes montre que les vaisseaux dans le système réagissent à la topographie de l’échafaudage, présentant des comportements de germination distinctifs en fonction de la géométrie du compartiment dans lequel résident les vaisseaux. Les résultats obtenus et la compréhension de ce système à haut débit peuvent être appliqués afin d’informer de meilleures conceptions de construction d’échafaudages bio-imprimés 3D, dans lesquelles la fabrication de diverses géométries 3D ne peut pas être rapidement évaluée lors de l’utilisation de l’impression 3D comme base pour les environnements biologiques cellulaires. En outre, la compréhension de ce système à haut débit peut être utilisée pour l’amélioration du dépistage rapide des médicaments, le développement rapide de modèles de co-cultures et l’étude des stimuli mécaniques sur la formation des vaisseaux sanguins afin d’approfondir les connaissances sur le système vasculaire.

Introduction

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Le domaine de l’ingénierie tissulaire progresse rapidement vers la fabrication de constructions techniques pour remplacer les organes et tissus manquants ou endommagés1. Cependant, des constructions entièrement fonctionnelles n’ont pas encore été réalisées, en partie, puisque la génération de réseaux vasculaires opérationnels pour la nourriture de tissu demeure un défi exceptionnel. Sans vascularisation appropriée, les tissus modifiés sont limités à un transport passif de diffusion de l’oxygène et des nutriments, limitant l’épaisseur maximale des tissus viables à la limite de diffusion, environ 200μm2. De telles épaisseurs ne sont pas adaptées à la réparation de grands défauts tissulaires ou à la fabrication d’organes complets, ce qui rend la présence d’un réseau vasculaire fonctionnel une caractéristique obligatoire pour les tissus fonctionnels et implantables3.

Le système vasculaire est composé d’une grande variété de vaisseaux sanguins, avec différentes tailles, phénotypes, et l’organisation, étroitement liés au tissu de l’hôte. Comprendre le comportement, la réponse et les décisions de migration prises par les vaisseaux en développement et en germination peut instruire leur intégration dans les tissus artificiels4. Actuellement, l’approche la plus courante pour créer des réseaux vasculaires in vitro consiste à combiner des cellules endothéliales (CE) avec des cellules de soutien (SC, avec la capacité de se différencier en cellules murales), ensemencées dans un microenchantement tridimensionnel. Cet environnement fournit des indices chimiques et physiques pour permettre aux cellules de se fixer, de proliférer et de s’auto-assembler en réseaux de vaisseaux2,5,6,7,8. Lorsqu’ils sont en co-culture, les SC sécrètent des protéines de matrice extracellulaire (ECM) tout en fournissant un soutien mécanique aux CE, qui forment les structures tubulaires. En outre, une interaction croisée entre les deux types de cellules favorise la tubulogenèse, la germination des vaisseaux et la migration, en plus de la maturation et de la différenciation des SC en cellules murales exprimant l’actine α-lisse (αSMA)4. Le développement de réseaux de vaisseaux est le plus souvent étudié dans des environnements 3D créés à l’aide d’hydrogels, d’échafaudages polymères poreux ou d’une combinaison de ceux-ci. Cette dernière option fournit également un environnement convivial pour les cellules et le support mécanique requis pour les cellules et l’ECM9.

Un grand nombre de travaux ont été réalisés pour étudier le développement vasculaire, notamment la co-culture des cellules sur les hydrogels10,les combinaisons hydrogels-échafaudages11,12,les plateformes 2D, et les dispositifs microfluidiques13. Cependant, les hydrogels peuvent être facilement déformés par les forces exercées par les cellules14,tandis que les systèmes 2D et microfluidiques ne parviennent pas à recréer un environnement plus proche de la nature pour obtenir une réponse plus extrapolable15,16. Comprendre comment les navires formants réagissent à leur environnement environnant peut fournir des informations essentielles qui pourraient permettre la fabrication d’environnements techniques ayant la capacité de guider le développement des navires de manière prévisible. La compréhension des phénomènes de formation vasculaire est particulièrement essentielle pour suivre le rythme de l’émergence rapide des techniques de fabrication à l’échelle submicron-micron, telles que la stéréolithographie, la lithographie par projection numérique, la production continue d’interfaces liquides, l’électroécriture 3D 3D, l’écriture électro jet 3D basée sur une solution et les techniques émergentes de bioimpression17,18,19,20,21. L’alignement du contrôle de ces techniques de microfabrication avec une compréhension approfondie de la biologie vasculaire est essentiel à la création d’une vascularisation artificielle appropriée pour un tissu cible.

