Article de méthode

Isolement et différenciation des préadipocytes primaires blancs et bruns de souris nouveau-nées

DOI :

10.3791/62005

⸱

25 janvier 2021

 ,  , 
1Department of Molecular Medicine, The Scripps Research Institute, La Jolla, CA, USA, 2Department of Medicine, University of Wisconsin-Madison, School of Medicine and Public Health, Madison, WI, USA

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce rapport décrit un protocole pour l’isolement simultané des preadipocytes bruns et blancs primaires des souris nouveau-nées. Les cellules isolées peuvent être cultivées en culture et induites pour se différencier en adipocytes blancs et bruns complètement matures. La méthode permet la caractérisation génétique, moléculaire et fonctionnelle des cellules graisseuses primaires en culture.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La compréhension des mécanismes étant à la base de la différenciation et de la fonction d’adipocyte a grandement bénéficié de l’utilisation des variétés de cellule blanches immortalisées de preadipocyte. Ces lignées cellulaires cultivées, cependant, ont des limites. Ils ne capturent pas complètement le spectre fonctionnel diversifié des populations hétérogènes d’adipocytes qui sont maintenant connues pour exister dans les dépôts adipeux blancs. Pour fournir un modèle physiologiquement plus pertinent pour étudier la complexité du tissu adipeux blanc, un protocole a été développé et optimisé pour permettre l’isolement simultané des progéniteurs primaires d’adipocyte blancs et bruns des souris nouveau-nées, leur expansion rapide dans la culture, et leur différenciation in vitro en adipocytes mûrs et pleinement fonctionnels. Le principal avantage d’isoler les cellules primaires des souris nouveau-nées, plutôt que des souris adultes, est que les dépôts adipeux se développent activement et sont, par conséquent, une riche source de préadipocytes proliférants. Les préadipocytes primaires isolés à l’aide de ce protocole se différencient rapidement en atteignant la confluence et deviennent pleinement matures en 4-5 jours, une fenêtre temporelle qui reflète avec précision l’apparence des coussinets gras développés chez les souris nouveau-nées. Les cultures primaires préparées à l’aide de cette stratégie peuvent être étendues et étudiées avec une reproductibilité élevée, ce qui les rend adaptées aux écrans génétiques et phénotypiques et permet l’étude des phénotypes d’adipocytes autonomes cellulaires des modèles murins génétiques. Ce protocole offre une approche simple, rapide, et peu coûteuse pour étudier la complexité du tissu adipeux in vitro.

Introduction

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L’obésité résulte d’un déséquilibre chronique entre l’apport énergétique et la dépense énergétique. Au fur et à mesure que l’obésité se développe, les adipocytes blancs subissent une expansion massive de la taille des cellules qui entraîne une hypoxie dans le microenvironnement, la mort cellulaire, l’inflammation et la résistance à l’insuline1. Les adipocytes dysfonctionnels et hypertrophiés ne peuvent pas stocker correctement les lipides en excès, qui s’accumulent à la place dans d’autres tissus où ils amortissent l’action de l’insuline2,3. On prévoit que les agents qui améliorent la fonction d’adipocyte et restaurent la partition normale de lipide parmi les tissus pour être salutaires pour le traitement des conditions obésité-associées caractérisées par la résistance à l’insuline telles que le type - le diabète 2. Les écrans phénotypiques dans les adipocytes utilisant des lignées cellulaires immortalisées, telles que 3T3-L1, F442A et 10T 1/2, se sont avérés utiles pour identifier les facteurs génétiques qui régulent l’adipogenèse et pour isoler les molécules pro-adipogènes aux propriétés antidiabétiques4,5,6,7. Ces lignées cellulaires, cependant, ne reflètent pas entièrement l’hétérogénéité des types cellulaires présents dans les dépôts adipeux, qui comprend des sous-types d’adipocytes blancs, bruns, beiges et autres avec des caractéristiques uniques, qui contribuent tous à l’homéostasie systémique8,9,10. De plus, les lignées cellulaires cultivées montrent souvent une réponse diminuée aux stimuli externes.

