Une technique originale pour la reconstruction de circuit de sang dans un modèle abdominal heterotopic de transplantation de coeur de souris est démontrée.
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Article de méthode
Reconstruction de circuit sanguin dans un modèle de transplantation de cœur de souris abdominale
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La technique chirurgicale de transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez la souris est un modèle standard pour la recherche en immunologie de transplantation. Ici, la technique établie pour une reconstruction modifiée de circuit de sang dans un modèle abdominal heterotopic de transplantation de coeur est présentée. Cette méthode utilise la veine cave inférieure intrathoracique (IIVC) au lieu de l’artère pulmonaire du cœur donneur pour l’anastomose à la veine cave inférieure du receveur. Il facilite et améliore les taux de réussite de la transplantation cardiaque abdominale chez la souris.
Introduction
La technique chirurgicale de transplantation cardiaque abdominale hétérotopique chez la souris représente un modèle standard pour la recherche en immunologie de transplantation1,2,3. Cependant, il est très difficile à réaliser et cela implique une restriction à l’utilisation généralisée de ce modèle4,5.
Dans la transplantation cardiaque traditionnelle de souris (THTx), l’aorte donneuse et l’aorte abdominale réceptrée sont anastomosées tandis que l’artère pulmonaire est anastomosée à la veine cave inférieure réceptible6,7,8.
Dans cette technique modifiée de transplantation cardiaque de souris, l’aorte donneuse est anastomosée à l’aorte abdominale récepteur et le donneur IIVC est anastomosé à la veine cave inférieure récepteur(3,4,6) (figure 2 et figure 3).
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Protocole
Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux lignes directrices de la directive 2010/63/UE du Parlement européen sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques (approbation du comité éthique, #G1071/09).
NOTE: La préparation préliminaire, l’anesthésie, les soins postopératoires et le travail de surveillance sont les mêmes que ceux effectués dans les méthodes chirurgicales traditionnelles1,2,4. Les souris BALB/c ont servi de donneurs de coeur et C57BL/6J comme destinataires de greffe. Les souris ont été âgées de 8 à 12 semaines, pesaient environ 30 g à la transplantation et étaient logées dans des conditions standard.
1. Étapes préparatoires
- Pour l’anesthésie, donnez à la souris de l’isoflurane inhalatif (2%) jusqu’à ce qu’ils s’endorment, suivis d’injections intrapéritonéales de kétamine (100 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg) + acepromazine (2 mg/kg). Pour l’analgésie postopératoire, appliquer metamizol (200 mg/kg) p.o. et carprofène (5 mg/kg) s.c..
REMARQUE: L’application d’antibiotiques a été abstenue exprès car ces substances peuvent influencer les réponses immunologiques. - Pour la chirurgie, utilisez un ensemble d’instruments microscopiques comprenant un micro-ciseaux, une micro-pince, un porte-aiguille et des pinces micro hémostatiques. Un stylo électrochirurgical est également nécessaire. Effectuez des sutures en utilisant des types de nylon 7/0er, 10/0er et 4/0er.
- Placez la souris dans une boîte pour l’inhalation d’isoflurane (2%) pendant 40-60 secondes. Déterminez la profondeur de l’anesthésie en serrant la patte avec une pince à épiler. S’il y a une absence totale de réponse à ce stimulus, passez à l’étape suivante.
- Une fois que la souris s’est endormie, pesez la souris.
- Appliquer une injection intrapéritonéale de kétamine (100 mg/kg) + xylazine (10 mg/kg) + acepromazine (2 mg/kg) sur la souris anesthésiée.
- Coupez la fourrure abdominale et placez la souris sur la table d’opération. Effectuez une désinfection à l’aide d’iodure de povidone pendant 3 fois, puis drapez correctement la souris à l’aide d’une serviette chirurgicale fenêtrée.
2. Procédure d’opération du donateur
- Utilisez des ciseaux pour couper la peau du cou au bas-ventre et décollez toute la couche de la peau jusqu’à la ligne médiane des deux aisselles.
- Utilisez des ciseaux pour couper les muscles de la paroi abdominale et déplacez doucement les viscères vers la gauche (du point de vue de l’opérateur). Enveloppez les viscères avec une gaze imbibée saline pour exposer en toute sécurité la veine cave inférieure.