Ici, nous présentons un système 3D pour étudier la réponse des nouveaux vaisseaux de formation et de germination à la géométrie de l’échafaudage environnant, en observant leur origine de germination et la migration ultérieure22. En utilisant des échafaudages 3D avec des géométries de compartiments pavés et une technique d’ensemencement en deux étapes, nous avons réussi à créer des réseaux vasculaires hautement organisés d’une manière claire et facile à analyser. Les géométries pavées fournissent un système à haut débit avec des unités individuelles contenant des navires qui répondent à leur environnement local. À l’aide de CE multicolores, nous avons suivi les origines de la formation des germes et les modèles de migration subséquents, corrélés à la géométrie du compartiment et à l’emplacement des SC22.

Bien que le protocole proposé ait été préparé pour analyser les effets des indices géométriques sur le comportement de vascularisation, cette approche peut être augmentée et appliquée à une série de nouvelles applications. L’échafaudage pavé et les réseaux facilement imageables permettent l’analyse simple de différentes interactions entre les CE et les SC, l’ajout de cellules d’organes spécifiques et leur interaction avec les réseaux vasculaires, l’effet médicamenteux sur les réseaux vasculaires, et plus encore. Nos résultats de système suggérés très polyvalents et de fabrication et de traitement simples.

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Protocole

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1. Fabrication d’échafaudages tessellés

REMARQUE : La photolithographie est une technique répandue qui nécessite un équipement spécialisé généralement logé dans une installation ou un laboratoire de nanofabrication. La méthode exposée dans ce protocole a été généralisée autant que possible pour le public; toutefois, de légers changements aux procédures peuvent être nécessaires selon l’équipement dont dispose le lecteur. Nous vous recommandons d’effectuer ces procédures dans une salle blanche d’une installation de nanofabrication pour assurer la plus haute qualité de processus. Avant de commencer, obtenez l’accès à un aligneur de masque (ou à une installation d’exposition aux UV), à un essoreur, à des plaques chauffantes, à une station de lavage au solvant, à un photomasque et à un nettoyant au plasma. Les solvants et les produits chimiques utilisés dans la procédure sont dangereux, alors s’il vous plaît prendre le plus grand soin d’éviter toute exposition chimique. Lors de la conception du photomasque, identifiez la taille des plaquettes de silicium et des photomasques compatibles avec le spin-coater et l’aligneur de masque. De plus, la photorésine située vers les bords de la plaquette de silicium est généralement déformée par la manipulation; par conséquent, faites les dessins vers la zone centrale de la plaquette.

