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Article de méthode

Conjugaison chimique d’un anticorps purifié dirigé vers DEC-205 avec une protéine pleine longueur pour cibler les cellules dendritiques de souris in vitro et in vivo

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DOI :

10.3791/62018

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5 février 2021

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1Immune Regulation Group, Helmholtz Centre for Infection Research, 2Infection Immunology Group, Institute of Medical Microbiology, Infection Prevention and Control, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 3Institute for Molecular and Clinical Immunology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg, 4Cellular Proteome Research, Helmholtz Centre for Infection Research, 5Experimental Pneumology, University Hospital of Pneumology, Health Campus Immunology, Infectiology and Inflammation, Otto-von-Guericke University Magdeburg

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole pour la conjugaison chimique de l’antigène modèle ovalbumine à un anticorps spécifique au récepteur de l’endocytose pour le ciblage in vivo des cellules dendritiques. Le protocole comprend la purification de l’anticorps, la conjugaison chimique de l’antigène, ainsi que la purification du conjugué et la vérification de la conjugaison efficace.

Résumé

L’administration ciblée d’antigènes aux cellules dendritiques (DC) à présentation croisée in vivo induit efficacement des réponses aux cellules effectrices T et présente une approche précieuse dans la conception de vaccins. L’antigène est délivré à DC via des anticorps spécifiques aux récepteurs de l’endocytose tels que DEC-205 qui induisent l’absorption, le traitement et la présentation du CMH de classe I et II.

La conjugaison efficace et fiable de l’antigène souhaité à un anticorps approprié est une étape critique dans le ciblage DC et, entre autres facteurs, dépend du format de l’antigène. La conjugaison chimique de protéines pleine longueur en anticorps purifiés est une stratégie possible. Dans le passé, nous avons réussi à établir une réticulation de l’antigène modèle ovalbumine (OVA) et d’un anticorps IgG2a spécifique dec-205 (αDEC-205) pour des études in vivo de ciblage DC chez la souris. La première étape du protocole est la purification de l’anticorps du surnageant de l’hybridome NLDC (cellules dendritiques non lymphoïdes)-145 par chromatographie d’affinité. L’anticorps purifié est activé pour la conjugaison chimique par sulfo-SMCC (sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate) tandis que dans le même temps les groupes sulfhydryle de la protéine OVA sont exposés par incubation avec TCEP-HCl (chlorhydrate de phosphine tris (2-carboxyéthyle)). L’excès de TCEP-HCl et de sulfo-SMCC est éliminé et l’antigène est mélangé à l’anticorps activé pour un couplage de nuit. Le conjugué αDEC-205/OVA qui en résulte est concentré et libéré des OVJ non liés. La conjugaison réussie de l’OVA à l’αDEC-205 est vérifiée par l’analyse par transfert western et le test immuno-enzymatique (ELISA).

Nous avons utilisé avec succès l’αDEC-205/OVA réticulé chimiquement pour induire des réponses cytotoxiques des lymphocytes T dans le foie et pour comparer différents adjuvants pour leur potentiel à induire une immunité humorale et cellulaire après un ciblage in vivo de DEC-205+ DC. Au-delà de cela, ces conjugués anticorps/antigènes couplés chimiquement offrent des outils précieux pour l’induction efficace des réponses vaccinales aux antigènes tumoraux et se sont avérés supérieurs aux approches d’immunisation classiques concernant la prévention et le traitement de divers types de tumeurs.

Introduction

Les cellules dendritiques (DC) sont des acteurs centraux du système immunitaire. Il s’agit d’un groupe diversifié de cellules spécialisées dans la présentation de l’antigène et leur fonction principale est de combler l’immunité innée et adaptative1,2. Il est important de noter que les DC jouent non seulement un rôle important dans les réponses efficaces et spécifiques dirigées par les agents pathogènes, mais sont également impliqués dans de nombreux aspects de l’immunité antitumorale1,3.