En revanche, les cultures des adipocytes primaires récapitulent plus exactement la complexité de l’adipogenesis in vivo, et les adipocytes primaires montrent des réponses fonctionnelles robustes. Les préadipocytes primaires sont typiquement isolés de la fraction vasculaire stromale des dépôts adipeux de souris adultes11,12,13,14. Cependant, parce que les dépôts adipeux d’animaux adultes sont constitués principalement d’adipocytes pleinement matures qui ont un taux de renouvellement très lent15,16,17,cette approche donne une quantité limitée de préadipocytes avec un faible taux de prolifération. Par conséquent, l’isolement des préadipocytes de souris nouveau-nées est préférable pour obtenir de grandes quantités de cellules à croissance rapide qui peuvent être différenciées in vitro. Ici, un protocole a été décrit, inspiré par les travaux initiaux avec les adipocytes bruns primaires de Kahn et al.18 pour isoler efficacement les préadipocytes blancs et bruns qui peuvent être élargis et différenciés in vitro en adipocytes primaires pleinement fonctionnels(figure 1A). L’avantage d’isoler les cellules primaires du nouveau-né, par opposition aux souris adultes, est que les dépôts adipeux se développent rapidement et sont donc une riche source de préadipocytes qui prolifèrent activement17. Les cellules isolées à l’aide de ce protocole ont une capacité proliférative élevée, permettant une mise à l’échelle rapide des cultures. De plus, les préadipocytes des nouveau-nés présentent un potentiel de différenciation plus élevé que les progéniteurs adultes, ce qui réduit la variabilité d’un puits à l’autre de l’étendue de la différenciation et augmente ainsi la reproductibilité.

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Protocole

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Ce protocole suit toutes les directives de l’IACUC du Scripps Research Institute et de l’Université du Wisconsin - Madison School of Medicine and Public Health.