  1. Préparez des échafaudages à l’aide d’une technique de photolithographie avec la géométrie sélectionnée d’intérêt.
    1. Avant de faire tourner le revêtement, nettoyez la plaquette de silicium. Cela peut être fait avec un nettoyage au plasma ou une technique à base de solvants. En cas de nettoyage au plasma, suivez la procédure d’utilisation normalisée de l’instrument pour plus de détails opérationnels. Vaporisez de l’azote gazeux comprimé et inspectez la plaquette pour vous assurer qu’elle est exempte de débris avant le revêtement par rotation. Cette plaquette servira de substrat sur lequel les échafaudages sont créés.
      REMARQUE: Pour de meilleurs résultats, commencez par une plaquette fraîche. Les plaquettes peuvent être réutilisées, mais doivent être exemptes de vieille photorésine, de défauts de surface et de débris. Il est utile d’utiliser des pinces à épiler pour la manipulation.
    2. Centrez une plaquette de silicium sur le mandrin spin-coater à l’aide d’un guide. Faites tourner brièvement la plaquette pour vous assurer qu’elle a été correctement centrée sur le mandrin, ajustez-la si nécessaire jusqu’à ce qu’elle soit correctement centrée. Cela doit être fait chaque fois qu’une plaquette est placée sur le spin-coater. Distribuer 1 à 4 mL du réactif de décollage sur la plaquette (cela dépendra de la taille de la plaquette). Environ 2 mL de réactif de décollage fonctionne bien pour une plaquette de 4 pouces.
      1. Réglez la vitesse d’étalement du spin-coater à 500 tr / min pendant 5 secondes et la vitesse de rotation à 1000 tr / min pendant 30 secondes, puis faites tourner le réactif de décollage. Inspectez la plaquette pour vous assurer qu’elle a un revêtement uniforme à travers la plaquette. Tout débris laissé sur la plaquette sera très évident à ce stade. Tous les échafaudages dans une zone avec des débris seront probablement inutilisables. Après le spin coating, transférer sur une plaque chauffante et cuire pendant 1 minute à 200 °C.
    3. Répétez l’étape précédente deux fois de plus pour un total de trois revêtements.
    4. Spin-coat la plaquette de silicium revêtue de réactif de décollage avec su-8 2050 photorésine jusqu’à obtenir une épaisseur d’environ 100 μm.
      1. Distribuer 1 mL de résistance pour chaque 25 mm de diamètre de substrat.
        REMARQUE: Veillez à éviter les bulles tout en versant la résistance. Pour SU-8 2050, couler environ un cercle de 2 pouces de diamètre, lors de l’utilisation d’une plaquette de silicium de 4 pouces fonctionne bien.
      2. Spin-coat le SU-8 2050. Étaler à une vitesse de 500 tr/min pendant 5 secondes, suivie d’une vitesse de rotation comprise entre 1700 et 1800 tr/min pour atteindre une épaisseur d’environ 100 μm.
      3. Facultatif: Après la filature, laissez les plaquettes enduits de spin se démentir pendant la nuit sur une surface plane à l’abri de la lumière avant la précuisson. Cela peut aider à débarrasser la résistance de toutes les bulles et permettre aux défauts de se niveler.
        REMARQUE: L’épaisseur réelle de la résistance et des échafaudages résultants peut varier en fonction de l’erreur de l’utilisateur et des paramètres d’équipement. Par conséquent, l’épaisseur des échafaudages doit être vérifiée ultérieurement, à l’étape 1.6. Modifier les procédures de revêtement par rotation en conséquence pour atteindre l’épaisseur souhaitée.
    5. Avant l’exposition, précuisez les plaquettes à 65 °C pendant 10 min, puis à 95 °C pendant 40 à 50 min. Avant l’exposition, testez la surface de la résistance en appuyant sur le bord avec une pince à épiler pour vous assurer qu’elle n’est plus collante / visqueuse. Il est utile de retirer la plaquette de la plaque chauffante et de la laisser refroidir pendant 0,5 à 1 min avant d’évaluer le caractère de l’adhérence.
      REMARQUE : Des temps de rampe de température lents (chauffage et refroidissement) peuvent aider à prévenir la déformation des échafaudages.
  2. Exposer la photorésine à la lumière UV (350-400 nm) à travers un photomasque avec une énergie d’exposition de 215-240 mJ/cm2 pour une épaisseur de résistance de 85 - 110 μm. Reportez-vous aux lignes directrices du fabricant de photorésine pour connaître les corrélations énergie-épaisseur d’exposition recommandées.
    1. Assurez-vous que l’exposition est correctement calibrée de manière à ce que l’énergie soit vérifiée. Ajustez le temps d’exposition au besoin pour obtenir l’énergie d’exposition souhaitée. De plus, les aligneurs de masque peuvent permettre différents modes d’exposition : contact sous vide, contact dur, contact doux et contact de proximité (des termes spécifiques peuvent varier). En règle générale, cela aura un impact sur la résolution et l’alignement des entités. Les auteurs utilisaient généralement un mode de « contact dur ».
    2. Pour les petites entités ou les couches multiples, où l’alignement est important, prenez en compte les modes d’exposition et les procédures d’aligneur de masque plus attentivement. Veillez à tenir compte de la hauteur de la résistance lors du réglage de la valeur d’épaisseur. Reportez-vous aux procédures d’utilisation normalisées de votre aligneur de masques pour plus de détails sur l’opération.
      REMARQUE : La conception du photomasque déterminera la taille des échafaudages, la géométrie du compartiment et le nombre d’échafaudages obtenus par lot. L’utilisation d’un photomasque en verre dur ou en quartz donnera la résolution la plus élevée; cependant, un photomasque de film transparent en polymère souple peut généralement être utilisé pour ces grandes tailles de caractéristiques (>10 μm). L’utilisation d’un photomasque de film peut conduire à des caractéristiques topographiques le long de l’axe z des pores de l’échafaudage en raison d’une résolution de caractéristique plus faible. Cela pourrait potentiellement avoir une influence sur le comportement des cellules. Vérifiez la résolution souhaitée consultez la personne qui produit le photomasque pour vous assurer que la résolution souhaitée est atteinte.
  3. Cuire la plaquette immédiatement après l’exposition aux UV à 65 °C pendant 2-5 minutes, puis à 95 °C pendant 8-10 minutes.
  4. Développer les échafaudages pour éliminer la résistance non développée.
    1. Plongez les échafaudages à l’aide d’un faible volume de solution de développement SU-8 pendant 7 à 10 minutes pour dissoudre toute résistance non développée.
    2. Rincer à l’alcool isopropylique (IPA).
    3. Plaquette sèche avec de l’azote comprimé.
      Remarque : Veillez à l’étape 1.4 pour ne pas provoquer la libération prématurée des échafaudages. De faibles volumes de révélateur et une manipulation douce sont nécessaires pour y parvenir.
  5. Après le développement, cuire les plaquettes à 150 °C pendant 15 min.
    REMARQUE: Après la cuisson dure, éteindre la plaque chauffante pour permettre aux plaquettes de refroidir très lentement peut être avantageux pour empêcher la déformation / l’enroulement des échafaudages finaux.
  6. Facultatif: Après la cuisson dure et avant le décollage, évaluez l’épaisseur de l’échafaudage puisque les échafaudages doivent toujours être légèrement collés à la surface de la plaquette. Pour cette procédure, la profilométrie de contact fonctionne bien; toutefois, toute méthode appropriée pourrait être utilisée.
  7. Soulevez les échafaudages de la plaquette.
    1. Submergez les échafaudages dans le développeur SU-8 pour les faire soulever immédiatement de la plaquette. Si les échafaudages ne décollent pas, poussez doucement les échafaudages avec une paire de pinces à épiler.
    2. Supprimer le développeur excédentaire.
    3. Transférer les échafaudages dans un nouveau récipient et plonger dans de l’alcool isopropylique. Rincer dans l’IPA pendant au moins 6 fois pour vous assurer que tout le développeur a été retiré.
  8. Sécher à l’air les échafaudages pendant au moins une semaine avant utilisation.