En raison de leur rôle exclusif dans l’immunité de l’hôte, DC est devenu une cible de la vaccination4. Une approche consiste à cibler les antigènes à DC in vivo pour induire des réponses immunitaires spécifiques à l’antigène et au cours des dernières années, un grand nombre d’études ont été consacrées à la définition de récepteurs appropriés et à des stratégies de ciblage1,4. Un exemple est le récepteur de lectine de type C DEC-205, qui peut être ciblé par des anticorps spécifiques au DEC-205 pour induire une endocytose. Il est important de noter qu’il a été démontré que le ciblage DEC-205 en association avec des adjuvants appropriés induit efficacement des lymphocytes T CD4+ et CD8+ protecteurs à longue durée de vie et protecteurs, ainsi que des réponses d’anticorps, également contre les antigènes tumoraux3,5,6,7,8,9.

Il existe un certain nombre d’études montrant que les antigènes conjugués ciblés par DC sont supérieurs à l’antigène libre non conjugué3,5,10,11,12. Cela fait de la conjugaison de l’antigène à la fraction de ciblage DC respective une étape centrale dans les approches de ciblage DC. Dans le cas du ciblage DC via des anticorps ou des fragments d’anticorps, les antigènes peuvent être chimiquement ou génétiquement liés et l’une ou l’autre stratégie fournit ses propres (dés)avantages1. D’une part, dans les constructions anticorps-antigènes génétiquement modifiées, il existe un contrôle de la dose d’antigène ainsi que de l’emplacement offrant une comparabilité supérieure entre les lots1. Dans le même temps, cependant, la conjugaison chimique nécessite moins de préparation et offre plus de flexibilité, en particulier lorsqu’il s’agit de tester et de comparer différents antigènes et / ou stratégies de vaccination dans des modèles expérimentaux et précliniques.

Nous présentons ici un protocole pour la conjugaison chimique efficace et fiable de l’ovalbumine (OVA) en tant qu’antigène protéique modèle à un anticorps IgG2a spécifique dec-205 (αDEC-205) adapté au ciblage DC in vivo chez la souris. Tout d’abord, l’αDEC-205 est purifié à partir de cellules d’hybridome NLDC-14513. Pour la conjugaison chimique, le réticulant hétérobifonctionnel sulfosuccinimidyl 4-[N-maleimidomethyl] cyclohexane-1-carboxylate (sulfo-SMCC), qui contient des groupes ester NHS (N-hydroxysuccinimide) et maléimide, est utilisé, permettant la conjugaison covalente des molécules contenant des amines et des sulfhydryles. Plus précisément, les amines primaires de l’anticorps réagissent initialement avec le sulfo-SMCC et l’αDEC-205 activé par le maléimide qui en résulte réagit ensuite avec la protéine OVA contenant du sulfhydryle réduite par TCEP-HCl (chlorhydrate de phosphine de tris(2-carboxyéthyle)). Le produit final est chimiquement conjugué αDEC-205/OVA (Figure 1). Au-delà de la conjugaison chimique elle-même, notre protocole décrit l’élimination de l’excès d’OVA du conjugué ainsi que la vérification de la conjugaison réussie par une analyse par transfert western et un test immuno-enzymatique spécifique. Nous avons utilisé avec succès cette approche dans le passé pour conjuguer chimiquement l’OVA et d’autres protéines ou peptides immunogènes en αDEC-205. Nous démontrons une liaison efficace aux cellules CD11c+ in vitro ainsi que l’induction efficace de l’immunité cellulaire et humorale in vivo.

Certes, il y a des inconvénients à cette méthode, comme dans la comparabilité de lot à lot et dans le dosage exact de l’antigène dans le conjugué final. Néanmoins, la conjugaison chimique offre une flexibilité expérimentale dans le choix de l’anticorps et de l’antigène protéique par rapport aux constructions génétiquement modifiées. Par conséquent, nous pensons que cette approche est particulièrement utile pour évaluer différents antigènes pour leur efficacité dans le ciblage DC dans des modèles murins précliniques, et surtout dans le contexte de réponses immunitaires antitumorales spécifiques.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux décrites ont été approuvées par l’agence gouvernementale locale (Niedersächsisches Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit; numéro de dossier 33.12-42502-04-10/0108) et ont été réalisées conformément aux directives nationales et institutionnelles.