1. Collecte et digestion des dépôts adipeux (jour 1)

  1. Préparer deux tubes de 1,5 mL pour chaque petit : un pour le tissu adipeux brun (MTD) et un pour le tissu adipeux blanc (WAT). Ajouter 250 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) + 200 μL de tampon d’isolement 2x (NaCl 123 mM, KCl 5 mM, CaCl2 1,3mM, 5 mM de glucose, acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique (HEPES) 100 mM, pénicilline-streptomycine et albumine sérique bovine sans acide gras à 4 %) à chaque tube. Gardez les solutions stériles et sur la glace.
  2. Placez les petits dans de petites chambres (p. ex. un puits d’une plaque de 6 puits) et givrez-les jusqu’à ce qu’ils deviennent hypothermiques. Assurez-vous qu’il n’y a pas de contact direct entre les petits et la glace. Piquez une patte avec une pointe pour assurer la perte de conscience et euthanasier les chiots par décapitation à l’aide de ciseaux tranchants.
    REMARQUE: Si vous travaillez avec différents génotypes, préparez un tube supplémentaire pour recueillir une biopsie de la queue (coupe de 3 mm) pour le génotypage. Si le génotypage est effectué immédiatement, gardez les petits euthanasiés sur la glace jusqu’à la dissection pour recueillir les dépôts adipeux.
  3. Calculez et pesez la quantité de collagénase nécessaire pour digérer tous les dépôts. Ajouter 50 μL de collagénase de type I à 15 mg/mL dans un tampon d’isolement 2x à chaque tube. Ne pas ressusciter la collagénase dans le tampon d’isolement jusqu’à ce que tous les tissus aient été recueillis.
  4. Pour recueillir le WAT sous-cutané, coupez la peau autour de l’abdomen du chiot (évitez la rupture péritonéale) et tirez doucement la peau vers le bas sous les jambes. Sans prendre la peau, ramassez soigneusement le dépôt de graisse, qui apparaîtra comme un tissu clair (P1 ou plus jeune) ou blanc (P2 et plus ancien), mince et allongé attaché à l’intérieur ou au-dessus du quadriceps (Figure 1B). Rincer le dépôt de graisse dans du PBS et le placer dans l’un des tubes contenant 250 μL de PBS + 200 μL de tampon d’isolement 2x. Restez sur la glace.
    REMARQUE: Les souris P0 et P1 donnent le meilleur rendement. Chez les chiots P0-1, le dépôt de WAT sous-cutané est presque transparent. Chez les souris P2 et plus anciennes, le dépôt est plus facile à identifier car il devient déjà blanc, ce qui indique la présence d’adipocytes blancs complètement matures et chargés de lipides.
  5. Pour recueillir les MTD interscapulaires, tirez la peau des omoplates sur la tête. Soulevez la MTD - le tissu rouge profond entre les omoplates - et faites soigneusement des incisions tout autour d’elle pour la détacher du corps(Figure 1B). Vérifiez la cohérence et la couleur; rincer avec du PBS; le placer dans l’autre tube contenant 250 μL de PBS + 200 μL de tampon d’isolement 2x; et rester sur la glace.
    REMARQUE: Lors de la récolte de MTD de souris P2 et plus âgées, retirez soigneusement le tissu adipeux blanc entourant la MTD. Il se compose d’une fine feuille blanche et douce d’adipocytes située entre la peau et la MTD, qui est plus profonde entre les omoplates.
  6. Une fois que tous les dépôts ont été collectés, hachez doucement chaque dépôt (4 à 6 fois) à l’aide de petits ciseaux directement à l’intérieur des tubes.
  7. Ressusciter la collagénase de type I dans le volume approprié de tampon d’isolement 2x pour obtenir une solution mère 10x à 15 mg/mL. Ajouter 50 μL de collagénase 10x à chaque tube, en gardant les tubes sur la glace jusqu’à ce que la collagénase ait été ajoutée à tous les tubes.
  8. Inversez rapidement les tubes pour les mélanger et les transférer dans un mélangeur à température contrôlée. Incuber les échantillons pendant 30 min à 37 °C sur un agitateur (fréquence de 1 400 tr/min pour un mélange efficace des échantillons).

2. Placage des préadipocytes (jour 1)

  1. Après avoir digéré les tissus, replacez les tubes sur de la glace.
    REMARQUE: À partir de cette étape, tous les travaux sont effectués dans des conditions stériles dans une armoire de biosécurité.
  2. Filtrer les tissus digérés à travers une passoire cellulaire de 100 μm dans de nouveaux tubes de 50 mL. Si vous travaillez uniquement avec des souris WT, ou si des génotypes sont connus, regroupez les BATs pertinents et dissociés; répétez ceci pour les WATs. Pour maximiser le rendement cellulaire, rincez chaque tube avec 1 mL de milieu d’isolement (milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) + 20 % de sérum fœtal bovin (FBS), 10 mM hepes, 1 % pénicilline-streptomycine), et filtrez-le à travers la passoire cellulaire. Si vous travaillez avec des génotypes inconnus, passez à l’étape 2.4
    REMARQUE: FBS est un déterminant essentiel de la prolifération et de la différenciation des préadipocytes. Testez rigoureusement différents lots de FBS pour assurer des performances élevées et une cohérence entre les lots.
  3. Diluer les suspensions bat et wat à plaquer 2-3 puits d’une plaque de 6 puits pour chaque échantillon de MTD et 4-6 puits d’une plaque de 6 puits pour chaque échantillon WAT. Par exemple, si 6 BAT et 6 WATs ont été mis en commun ensemble, diluer la suspension de la cellule BAT jusqu’à 24-36 mL et la suspension de cellule WAT jusqu’à 48-72 mL. Plaque 2 mL des suspensions cellulaires par puits.
  4. Pour les échantillons dont le génotype est inconnu, garder chaque échantillon séparé; placer une passoire cellulaire de 100 μm au-dessus de chaque puits d’une plaque de 6 puits et filtrer un échantillon par puits. Rincez le tube avec 1,5 mL de milieu d’isolement et passez-le à travers la passoire, constituant le volume final à 2 mL par puits. Jetez la passoire de la cellule, placez le couvercle sur la plaque et transférez la plaque dans l’incubateur.
    REMARQUE: Le milieu dans les puits devrait sembler trouble en raison des cellules sanguines flottantes, des débris cellulaires et des lipides des cellules lysées.
  5. 1-1,5 h après placage, aspirer les milieux et laver avec 2 mL de DMEM sans sérum. Agiter doucement la plaque pour détacher les cellules sanguines du fond des puits. Après 3 lavages, ajouter 2 mL de milieu d’isolement frais et transférer les cellules dans l’incubateur (37 °C, 5 % deCO2).
    REMARQUE: Vérifiez les cellules sous le microscope. Le matériel flottant (cellules sanguines, débris cellulaires) doit être minimal. Les préadipocytes bruns apparaîtront sous forme de petites cellules non translucides, tandis que les préadipocytes blancs présenteront une forme plus allongée. Les préadipocytes bruns et blancs doivent être étroitement attachés à la plaque.