2. Revêtement de fibronectine d’échafaudage

  1. Pour la désinfection, submerger les échafaudages dans de l’éthanol à 70 % (v/v) pendant au moins 15 minutes, et laver 2 fois dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avant utilisation.
    ATTENTION: Les échafaudages SU-8 sont fragiles et peuvent se casser facilement. La manipulation est recommandée à l’aide de pinces émoussées et incurvées, et elles doivent être manipulées avec le plus grand soin. Une manipulation plus facile peut être obtenue en submergeant les échafaudages dans un liquide, afin d’éviter les interactions électrostatiques entre les échafaudages et la surface.
  2. Préparer une dilution de 50 μg/mL de fibronectine humaine dans le PBS et couvrir les échafaudages par adsorption de protéines.
    1. Mélanger 1,5 μL de solution mère de fibronectine (1 mg/mL) avec 28,5 μL de PBS par échafaudage à ensemencer. De préférence, préparer une seule dilution de fibronectine à utiliser pour tous les échafaudages afin d’éviter les erreurs de pipetage.
      1. Pour 10 échafaudages, mélanger 15 μL de solution de fibronectine mère dans 285 μL de PBS, soit un total de 300 μL de dilution de fibronectine de 50 μg/mL.
    2. Placer les échafaudages épars sur une surface hydrophobe (c.-à-d. parabole de 10 cm de culture non tissulaire (nonTC)) et recouvrir chaque échafaudage de 30 μL de la dilution de fibronectine préparée à l’étape 2.2.1.
      ATTENTION: Assurez-vous qu’aucune bulle n’est piégée dans les compartiments de l’échafaudage. Si des bulles sont présentes, elles peuvent être enlevées en secouant doucement l’échafaudage à l’intérieur de la gouttelette ou en pipetage léger.
    3. Remplacez le couvercle de la plaque et placez les échafaudages recouverts de fibronectine dans un incubateur à 37 °C et à 100 % d’humidité pendant au moins une heure.
    4. Après incubation, rincez légèrement les échafaudages dans du PBS pour éliminer les restes de fibronectine. Les échafaudages peuvent être conservés dans du PBS à 4 °C jusqu’à une semaine avant utilisation.

3. Ensemencement des cellules endothéliales

  1. Préparer le milieu EC en mélangeant le milieu basal avec ses composants correspondants du kit de milieu, y compris une solution antibiotique (Pen/Strep), du sérum fœtal bovin (FBS) et des suppléments de croissance des cellules endothéliales, comme indiqué par le fabricant.
  2. Faire une suspension de cellules endothéliales microvasculaires adipeuses humaines (HAMEC) en milieu EC avec une concentration de 4 x 106 cellules/mL.
    REMARQUE: L’imagerie en temps réel peut être effectuée si les cellules endothéliales utilisées sont précédemment transfectées pour exprimer une protéine fluorescente, ou pré-colorées à l’aide d’un colorant membranaire cytoplasmique non toxique (en outre appelé CE marqué).
  3. À l’aide d’une pince, placez un échafaudage enduit de fibronectine par puits sur un puits de plaque de 24 puits nonTC.
  4. Couvrir chaque échafaudage avec des gouttelettes de 25 μL de la suspension HAMEC. Méfiez-vous de ne pas laisser la suspension s’écouler loin de l’échafaudage, car elle peut entraver l’adhérence cellulaire.
  5. Mettez le couvercle sur la plaque et placez-le dans un incubateur à 37 °C, 5% de CO2 et 100% d’humidité. Laisser incuber pendant un minimum de 60 minutes et un maximum de 90 minutes.
    REMARQUE: Pendant l’incubation, placer la plaque sur un agitateur orbital dans l’incubateur améliore la fixation de la cellule sur les parois de l’échafaudage. Le shaker orbital ne doit pas être réglé à plus de 5 tr/min.
  6. Après incubation, remplissez chaque puits avec 700 μL de milieu EC à l’aide d’une pipette.
    Remarque : Attendez-vous à voir des CE au fond du puits, car certaines cellules ne se fixent pas à l’échafaudage et tombent à travers les vides de l’échafaudage.
  7. Incuber les échafaudages endothélialisés jusqu’à ce que la confluence EC puisse être observée à l’aide de la microscopie fluorescente sur les parois de l’échafaudage (lors de l’utilisation d’ECs étiquetés), ou pendant 3 jours (lors de l’utilisation d’ECs non marqués), ce qui donne suffisamment de temps pour réaliser la confluence EC. Changez le support tous les deux jours.