1. Production d’αDEC-205 à partir de la lignée cellulaire d’hybridome NLDC-145

  1. Pour la production d’anticorps, décongeler des cellules NLDC-145 cryoconservées produisant de l’αDEC-205 à 37 °C au bain-marie. Dilater les cellules à 37 °C et 5 % de CO2. Deux 75 cm2 des bouteilles seront nécessaires pour procéder à la production d’anticorps. Les procédures de culture cellulaire doivent être effectuées dans une armoire de sécurité pour assurer des conditions de travail sûres et prévenir la contamination des cultures.
    1. Remettre en suspension 1 mL de cellules décongelées (1 x 10 6 -5 x 106 cellules/mL) dans 9 mL de milieu ISF-1 complété par 1 % de pénicilline/streptomycine (préchauffée à 37 °C) dans une fiole de culture cellulaire (25 cm2). Placer la fiole horizontalement dans un incubateur de culture cellulaire à 37 °C, 5% CO2.
    2. Cultiver les cellules à 37 °C et 5% deCO2,jusqu’à 70% de confluence. Cela devrait normalement être réalisé après 24 - 48 h.
    3. Une fois que les cellules sont confluentes à 70 %, transférez la suspension complète de cellules NLDC-145 (10 mL) dans un tube centrifugeur conique de 15 mL à l’aide d’un contrôleur de pipette avec une pipette dans une plage de volume comprise entre 1 et 10 mL. Granulés les cellules par centrifugation à 250 x g pendant 10 min à température ambiante.
    4. Préchauffer le milieu ISF-1 jusqu’à 37 °C au bain-marie et remettre la pastille en suspension dans 12 mL de milieu ISF-1 complété par 1 % de pénicilline/streptomycine. Transférer la suspension cellulaire remise en suspension dans une fiole de culture cellulaire fraîche (75 cm2).
    5. Culture et expansion des cellules dans un milieu ISF-1 complété par 1% de pénicilline/streptomycine à 37 °C et 5% de CO2,jusqu’à 70% de confluent et 99% viable. Cela devrait normalement être réalisé après 48 - 72 h.
    6. Divisez les cellules en deux flacons de 75 cm2. Pour ce faire, rincez d’abord le fond de la fiole de culture cellulaire / surface de culture avec la suspension cellulaire pour retirer toutes les cellules NLDC-145 de la surface. Transférer 6 mL de la suspension cellulaire NLDC-145 chacune dans l’un des deux flacons frais de 75 cm2 et ajouter le milieu ISF-1 préchauffé complété par 1% de pénicilline / streptomycine jusqu’à 12 mL.
      REMARQUE: Ne renouvelez pas le milieu de culture cellulaire car les cellules NLDC-145 auront conditionné le milieu. Transférez les cellules avec leur milieu et remplissez la culture jusqu’au volume souhaité avec un milieu frais. Ceci est crucial pour la viabilité et la production maximale d’anticorps par les cellules NLDC-145.
    7. Dilater les cultures cellulaires à 37 °C et 5% deCO2,jusqu’à environ 70% de confluent, ce qui est généralement obtenu après 48 - 72 h.
    8. Une fois que les cellules sont confluentes à 70 %, transférer 10 mL de la suspension cellulaire NLDC-145 expansée de chacune des bouteilles de 75 cm2 dans une bouteille à rouleaux PETG (polyéthylène téréphtalate glycol) (1 050 cm2). Pour cela, rincez le fond de la fiole de culture cellulaire / surface de culture avec la suspension cellulaire pour retirer toutes les cellules de la surface à l’aide d’un contrôleur de pipette et d’une pipette de 10 mL.
    9. Ajouter 140 mL de milieu ISF-1 complété par 1 % de pénicilline/streptomycine (préchauffée à 37 °C) directement à partir du flacon moyen à chacun des flacons à rouleaux contenant du NLDC-145 les remplissant jusqu’à la marque de 150 mL.
      REMARQUE : Voir la note de l’étape 1.1.6.
    10. Cultivez les bouteilles à rouleaux à 37 °C, 5% de CO2 et 25 tours/min pendant trois jours.
    11. Ajouter 150 mL de milieu ISF-1 complété par 1 % de pénicilline/streptomycine (préchauffée à 37 °C) à chacune des bouteilles à rouleaux contenant du NLDC-145 les remplissant jusqu’à la barre des 300 mL.
    12. Cultivez les bouteilles à rouleaux contenant maintenant 300 mL de culture chacune à 37 °C, 5 % de CO2 et 25 tours/min pendant encore trois jours.
    13. Ajouter 100 mL supplémentaires de milieu ISF-1 complété par 1 % de pénicilline/streptomycine (préchauffé à 37 °C) à chacun des flacons à rouleaux contenant du NLDC-145, les remplissant ainsi jusqu’à la barre des 400 mL.
    14. Cultivez les bouteilles à rouleaux contenant maintenant 400 mL de culture chacune à 37 °C, 5 % de CO2 et 25 tours/min pendant sept jours supplémentaires.
      REMARQUE: Au cours de cette semaine, la culture devient très dense (jusqu’à 95% de densité) et la viabilité diminue (jusqu’à aussi peu que 50%), permettant une libération maximale d’anticorps.
  2. Pour la purification de l’αDEC-205 à partir du surnageant de culture, versez la suspension cellulaire NLDC-145 (des deux bouteilles à rouleaux) directement dans des bouteilles de centrifugation autoclavées de 500 mL.
    NOTE : Un volume total de 800 mL de culture doit être recueilli.
    1. Centrifuger la culture pendant 30 min à 8 600 x g et 4 °C pour éliminer les cellules et les débris.
    2. Recueillir les surnageants, jeter les granulés et les regrouper dans un flacon de réactif stérile.
      REMARQUE: La purification de l’αDEC-205 peut être commencée immédiatement (étape 2.) ou le surnageant peut être stocké à court terme à 4 ° C.