- Utilisez une seringue de 1 mL pour injecter 0,4 mL de la solution d’héparine (contient 500 U d’héparine) lentement dans la veine cave inférieure et attendez 1 minute avant de retirer l’aiguille.
- Retirez l’aiguille et utilisez un micro-ciseaux pour couper à la fois la veine cave inférieure et l’aorte abdominale pour accélérer l’exsanguination.
- Utilisez des ciseaux pour ouvrir la cavité thoracique en effectuant une coupe en forme de U; exposer complètement le cœur, les poumons et tous les vaisseaux sanguins de la poitrine.
- Exposez l’aorte thoracique, coupez 1/2 de la lumière, puis coupez la veine pulmonaire pour faciliter l’irrigation et le drainage.
- Insérez un tube d’irrigation dans l’ouverture de l’aorte thoracique, injectez au moins 2 mL de solution de cardioplégie froide d’histidine-tryptophane-cétoglutarate à 4 °C (solution de Custodiol HTK)9 jusqu’à ce que l’écoulement de la veine pulmonaire soit complètement clair et que le cœur cesse complètement de battre.
- Retirez le tube d’irrigation et détachez le sternum.
- Utilisez des micro-ciseaux pour enlever le thymus et pour enlever légèrement la graisse autour de l’arc aortique.
- Utilisez une pince droite et incurvée pour exposer et ligater le tronc de l’arteria pulmonalis (sur le côté droit de l’arc aortique) avec une suture 10/0.
- Utilisez des micro pinces pour séparer la graisse et le tissu conjonctif attachés à l’IIVC, exposez et ligatez la veine cave supérieure (sur le côté gauche de l’arc aortique) avec une suture 7/0 et utilisez des micro-ciseaux pour la couper derrière la ligature.
- Faites une suture 7/0 autour de la base du cœur sous l’arc aortique, l’IIVC et les deux oreillettes. Ensuite, légiféez les branches de l’artère pulmonaire et les vaisseaux pulmonaires veineux.
- Utilisez des micro-ciseaux pour transecter l’arc aortique aussi distal que possible, les vaisseaux pulmonaires sous la ligature et l’IIVC près du diaphragme. Retirez le cœur de la poitrine.
- Placer le cœur du donneur explanté dans une solution de cardioplégie HTK froide à 4 °C et conserver temporairement.
3. Procédure d’exploitation du bénéficiaire
REMARQUE: Les étapes initiales de l’opération sont similaires à celles précédemment montrées pour la souris donneuse, y compris l’anesthésie et la désinfection.
- Effectuez la coupe de la peau abdominale de manière transversale, couvrez les organes abdominaux avec une gaze humide à l’aide d’une solution saline.
- Utilisez la micro-pince pour exposer la veine cave inférieure et l’aorte abdominale et les libérer du tissu adipeux environnant.
- Utilisez des micro pinces pour ligater ou électrocautériser les vaisseaux de branche latérale (latéraux ou sous la veine/ aorte) sous les vaisseaux rénaux.
- Utilisez une pince applicatrice de clips pour positionner deux pinces micro hémostatiques au niveau de la partie abdominale de la veine / aorte provenant de la droite, laissant une distance de plus de 1 cm pour l’aorte / veine afin d’assurer un espace pour la construction de l’anastomose entre elles.
- Utilisez des micro-ciseaux pour faire une incision dans l’aorte un peu plus près de la pince inférieure que de la pince supérieure. Vous pouvez également utiliser une aiguille de 30 G pour faire un petit trou et l’ouvrir avec des micro-ciseaux.
- Positionnez la souris récepteur de sorte que l’aorte soit face à l’opérateur avec la veine cave de l’autre côté. Ensuite, placez le cœur dans la cavité abdominale et couvrez-le d’un petit tampon de gaze humide.
- Utilisez une suture 10/0 pour adapter et coudre l’aorte donneuse à l’aorte réceptive en commençant caudalement, faites un nœud et procédez à une suture courante au sommet de l’incision (environ 4-5 points). Ensuite, retournez le cœur vers la droite (du point de vue du sujet), couvrez-le à nouveau et continuez la suture sur le côté gauche jusqu’à atteindre l’extrémité caudale et nouez-la.