3. Expansion de la culture préadipocytaire (du 2e au 5e jour)

  1. Le lendemain, aspirez le milieu, lavez les cellules avec 2 mL de DMEM sans sérum et rajoutez 2 mL du milieu d’isolement.
  2. Répétez l’étape 3.1 une fois tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80-90% de confluence.
    REMARQUE: Pour les préadipocytes bruns primaires, atteindre 80-90% de confluence peut prendre 4-5 jours. Pour les préadipocytes blancs primaires, cela prend généralement 2-3 jours. Une fois que les préadipocytes atteignent 60% de confluence, ils peuvent être efficacement infectés par des particules virales pour des expériences de knockdown ou de surexpression. Infecter les préadipocytes avec une charge virale appropriée jusqu’à 8 h. L’utilisation de polymères cationiques pour augmenter l’efficacité de l’infection est déconseillée, car elle entraîne souvent une toxicité et une réduction significative du potentiel adipogène des préadipocytes infectés.
  3. Pour diviser les cellules, enrobez les nouvelles plaques de destination à l’aide d’une solution stérile de 0,1% p / v de gélatine (dissoute dans de l’eau distillée; n’utilisez pas de chaleur). Utilisez suffisamment de volume pour couvrir le fond du puits / plat. Incuber les plaques à 37 °C jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être ensemencées (au moins 10 min).
    Remarque : Cette étape est facultative. Le revêtement des plaques de culture cellulaire n’affecte pas le potentiel de rendement ou de différenciation, mais il simplifie considérablement le maintien et la manipulation des adipocytes différenciants.
  4. Lorsque les cellules atteignent une densité sub-confluente (85-95%), aspirez le milieu, lavez avec du PBS et ajoutez de la trypsine pendant 3 min pour détacher les cellules. Bloquez l’activité de la trypsine en ajoutant un volume de trypsine 2,5x du milieu d’isolement. Pipettez la suspension cellulaire de haut en bas pour maximiser la récupération de la cellule et transférez-la dans un nouveau tube. Lavez les puits avec 1 mL de milieu d’isolement et ajoutez-le à la première collection.
  5. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 800-1200 × g,aspirer le surnageant et ressusciter les cellules dans 3-5 mL du milieu d’isolement. Comptez les cellules et diluez-les à la densité finale souhaitée.
    REMARQUE: Par exemple, 50,000-80,000 cellules/ mL (2.5, 1, et 0.5 mL pour les plaques de 6, 12 et 24-well, respectivement) se traduiront par des puits entièrement confluents dans les 72-96 h.
  6. Aspirer la solution de revêtement à l’étape 3.3 et laver l’excès de gélatine avec du PBS. Ensemencez les cellules et retournez les plaques à l’incubateur jusqu’à ce qu’elles soient complètement confluentes.