2. Purification de l’anticorps αDEC-205 à partir du surnageant de la cellule NLDC-145

REMARQUE: À partir du surnageant de la cellule NLDC-145, αDEC-205 est purifié à l’aide d’une colonne de protéine G Sepharose (réutilisable). Les dimensions de la colonne sont de 15 mm x 74 mm et 5 mL de protéine G Sepharose sont emballés par colonne.

  1. Pour la préparation et le lavage de la colonne de protéine G Sepharose, placez un bouchon en caoutchouc hermétique sur l’ouverture supérieure de la colonne de protéine G Sepharose. Perforez le bouchon en caoutchouc avec deux canules stériles (20 G x 1 1/2 », 0,90 x 40 mm).
    1. Connectez une seringue de 10 mL à l’une des deux canules et un tube de silicium flexible (environ 100 cm de long, 2,5 à 3 mm de diamètre) avec un connecteur de tube à la deuxième canule.
      REMARQUE: La construction de la seringue / bouchon en caoutchouc est réutilisable et fournit un vide résultant en un flux continu du grand volume de surnageant de culture vers la colonne de protéine G Sepharose. À cette fin, retirez légèrement le piston de la seringue pour assurer un écoulement continu du fluide dans les étapes suivantes.
    2. Lavez la colonne avec 50 mL d’acide acétique glacial de 0,1 M (pH 2) pour éliminer les anticorps potentiellement restants de toute purification d’anticorps antérieure. Mettez l’extrémité du tube de silicium dans la bouteille de réactif remplie d’acide acétique glacial (pH 2) de 0,1 M. En raison du vide induit, 50 mL d’acide acétique glacial de 0,1 M (pH 2) traversent la colonne de protéine G Sepharose.
      REMARQUE: L’acide acétique glacial de 0,1 M (pH 2) doit être conservé dans un flacon de réactif ou fraîchement rempli dans un bécher.
    3. Lavez la colonne avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) de 100 à 200 mL. Placez l’extrémité du tube de silicium dans une bouteille ou un bécher de réactif rempli de PBS. Laissez 100-200 mL de PBS courir goutte à goutte à travers la colonne de protéine G Sépharose.
  2. Pour la purification des anticorps du surnageant NLDC-145, chargez 800 mL du surnageant NLDC-145 (obtenu à partir de l’étape 1.2.2.) sur la colonne. Mettez l’extrémité du tube de silicium dans la bouteille de réactif remplie de surnageant NLDC-145. Laissez 800 mL de surnageant NLDC-145 courir dans le sens tombant à travers la colonne.
    1. Lavez la colonne avec 500 mL de PBS. Placez l’extrémité du tube de silicium dans une bouteille ou un bécher de réactif rempli de PBS. Laissez 500 mL PBS s’exécuter dans la colonne.
    2. Pour l’élution, utilisez 20 tubes de 1,5 mL et pipette 100 μL de Tris-HCl de 1,5 M (pH 8,8) dans chaque tube de 1,5 mL. Retirez le bouchon en caoutchouc de la colonne et pipettez 1 mL de glycine 0,1 M (pH 3) dans la chambre supérieure de la colonne de protéine G Sepharose pour éluer l’anticorps de la colonne. Recueillir l’écoulement directement sous forme d’éluat dans l’un des tubes préparés de 1,5 mL.
    3. Répétez l’étape d’élution (2.2.2.) pour les 20 tubes (1,5 mL).