- Utilisez un tube d’irrigation pour injecter au moins 0,5 mL de solution de cardioplégie HTK à 4 °C pour rincer l’IIVC du donneur.
- Utilisez des micro-ciseaux pour couper un trou rond sur la veine cave inférieure abdominale du receveur, qui devrait avoir la même taille que la lumière IIVC des donneurs. L’incision doit être située au-dessus de l’ouverture anastomotique aortique. Rendre l’incision veineuse plus grande que l’incision aortique.
- Utilisez une suture 10/0 pour coudre le donneur IIVC à la veine cave récepteur commençant caudalement. Attachez un nœud et effectuez une suture courante jusqu’à ce que le sommet de l’incision soit atteint. Utilisez cinq points de suture et continuez la suture sur la gauche. Enfin, attachez un nœud dans le coin de la queue et serrez soigneusement (veillez à ne pas tirer trop serré).
- Placez les petites parties de l’éponge hémostatique autour de la veine et des anastomoses aortiques.
- Utilisez une pince d’applicateur de clip pour enlever d’abord les pinces micro-hémostatiques inférieures, puis supérieures et rincez la cavité abdominale avec du chlorure de sodium à 0,9 % tempéré à 38,0 °C.
- Utilisez une micro pince pour enlever l’éponge hémostatique.
- Observez le rythme cardiaque du cœur transplanté.
- Utilisez une pince pour remettre les intestins dans la cavité abdominale et des sutures à deux couches (muscles abdominaux suivis de peau) pour fermer la plaie abdominale avec une suture 4/0.
- Mettez les souris dans une chambre de poste de travail de contrôle de l’oxygène et de la température (par exemple, INVIVO2-400) pour fournir un environnement chaud et riche en oxygène pour que les souris transplantées récupèrent, attendez que les souris se réveillent.
- Pour l’analgésie postopératoire, donnez directement metamizol 200 mg/kg par os après opération. Quatre et 16 heures après l’opération donner Metamizol 200 mg/kg par os+ Carprofène (5mg/kg) s.c. Dans le suivi ultérieur, donnez du carprofène (5 mg/kg) s.c aux souris transplantées toutes les 24 heures pendant trois jours consécutifs après l’opération.
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Résultats
Ici, une technique modifiée de transplantation abdominale heterotopic de coeur chez les souris qui a été précédemment développée dans notre laboratoire et s’est avérée utile pour les 16 dernières années est présentée. Précédemment, on l’a rapporté que dans l’ensemble 40 cas de veine cave à veine cave (groupe V-V) comparé à 40 cas de l’artère pulmonaire traditionnelle à la veine cave (groupe P-V) procédure d’anastomose4 (tableau 1)l’anastomose de navire a pris 20.8±1.3 min dans le ...
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Discussion
La technique chirurgicale de la transplantation abdominale hétérotopique de coeur chez la souris est très provocante et ceci implique une restriction à l’utilisation répandue de ce modèle.
L’un des inconvénients de la technique conventionnelle est la longueur limite de l’artère pulmonaire (PA) du donneur. Il est généralement d’environ 2 mm de longueur, alors que la longueur de l’IIVC du cœur donneur utilisé dans notre modèle est généralement d’environ 1 cm(Figure 2).