4. Soutenir l’ensemencement cellulaire et la co-culture

  1. Préparer le milieu de cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) (DPSCm) en mélangeant 500 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco à faible teneur en glucose (DMEM à faible teneur en glucose), 57,5 mL de FBS, 5,75 mL d’acides aminés non essentiels (NEAA), 5,75 mL de GlutaMAX et 5,75 mL de solution de pénicilline-streptomycine-nystatine.
  2. Transférer les échafaudages endothélialisés dans une nouvelle plaque de 24 puits nonTC pour éliminer les CE fixés au fond des puits à l’aide de pinces.
    1. Jetez tous les supports de la plaque de courant à l’aide d’une pipette de 1 mL ou d’une aspiration sous vide. Veillez à ne pas appliquer de vide directement sur l’échafaudage.
    2. Placez un échafaudage par puits, de préférence au centre du puits pour éviter de faire couler du liquide vers les parois en raison des effets de tension superficielle. Séchez la zone entourant l’échafaudage avec un léger vide, mais évitez le séchage complet de l’échafaudage.
  3. Préparer une suspension de DPSC dans une solution de pré-gel de fibrine.
    1. Diluer les solutions de stock de thrombine et de fibrinogène avec pbs jusqu’à obtenir une concentration finale de 5 U/mL et de 15 mg/mL, respectivement.
    2. Préparer une suspension 8 x 106 DPSC/mL dans la dilution de thrombine de 5 U/mL et répartir dans des eppendorfs individuels 12,5 μL de ladite suspension par échafaudage à ensemencer.
    3. Réglez une pipette de 5 à 50 μL (ou similaire) à 12,5 μL et remplissez-la avec la solution de fibrinogène à 15 mg/mL.
    4. Sans enlever la pointe, réglez la pipette sur 25 μL. Le matériau dans la pointe doit se lever et laisser un volume vide vers l’ouverture de la pointe.
    5. Appuyez lentement sur le bouton du piston jusqu’à ce que le liquide atteigne l’ouverture de la pointe mais ne fuit pas. Maintenez le piston dans cette position et mettez la pointe dans l’un des tubes microcentrifuge contenant les cellules en suspension de thrombine, en vous assurant que la pointe est en contact avec le liquide.
      ATTENTION : La réticulation de fibrine commencera immédiatement après que la thrombine et le fibrinogène entrent en contact. L’étape suivante doit être effectuée rapidement.
    6. Relâchez doucement le bouton du piston et tirez la suspension de la cellule dans la pointe. Mélangez soigneusement les deux matériaux, en évitant la formation de bulles.
  4. Distribuez rapidement les matériaux mélangés sur un échafaudage endothélialisé. Répétez les étapes précédentes pour chaque échafaudage, en vous assurant de toujours changer les pointes entre les utilisations pour éviter la formation inattendue de gel de fibrine dans la pointe.
  5. Remplacez le couvercle de la plaque et incuber les échafaudages à 37 °C, 5 % de CO2 et 100 % d’humidité pendant 30 minutes.
  6. Après l’incubation, remplissez chaque puits avec 1 mL de DPSC 1:1 et de milieu EC.
    1. Culture pendant 1 semaine, changeant de milieu tous les deux jours.
    2. Pendant la culture, retirez le milieu du puits et imagez les constructions à l’aide d’un microscope confocal à différents moments pour étudier le développement vasculaire ou tout autre paramètre d’intérêt.
      Remarque : cette étape ne peut être effectuée que si l’expérience est effectuée à l’aide d’ECs étiquetés. Voir Étape 6 - NOTE pour plus de précisions.

5. Coloration immunofluorescente pour marqueurs vasculaires caractéristiques

Remarque : les étapes suivantes peuvent être effectuées dans les mêmes puits où les constructions ont été cultivées. Il est essentiel de toujours s’assurer que les solutions couvrent complètement les échafaudages. De plus, dans la mesure du possible, il est recommandé d’effectuer les étapes sur un agitateur orbital, bien que ce ne soit pas obligatoire.