    4. Déterminer la densité optique de toutes les fractions d’élution à 280 nm (OD280)à l’aide d’un spectrophotomètre afin d’identifier les fractions contenant des anticorps.
      REMARQUE: Utilisez la première fraction d’élution comme vide.
    5. Regrouper toutes les fractions dont le DO280 est supérieur à 0,5 (environ 10 fractions).
    6. Conserver la colonne de protéine G Sepharose remplie d’éthanol à 20 % à 4 °C.
  3. Dialyze les élutions groupées contre 1000 mL PBS (dans un bécher de 2000 mL) à 4 °C pendant la nuit en utilisant un tube de dialyse avec une coupure de poids moléculaire (MWCO) de 12 - 14 kDa.
    1. Couper le tube de dialyse en morceaux de 20 cm. Faire bouillir le tube de dialyse dans 500-800 mL de 10 mM EDTA (pH 7,5) pendant 30 min dans un bécher à l’aide d’une plaque chauffante pour éliminer la contamination. Jeter la solution d’EDTA de 10 mM (pH 7,5) et faire bouillir le tube de dialyse dans de l’eau désionisée pendant 10 min.
      REMARQUE: Le tube de dialyse peut être utilisé directement ou stocké dans une solution d’azoture de sodium (NaN3) à 0,01% / H2O à 4 ° C jusqu’à la prochaine utilisation.
    2. Fermez le fond du tube de dialyse à l’aide d’une fermeture de tube de dialyse appropriée/d’une pince articulée d’une seule pièce et pipetez soigneusement l’élution d’anticorps dans le tube de dialyse. Fermez le haut du tube de dialyse avec une deuxième pince.
    3. Fixez la pince supérieure du tube de dialyse sur un support flottant, assemblez-la avec une barre d’agitation magnétique dans le bécher rempli de PBS et placez le bécher sur un agitateur magnétique.
    4. Dialyze remuant toute la nuit à 4 °C.
  4. Pour augmenter la concentration d’αDEC-205, chargez le dialysat complet dans un concentrateur centrifuge de 10 kDa MWCO. Ouvrez une pince du tube et pipetez soigneusement le dialysat complet hors du tube de dialyse dans le concentrateur centrifuge (10 kDa MWCO).
    REMARQUE: Ne touchez pas le fond du concentrateur avec l’embout de la pipette.
    1. Centrifuger pendant 30 min à 693 x g (2 000 tr/min) et 4 °C.
    2. Charger le concentrateur centrifuge avec 10 mL de PBS et centrifuger à 693 x g (2 000 tr/min) et 4 °C jusqu’à ce que le volume final de solution d’anticorps restant soit de 1 à 1,5 mL.
      NOTE: Si nécessaire, répétez l’étape de centrifugation du 2.4.1. pour s’ajuster au montant souhaité.
    3. À l’aide d’un spectrophotomètre, déterminer la densité optique de la solution concentrée d’αDEC-205 à 280 nm (OD280). Utilisez PBS comme vide.
    4. Calculer la concentration d’αDEC-205 à l’aide de la formule suivante :
      concentration [mg/mL] = OD280/1,4.
    5. Filtrer la solution αDEC-205 à l’aide d’une unité de filtration de seringue de 0,22 μm.
      REMARQUE: La purification de l’αDEC-205 à partir du surnageant de cellules d’hybridome NLDC-145 peut également être réalisée par FPLC (chromatographie liquide à protéine rapide). L’αDEC-205 purifié peut être conservé à 4 °C ou à -18 °C pour un stockage à long terme.