4. Différenciation des préadipocytes blancs et bruns (jours 7 - 12)

  1. Lorsque les préadipocytes deviennent confluents, aspirez le milieu et remplacez-le par un milieu de différenciation composé de 10% de FBS dans du DMEM contenant 170 nM d’insuline, 1 μM dexaméthasone et 0,5 mM de 3-isobuthyl-1-méthylxantine. Si vous différeciez les préadipocytes bat, ajoutez également 1 nM triiodothyronine (T3). Marquez le jour où la différenciation adipogène est induite comme jour 0 de différenciation.
    REMARQUE: Les préadipocytes blancs et bruns peuvent se différencier spontanément en atteignant la confluence. Cependant, pour maximiser la différenciation des adipocytes, le cocktail pro-adipogène traditionnel décrit ci-dessus (plus T3 pour les préadipocytes BAT) doit être utilisé.
  2. Après 48 h (jour 2 de différenciation), rafraîchir le milieu avec le milieu d’entretien se composant de 10% FBS dans DMEM et de 170 nM insuline (plus 1 nM T3 pour bat).
    REMARQUE: Le jour 2, de petites gouttelettes lipidiques s’accumulant dans les cellules au microscope peuvent être observées à l’aide d’un champ lumineux standard.
  3. Répétez l’étape 4.2 une fois tous les 2 jours jusqu’à ce que les cellules soient utilisées pour des expériences.
    REMARQUE: Le jour 4 ou 5 de différenciation, la majorité des cellules apparaîtront chargées de lipides. Les adipocytes différenciants en phase terminale peuvent être conservés en culture plus longtemps ou utilisés à ce stade pour des expériences.

5. Re-placage pour les expériences de bioénergétique

REMARQUE: Si l’intention est d’effectuer des études bioénergétiques dans des adipocytes matures dans le format 96-well, les étapes suivantes doivent être prises. Idéalement, les cellules qui viennent de se différencier complètement (jour 4 ou 5) devraient être utilisées. La procédure décrite ci-dessous commence à partir de 1 puits d’une plaque de 6 puits.

  1. Avant la digestion à la trypsine, préparez le revêtement pour les plaques de 96 puits. Ajouter 50 μL de gélatine à 0,1 % à chaque puits. Laissez la plaque dans un incubateur de culture tissulaire jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à être ensemencées.
  2. Au jour 4 ou 5 de différenciation, aspirer le milieu, laver avec 1 mL de PBS et ajouter 300 μL d’acide tétraacétique trypsine-éthylènediamine à 0,25 % (pour 1 puits d’une plaque à 6 puits). Inclinez doucement la plaque pour vous assurer que la trypsine recouvre complètement le fond du puits; incuber pendant 2 min à température ambiante. Bloquez l’action de la trypsine avec 700 μL de milieu d’entretien, pipettez de haut en bas pour maximiser la récupération cellulaire et transférez la suspension cellulaire dans un nouveau tube de 1,5 mL.
  3. Centrifuger les cellules à 1200 × g pendant 5 min. Retirez le surnageant, ressuscitez la pastille dans 1 mL de milieu d’entretien et comptez les cellules.
    REMARQUE: Un puits d’une plaque de 6 puits devrait donner environ 1,5-1,8 million de cellules.
  4. Diluer les cellules pour avoir une concentration finale de 60 000 à 80 000 cellules/mL pour les adipocytes bruns et de 100 000 à 120 000 cellules/mL pour les adipocytes blancs. Plaque 100 μL de la suspension cellulaire par puits dans des plaques de 96 puits recouvertes de gélatine.
    REMARQUE: Un puits d’une plaque de 6 puits fournit suffisamment de cellules pour jusqu’à deux plaques de 96 puits. Pour les expériences de bioénergétique, un placage à faible densité (confluence de 30 à 40 %) est nécessaire pour permettre la mesure précise de la consommation d’oxygène et éviter l’épuisement de l’oxygène dans les puits pendant l’essai.
  5. Laisser les cellules adhérer au fond de la plaque pendant au moins 48 h. Si les cellules sont conservées dans la plaque pendant plus de 48 h, rafraîchissez le milieu après 2 jours.
  6. Le jour du test, aspirez le milieu et remplacez-le par un milieu d’essai. Incuber pendant 1 h à 37 °C dans un incubateur non contrôlé par le CO2et effectuer le dosage conformément aux instructions du fabricant.