  1. Au jour 7, jetez le support des puits et rincez les échafaudages en ajoutant du PBS aux puits et en l’enlevant sous vide.
  2. Fixer les échafaudages en ajoutant 4% de paraformaldéhyde pendant 20 minutes. Laver en PBS 3 fois, 5 minutes par lavage.
  3. Perméabiliser les cellules fixes en utilisant 0,3% triton-X dans PBS (v/v) pendant 15 minutes. Laver en PBS 3 fois, 5 minutes par lavage.
  4. Préparer une albumine sérique bovine (BSA) à 5 % dans une solution bloquante pbs (p/v) et couvrir les échafaudages. Laisser à température ambiante pendant 1 heure.
    Remarque : toutes les quantités de solution requises dépendent du nombre d’échafaudages à souillés. Préparer les solutions au besoin en gardant les concentrations indiquées.
  5. Préparer et appliquer la solution de coloration des anticorps primaires .
    1. Diluer l’anticorps anti-von Willebrand factor (vWF) de lapin 1:150 et l’anticorps anti-SMA de souris 1:50 dans une solution de blocage fraîche.
      REMARQUE: D’autres marqueurs de cellules endothéliales, tels que CD31 ou VE-Cadhérine peuvent être utilisés.
    2. Couvrir les échafaudages avec la solution d’anticorps primaires et maintenir à 4 °C pendant la nuit. Laver en PBS trois fois, 5 minutes par lavage.
  6. Préparer et appliquer la solution de coloration des anticorps secondaires.
    1. Diluer l’anticorps anti-souris Cy3 1:150 et l’anti-lapin de chèvre Alexa-Fluor 488 1:400 dans pbs.
    2. Couvrir les échafaudages avec la solution d’anticorps secondaires et incuber pendant au moins 3 heures à température ambiante, ou à 4 °C pendant la nuit. Laver 3 fois en PBS, 5 minutes par lavage. Gardez l’échafaudage taché dans 0,3% PFA dans PBS (v / v) jusqu’à un mois.

6. Imagerie confocale de l’échafaudage et analyse du développement des navires

REMARQUE: Les étapes suivantes peuvent être effectuées sur les échafaudages fixes et colorés au point de temps final choisi ou, si des cellules fluorescentes ont été utilisées, pendant la période de culture cellulaire sans qu’il soit nécessaire de mettre fin à l’expérience. Pour ce dernier, il est recommandé de définir des points de temps spécifiques; ce travail montre le jour 0 (avant l’ensemencement des SC) et les jours 1, 3, 5 et 7 après l’ensemencement des SC (figure 3A).

  1. Imaginez les échafaudages à l’aide d’un microscope confocal avec un objectif 5X et un zoom de 0,5 et la gamme z complète de l’échafaudage. Cela permettra de capturer 9 compartiments distincts pour les géométries carrées et circulaires, ou 8 compartiments complets pour la géométrie hexagonale. Imagez le signal fluorescent et la lumière transmise, pour obtenir à la fois la structure du réseau du navire et la géométrie du compartiment(Figure 3A).
  2. À l’aide d’ImageJ (ou de tout autre logiciel de traitement d’image), recadrez chaque compartiment individuel; pour ce processus, seuls les marqueurs des réseaux vasculaires sont pertinents. Retirer tout navire qui n’est pas situé à l’intérieur de la zone du compartiment. Créez une projection d’intensité maximale et enregistrez chaque compartiment recadré individuel en tant qu’image TIFF.
    1. Dans ImageJ, appuyez sur Fichier > Ouvrir et sélectionnez l’image TIFF souhaitée contenant plusieurs compartiments. L’image doit avoir au moins deux canaux, le réseau de récipients fluorescents et l’image de la lumière transmise.
    2. Dans la barre d’outils, sélectionnez l’outil de sélection polygone. Sélectionnez le canal lumineux transmis. Cliquez sur l’un des coins du compartiment hexagonal, à l’interface entre la zone du compartiment et le mur de l’échafaudage, cela lancera la définition du masque. Continuez à cliquer sur les coins suivants dans un ordre séquentiel jusqu’à ce que le coin initial soit sélectionné, en fermant le masque.
      REMARQUE : cette explication s’applique à un compartiment hexagonal. Lorsque le compartiment est carré ou circulaire, utilisez les outils Rectangle ou Ovale, respectivement, pour créer un masque approprié. Quelle que soit la forme, ajustez toujours le masque pour suivre la paroi intérieure de l’échafaudage.
    3. Cliquez sur Analyser les outils > > gestionnaire de retour sur investissement. Dans le gestionnaire de roi (ROI, région d’intérêt), cliquez sur le bouton Ajouter pour enregistrer le masque créé. Le nouveau masque apparaîtra dans la liste de gauche. Cette étape permet à l’analyse d’être cohérente entre les différentes images.
      REMARQUE: Dans le gestionnaire de roi, il est possible d’enregistrer un fichier avec tous les masques créés en cliquant sur Plus > Enregistrer. Dans la fenêtre Enregistrer la sélection, choisissez un nom et un emplacement, puis enregistrez le fichier .roi. Pour récupérer le masque, dans le gestionnaire de roi, cliquez sur Plus > Ouvrir et choisissez le fichier .roi souhaité.
    4. Sélectionnez l’image réseau du récipient fluorescent et cliquez sur Modifier > Effacer à l’extérieur. Seule l’image contenue dans le masque restera, tandis que le reste sera éliminé.
    5. Une fois l’image réseau effacée ouverte, cliquez sur Image > Dupliquer. Dans la fenêtre contextuelle Dupliquer, écrivez le nom de l’image. Si l’option Dupliquer l’hyperpis pile est sélectionnée, désélectionnez-la et cliquez sur OK. Une nouvelle image contenant uniquement les réseaux de récipients fluorescents recadrés sera créée.
    6. Enregistrez l’image recadrée en cliquant sur Fichier > Enregistrer sous > Tiff. Choisissez le nom et le répertoire, puis cliquez sur OK.
  3. Analyser le développement vasculaire sur les images recadrées.
    1. Téléchargez et installez le logiciel libre analytique AngioTool, qui fournit des outils quantitatifs pour quantifier une variété de paramètres vasculaires. Le logiciel peut être obtenu à l’adresse suivante https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home.
    2. Définissez la valeur d’échelle des images pour obtenir les résultats en unités millimétriques et charger une image.
      1. Cliquez sur l’onglet Paramètres et remplissez la distance en pixels et la distance en mm avec des valeurs représentatives des images prises. En utilisant les paramètres d’imagerie mentionnés ci-dessus, les valeurs à remplir sont de 400 pixels par 1 mm.
      2. Appuyez sur le bouton Ouvrir l’image et recherchez l’image qui vous intéresse.
    3. Choisissez les paramètres d’analyse pour quantifier le développement du navire dans l’onglet Analyse.
      1. Sous le champ Diamètre et intensité du navire, désélectionnez tout marqueur présent dans le sélecteur de plage supérieure et activez le marqueur représentant le nombre 3.
      2. Sous le champ Diamètre et intensité du navire, sur le sélecteur de plage inférieure, déplacez le marqueur de plage inférieure à 60 et laissez le fabricant de rangers haut à 255.
      3. Activez la zone Supprimer les petites particules et définissez le marqueur sur 100.
      4. Sous le champ Préférences d’enregistrement, sélectionnez le nom et l’emplacement du fichier de feuille de calcul dans lequel les résultats seront enregistrés et appuyez sur le bouton Exécuter l’analyse. Si la case Enregistrer l’image du résultat est sélectionnée, Angiotool génère et enregistre une nouvelle image jpeg montrant les paramètres quantifiés du réseau de vaisseaux.
        REMARQUE : pour chaque analyse effectuée sans modifier le nom du fichier de feuille de calcul, une nouvelle ligne sera ajoutée au bas du fichier, avec les résultats nouvellement acquis.
  4. Organisez les données et exécutez une analyse statistique.
    1. Pour toutes les images traitées, choisissez le paramètre d’intérêt de la feuille de calcul (par exemple, longueur totale du navire et surface du navire)et entrez-les dans un logiciel d’analyse statistique pour étudier correctement les résultats obtenus(Figure 3C).