3. Conjugaison chimique de l’OVA à l’αDEC-205

REMARQUE: Un rapport de 0,5 mg de protéine OVA à 2,5 mg d’αDEC-205 (1:5) est nécessaire pour une conjugaison chimique optimale. Cependant, ce rapport peut varier pour d’autres protéines et anticorps et doit être optimisé pour les conjugués alternatifs. La réduction des liaisons disulfures de la protéine OVA est réalisée par incubation avec 30 mM TCEP-HCl, ce qui expose les groupes sulfhydryle pour la conjugaison chimique à αDEC-205 et 240 μl de TCEP-HCl sont nécessaires à l’étape 3.2. Les deux étapes, la réduction induite par le TCEP de l’OVA (étape 3.1.) et l’activation sulfo-SMCC de l’αDEC-205 (étape 3.2.), doivent de préférence être effectuées en parallèle.

  1. Préparer fraîchement une solution de TCEP-HCl de 125 mM (pH 7,0). Peser la quantité désirée de TCEP-HCl et dissoudre le TCEP-HCl dans une base tris de 0,9 M (pH 8,8). Utilisez des bandelettes indicatrices de pH pour tester le pH de la solution de TCEP-HCl de 125 mM (qui doit être neutre) et ajustez le pH avec la base Tris (pH 8,8).
    1. Pipeter 200 μL de solution protéique OVA (contenant 0,5 mg OVA) dans un tube stérile de 1,5 mL. Ajouter 240 μl 125 mM de TCEP-HCl et 560 μL d’eau ultrapure stérile à la protéine OVA à l’aide d’une pipette à une concentration finale de 0,5 mg/mL de protéine OVA et de 30 mM de TCEP-HCl (OVA/TCEP-HCl).
      REMARQUE: 2,5 mg d’OVA EndoGrade (lyophilisé) est dissous dans 1 mL de PBS, ce qui donne une solution d’OVA de 2,5 mg / mL.
    2. Incuber l’OVA/TCEP-HCl résultant à température ambiante pendant 1,5 h.
      REMARQUE : Ne prolongez pas cette étape d’incubation.
  2. Pour activer l’αDEC-205 pour la conjugaison, dissoudre 2 mg de sulfo-SMCC dans 100 μL d’eau ultrapure.
    REMARQUE: Sulfo-SMCC est sensible à l’hydrolyse. Par conséquent, de plus grandes quantités de sulfo-SMCC non dissous doivent être manipulées rapidement ou des aliquotes disponibles de 2 mg doivent être utilisées.
    1. Diluer l’αDEC-205 dans le PBS de manière à ce que 2,5 mg soient contenus dans 900 μL.
    2. Mélanger 2,5 mg d’αDEC-205 (volume de 900 μL; obtenu à partir de l’étape 3.2.1.) et 100 μL de sulfo-SMCC (obtenu à partir de l’étape 3.2.) dans un tube de 1,5 mL, pour obtenir un volume total de 1 mL.
    3. Incuber la solution αDEC-205/sulfo-SMCC pendant 30 min à 37 °C et 550 tr/min dans un bloc chauffant.
  3. Suite à ces incubations, les excès de sulfo-SMCC et de TCEP-HCl sont immédiatement éliminés des solutions à l’aide de colonnes de dessalement (MWCO 7 kDa ; volume de colonne de 5 mL).
    1. Dérlayer la fermeture inférieure des colonnes (MWCO 7 kDa), desserrer le capuchon et placer la colonne dans un tube conique de 15 mL.
    2. Centrifuger pendant 2 min à 1 000 x g à température ambiante pour éliminer le liquide.
    3. Placez la colonne dans un tube frais et retirez le capuchon. Chargez lentement l’anticorps/sulfo-SMCC et l’OVA/TCEP-HCl, respectivement, au centre du lit de résine compact d’une colonne chacun.
    4. Centrifuger pendant 2 min à 1 000 x g à température ambiante.