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Résultats

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La section 1 du protocole donnera une suspension hétérogène de cellules visibles sous un microscope optique standard. Le filtrage des tissus digérés à l’avec une passoire cellulaire (section 2) éliminera les tissus non digérés. Cependant, certains débris cellulaires, cellules sanguines et adipocytes matures passeront à travers (Figure 1C). Des lavages doux 1 h après le placage élimineront les cellules non pertinentes, car les préadipocytes se fixent rapidemen...

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Discussion

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Le tissu adipeux est essentiel pour la sensibilité systémique à l’insuline et l’homéostasie du glucose20. Le dysfonctionnement lié à l’obésité d’adipocyte est étroitement associé à l’apparition du diabète de type 2. Par conséquent, une plus grande compréhension de la biologie et de la physiologie de base du tissu adipeux peut permettre la conception de nouveaux traitements pour des désordres métaboliques. En complément de l’analyse fonctionnelle et transcriptionnelle directe des adipocytes matures...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs sont reconnaissants à Cristina Godio du Centro Nacional de Biotecnología de Madrid, en Espagne, à Mari Gantner de l’Institut de recherche Scripps, La Jolla, et à Anastasia Kralli de l’Université Johns Hopkins de Baltimore pour leur aide à optimiser ce protocole sur la base des travaux initiaux de Kahn et al.18. Ce travail a été financé par les subventions DK114785 et DK121196 des NIH à E.S.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3-Isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX)Sigma-AldrichI7018
Plaques à 6 puitsCorning353046
AdipoRed (Rouge du Nil)LonzaPT-7009
Antimycine ASigma-AldrichA8674
BenchMark Fetal Bovin SerumGemini Bioproducts LLC100-106
CaCl2Sigma-AldrichC4901
Passoire à cellulesFisher Scientific22363549
Collagénase, type 1  ;   ;Worthington Biochemical CorpLS004196
ddH2OSigma-Aldrich6442
DexaméthasoneSigma-AldrichD4902
DMEMSigma-AldrichD5030Pour les études bioénergétiques
DMEM, High Glucose, GlutamaxGibco10569010
DPBS, sans calcium, sans magnésiumGibco14190144
sans acides gras BSASigma-AldrichA8806
FCCPSigma-AldrichC2920
GélatineSigma-AldrichG1890
GlucoseSigma-AldrichG7021
HEPESSigma-AldrichH3375
Hoechst 33342InvitrogenH1399
InsulineSigma-AldrichI6634
KClSigma-AldrichP9333
NaClSigma-AldrichS7653
NorepinephrineCayman Chemical16673
OligomycineSigma-Aldrich75351
Pen/StrepGibco15140122
RosiglitazoneSigma-AldrichR2408
RotenoneSigma-Aldrich557368
Seahorse XFe96 FluxPakAgilent Technologies102416-100Pour les études bioénergétiques
Pince chirurgicaleROBOZ Surgical Instrument CoRS-5158
Ciseaux chirurgicauxROBOZ Surgical Instrument CoRS-5880
ThermoMixerEppendorfT1317
triiodothyronine (T3)Sigma-Aldrich642511

Références

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