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Remerciements
Nous remercions la Dre Yun Xu pour son aide en tant qu’actrice de doublage, la Dre med Jianhua Peng pour son aide au montage vidéo et la Dre Annika Kuckhahn pour ses commentaires et son soutien. Ce travail a été soutenu en partie par la Fondation allemande pour la recherche (DFG) pour promouvoir les collaborations internationales (HO2581/4-1 à AH), et la Fondation nationale de la science de Chine (NSFC; #81760291 à FJ).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Aiguilles 30G | Braun | 456300 | |
| acépromazine | CP Pharma | Tranquisol P | |
| BALB/c AnNCrl souris | Charles River. Allemagne | pas de numéro de | |
| Bepanthen pommade oculaire | Haus-Apotheke | PZN 01578675 | |
| Bonn Micro Forceps | FST | 11083-07 | |
| Boîte pour dispositif d’isolation et d’alimentation en oxygène | RUSKINN | INVIV | |
| C57BL/6J ; souris | Charles River. Allemagne | pas de numéro | |
| Carprofen | Zoetis | Rimadyl 50 mg/ml | |
| CATHETER-FEP 26G | TERUMO | Surflo-W | |
| Clip Applicator Forceps Style | FST | 18057-14 | |
| Pince courbe | WPI | 14114-G | |
| custodiol/HTK | Dr. Franz Kö ; hler Chemie | no catalog numer | |
| Cutasept désinfection cutanée | VWR | BODL980365 | |
| stylo électrochirurgical | Bovie | CHANGE-A-TIP Compresses | |
| gaze, cotons-tiges | Lohmann-Rauscher | 13353 | |
| Tapis chauffant | THERMO MAT PRO 30W | HTP-30 | |
| Éponge hémostatique | CuraSpon | J1276A | |
| solution d’héparine | Haus-Apotheke | PZN 03029820 | |
| Glacière | PETZ | Non Numéro de catalogue disponible | |
| Dispositif d’anesthésie par inhalation | GROPPLER | BKGM 0616 | |
| Dispositif d’isolation et d’alimentation en oxygène | RUSKINN | INVIV | |
| isoflurane | CP Pharma | Isofluran CP 1 ml/ml | |
| de kétamine | Zoetis | no catalog numer | |
| metamizole | WDT | no catalog numer | |
| Micro ciseaux | FST | 15000-00,15000-10 | |
| Micro Serrefine ( Clamp ) Coudé / 16 mm | FST | 18055-06 | |
| Microscope | Leica | LEICAMZ6 | |
| Microscope light | SCHOTT | KL2500LED | |
| Saline solution (NaCl 0.9 %) | Haus-Apotheke | PZN 06178437 | |
| Ciseaux | Peha Instruments | 991083/4 | |
| petite boîte de Pétri | Sarstedt | 833900 | |
| Pince droite | WPI | 14113-G | |
| Ruban chirurgical | BSN | 4120 | |
| Pince à suture - 10 cm | FST | 18025-10 | |
| Sutures(10-0) | Medtronic | N2540 | |
| Sutures(4-0) | ETHILON | V4940H | |
| Sutures(7-0) | ETHILON | 1647H | |
| Seringue (0,3 mL) | 324826 | ||
| seringue (1 mL) | BD | 320801 | |
| xylazine | Bayer | Rompun |
Références
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- Habertheuer, A., et al. Donor tissue-specific exosome profiling enables noninvasive monitoring of acute rejection in mouse allogeneic heart transplantation. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 155 (6), 2479-2489 (2018).
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- Wu, K., et al. Novel technique for blood circuit reconstruction in mouse heart transplantation model. Microsurgery. 26, 594-598 (2006).
- Alamran, F. G., Shahkolahi, M. M. Total arterial anastomosis heterotopic heart transplantation model. Transplantation Proceedings. 45, 625-629 (2013).
- Melanie, L., et al. Potential of Heterotopic Cardiac Transplantation in Mice as a Model for Elucidating Mechanisms of Graft Rejection. Cardiac Transplantation. Moffatt-Bruce, S. D., et al. , IntechOpen (2012).
- Westhofen, S., et al. The heterotopic heart transplantation in mice as a small animal model to study mechanical unloading - Establishment of the procedure, perioperative management and postoperative scoring. PLoS One. 14 (4), 0214513(2019).
- Wang, C., Wang, Z., Allen, R., Bishop, G. A., Sharland, A. F. A Modified Method for Heterotopic Mouse Heart Transplantion. Journal of Visualized Experiments. (88), e51423(2014).
- Mokbel, M., et al. Histidine-Tryptophan-Ketoglutarate Solution for Donor Heart Preservation Is Safe for Transplantation. Annals of Thoracic Surgery. 109 (3), 763-770 (2020).
- Song, S., et al. Modified Suture Technique in a Mouse Heart Transplant Model. Asian Journal of Surgery. 34 (2), 86-91 (2011).
- Martins, P. N. Assessment of graft function in rodent models of heart transplantation. Microsurgery. 28 (7), 565-570 (2008).
- Wu, K., et al. cold storage using a new histidine-tryptophan-ketoglutarate-based preservation solution in isogeneic cardiac mouse grafts. European Heart Journal. 32 (4), 509-516 (2011).
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Réimpressions et autorisations