    5. Ignorez les colonnes après utilisation. Les solutions contenant des anticorps et des OVA amorcées pour la conjugaison se trouvent dans les tubes.
    6. Mélanger immédiatement les deux solutions par pipetage pour la conjugaison de αDEC-205 et OVA.
    7. Incuber le mélange αDEC-205 et OVA résultant pendant la nuit à 4°C.
  4. Après conjugaison, l’excès d’OVJ non lié est éliminé de la solution et l’αDEC-205/OVA couplé est concentré à l’aide d’un concentrateur de protéines centrifuges (MWCO 150 kDa).
    1. Pré-rincer le concentrateur de protéines centrifuges (MWCO 150 kDa) en pipetant 12 mL de PBS sur la colonne et en centrifugant pendant 2 min à 2 000 x g à température ambiante.
      REMARQUE: Si nécessaire, répétez l’étape de centrifugation (3.4.1.) jusqu’à ce qu’un volume d’environ 5 mL ait traversé la colonne.
    2. Avant de charger l’αDEC-205/OVA sur le concentrateur de protéines centrifuges, conservez un échantillon de 20 μL de l’αDEC-205/OVA non concentré pour l’analyse par transfert western. Conserver cette aliquote à 4 °C jusqu’à l’analyse.
    3. Charger l’αDEC-205/OVA sur le concentrateur de protéines centrifuges par pipetage.
      REMARQUE: Évitez tout contact avec le lit de la chambre supérieure du concentrateur centrifuge.
    4. Remplir le concentrateur à 15 mL avec du PBS et centrifuger le concentrateur pendant 5 min à 2 000 x g à température ambiante.
    5. Enregistrez un échantillon du flux traversant (flow-through I) pour l’analyse par transfert Western et jetez le flux restant.
    6. Remplir le concentrateur à 10 mL avec du PBS et centrifuger le concentrateur pendant au moins 8 min à 2 000 x g à température ambiante.
    7. Enregistrez un échantillon pour le deuxième écoulement (écoulement II) pour l’analyse par transfert western et jetez le flux restant.
    8. Une fois l’enrichissement souhaité atteint (environ 1,5 mL de la solution αDEC-205/OVA doit être laissé dans la chambre supérieure), aspirer doucement l’échantillon concentré.
      REMARQUE: Si trop de liquide est laissé dans la chambre supérieure, la centrifugation peut être répétée mais doit être aussi courte que possible.
  5. Déterminer la concentration en protéines de l’αDEC-205/OVA résultant à l’aide d’un spectrophotomètre à microvolume. Utilisez PBS comme vide.
  6. Filtrer l’αDEC-205/OVA à l’aide d’une unité de filtration de seringue de 0,22 μm.
    REMARQUE: Pour les analyses ultérieures et les expériences in vivo, αDEC-205/OVA peut être stocké à 4 °C ou -18 °C.

4. Vérification de la conjugaison chimique par transfert western

REMARQUE: Pour vérifier la conjugaison chimique réussie, une analyse par transfert de Western détectant soit OVA (4.2) ou αDEC-205 (4.10) est effectuée. La détection de l’OVA (4.2.) ou de l’αDEC-205 (4.10.) doit être effectuée en parallèle. Un agitateur de plate-forme orbitale doit de préférence être utilisé pour toutes les étapes d’incubation des membranes de transfert western afin de permettre une distribution uniforme des solutions respectives.