7. Imagerie en accéléré pour la détection de l’origine de la germination et le suivi de la migration

  1. Alternativement, à la culture des échafaudages dans l’incubateur comme décrit à l’étape 4.6, régler une chambre de culture au microscope confocal à 37 °C, 5% deCO2 et 100% d’humidité.
    1. Placez la plaque contenant les échafaudages entièrement ensemencés dans la chambre du microscope confocal et réglez les paramètres d’imagerie sur les valeurs souhaitées.
    2. Définissez l’intervalle de prise d’image sur 30 minutes et le temps total d’imagerie de 72 heures. Cela permettra d’exécuter complètement le laps de temps sans avoir besoin d’un changement moyen.
      ATTENTION: Dans le cas où une imagerie plus longue est souhaitée, un étalonnage de position minutieux doit être effectué pour pouvoir récupérer l’emplacement d’imagerie d’origine, car les changements de milieu nécessitent le retrait de la plaque de l’incubateur confocal et dans la hotte biologique stérile.
      NOTA : Le détachement des CE des parois de l’échafaudage et la formation des structures tubulaires commencera dans l’heure qui suit l’ensemencement des SC (étape 4) et peut prendre jusqu’à 50 heures. Après la formation initiale du tube, de nouveaux germes commenceront à migrer dans le compartiment à partir des vaisseaux environnants. La germination et le remodelage ultérieur du réseau se poursuivront tout au long de l’expérience environ jusqu’au jour 10, lorsque les réseaux de vaisseaux deviendrontstables 22. Utilisez ces informations pour choisir le point de départ du laps de temps et l’intervalle de temps en conséquence.
  2. Enregistrez le fichier vidéo time lapse complet en tant que séquence TIFF.
  3. Ouvrez ImageJ et cliquez sur Fichier > Importer > séquence d’images et sélectionnez vos fichiers. Cela ouvrira votre séquence TIFF en tant que film.
  4. Ouvrez le plugin de suivi manuel en cliquant sur Plugins > suivi manuel. Cela ouvrira la fenêtre de suivi.
  5. Observez le film et sélectionnez le navire à suivre. Faites attention à son origine et à sa migration.
  6. Activez la zone Afficher les paramètres et entrez les 30 minutes pour Intervalle de temps. L’étalonnage x/y dépend de la quantité de pixels sélectionnée lors de l’imagerie.
  7. Suivez manuellement les vaisseaux de germination à partir du contour de l’échafaudage.
    1. Appuyez sur le bouton Ajouter une piste. Sur la première image du film, appuyez sur l’emplacement du navire à suivre. Après cela, le film passera automatiquement à l’image suivante.
    2. Cliquez sur l’image du deuxième cadre où se trouve le navire. Encore une fois, le film passera automatiquement à l’image suivante.
    3. Procéder avec le même navire jusqu’à ce que le suivi complet de la migration soit terminé.
    4. Dans la fenêtre Suivi, cliquez sur les points et lignes superposés pour imprimer un chemin visuel de la migration du navire sur le film. Cela ouvrira une copie du film avec un point représentant la position actuelle du tracker et une ligne montrant le chemin précédent.
    5. Cliquez sur le bouton Terminer la piste pour finaliser l’enregistrement du mouvement actuel du navire.
    6. Cliquez à nouveau sur le bouton Ajouter une piste pour recommencer avec un nouveau navire. Ce faisant, les marqueurs de ligne et de point changeront automatiquement de couleur pour le nouveau navire. Répéter jusqu’à ce que tous les navires souhaités soient suivis.
      REMARQUE : L’emplacement x/y, la vitesse du navire et la distance déplacée peuvent être récupérés à partir de la fenêtre contextuelle Résultats. Chaque navire sera identifié par son numéro de voie dans la colonne la plus à gauche. Ces données peuvent être copiées et collées dans une feuille de calcul pour effectuer une analyse plus approfondie.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le protocole présenté, utilisant des techniques de stéréolithographie, permet la fabrication d’échafaudages pavés faits de photorésine SU-8. Des échafaudages avec des géométries de compartiment distinctes (carrés, hexagones et cercles) et des caractéristiques très précises et reproductibles ont été obtenus(Figure 1).

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La nécessité d’une vascularisation riche dans les tissus incorporés dans les tissus artificiels est essentielle pour la survie de la construction et la bonne fonction1. Bien que l’ingénierie du système vasculaire ait fait l’objet d’une grande quantité de recherches, il reste beaucoup à étudier et à comprendre24. En particulier, lors de la recréation d’un tissu spécifique, la microvasculature doit se comporter et s’organiser en conséquence12. L’approc...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été financée par le Partenariat Université du Michigan - Israël pour la recherche. Les auteurs tiennent à remercier Uri Merdler, Lior Debbi et Galia Ben David pour leur aide et leur soutien, Nadine Wang, Ph.D. et Pilar Herrera-Fierro, Ph.D. de l’installation de nanofabrication Lurie de l’Université du Michigan, ainsi que Luis Solorio, Ph.D. pour des discussions éclairantes sur les techniques de photolithographie.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Angiotool freewareNIH-CCRTéléchargement gratuit à https://ccrod.cancer.gov/confluence/display/ROB2/Home
Sérum d’albumine bovine ProbuminMillipore82-045-1
Cellules souches de pulpe dentaireLonzaPT-5025
Média ECM + kit de ballesSciencell#1001
Éthanol 96 %Gadot-Group64-17-5
Scellant à la fibrine EvicelJohnson& JohnsonEVB05ILFournit à la fois des solutions de thrombine et de fibrinogène (BAC2)
GlutaMAXGibco35050061
Chèvre anti-souris Anticorps Cy3Jackson115-166-072
Chèvre anti-lapin Alexa-Fluor 488Thermo- Fisher ScientificA11034
Cellules microvasculaires adipeuses humainesSciencell#7200
Humain fibronectineSigmaF0895-5MGConcentration en stock : 1 mg/mL
ImageJNIHTéléchargement gratuit sur https://imagej.nih.gov/ij/download.html
Alcool isopropyliqueGadot-Group67-63-0
Réactif de décollageKayaku Advanced Materials, IncG112850Nom commercial Omnicoat
Low-glucose DMEMBiological Industries01-050-1A
Anticorps anti-SMA de sourisDakoM0851
NEAAGibco11140068
Solution de paraformaldéhyde à 4 % dans PBSChemCruzSC-281692
Solution de pénicilline-streptomycine-nystatineBiological Industries03-032-1B
Solution saline tamponnée au phospate (PBS)SigmaP5368-10PAK
Anticorps anti-vWF de lapinAbcamab9378
Plaquette de siliciumSilicon Valley Microelectronics (SVM)Wafers 4", Type N-1-10, 500-550 microns d’épaisseur
SU-8 2050 photoresistKayaku Advanced Materials, IncY11058
SU-8 développeurKayaku Advanced Materials, IncY020100
Tryton-X 100BioLab LTDRéférence 57836

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Formation du r seau vasculairecellules endoth lialesmicroscopie confocalerev tement de fibronectinephotor sine SU 8maturation des vaisseauxcellules de soutien

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