  1. Préparer des gels SDS (sodium dodecyl sulfate) standard à 10 % pour SDS-PAGE (électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium).
  2. Préparez les échantillons pour SDS-PAGE afin de détecter les OVULES conjugués et non conjugués et d’exécuter l’électrophorèse sur gel.
    1. Diluer différentes quantités d’αDEC-205/OVA couplé (p. ex., 200, 100 et 50 ng), d’OVA pur (p. ex., 80, 70, 60, 50, 40 et 30 ng), une aliquote d’αDEC-205 non conjugué (p. ex., 100 et 50 ng), un échantillon de conjugué αDEC-205/OVA non concentré de l’étape 3.4.2. (par exemple, 125 ng) et une aliquote d’écoulement I et II (étapes 3.4.5 et 3.4.7., respectivement; facultatif) dans 4 x tampon d’échantillon de FDS non réducteur.
      REMARQUE: Différentes concentrations de conjugué et de protéine sont chargées pour s’assurer que les deux OVA libres ainsi que le conjugué peuvent être détectés sur le même blot.
    2. Dénaturer les échantillons à 65 °C pendant 10 min et 550 tr/min dans un bloc chauffant.
  3. Chargez les échantillons et un étalon de protéines dans un gel SDS et exécutez SDS-PAGE.
  4. Effectuer un transfert standard des protéines du gel SDS vers une membrane PVDF (difluorure de polyvinylidène) activée par le méthanol (75 min, 125 mA).
  5. Après le buvard, placez la membrane dans un plat approprié et bloquez la membrane en pipetant 25 mL de poudre de shake de remplacement de repas à 4 % / TBS-T (solution saline tamponnée Tris / 0,1% Tween 20) bloquant le tampon dans le plat contenant la membrane.
    1. Incuber la membrane dans la solution bloquante pendant 60 min à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C.
  6. Jeter la solution bloquante et tacher la membrane avec l’anticorps primaire αOVA de lapin dans de la poudre de substitut de repas à 2 % / tampon d’anticorps TBS-T (dilution 1:3 000) en pipetant 15 mL de solution d’anticorps primaires à la membrane dans la boîte.
    1. Incuber la membrane pendant 45 min à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C (utilisez le shaker de plate-forme).
  7. Jetez la solution d’anticorps et lavez la membrane dans le plat (utilisez le shaker à plate-forme).
    1. Ajouter 25 mL de TBS-T à la membrane et incuber pendant 5 min. Jetez la solution.
    2. Ajouter 25 mL de TBS-T/0,5 M NaCl à la membrane et incuber pendant 5 min. Jetez la solution.
    3. Ajouter 25 mL de TBS-T/0,5 % de Triton X-100 à la membrane et incuber pendant 5 min. Jetez la solution.
    4. Ajouter 25 mL de TBS-T à la membrane et incuber pendant 5 min. Jetez la solution.
  8. Tacher la membrane avec l’anticorps secondaire αrabbit-IgG-HRPO (peroxydase de raifort) de chèvre dans 2 % de poudre de substitut de repas/tampon d’anticorps TBS-T (dilution 1:2 000) en pipetant 15 mL de solution d’anticorps secondaires sur la membrane dans la boîte.
    1. Incuber la membrane pendant 45 min à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C (sur le shaker de la plate-forme).
  9. Lavez à nouveau la membrane comme décrit à l’étape 4.7.1.- 4.7.4. en utilisant le shaker de plate-forme. Pour cette membrane, passez ensuite à l’étape 4.16. (les étapes suivantes 4.10.- 4.15. (détection de l’αDEC-205) peut être effectuée parallèlement aux étapes 4.2.- 4.9.).
  10. Préparer les échantillons pour la détection de l’αDEC-205 pour SDS-PAGE et exécuter l’électrophorèse sur gel.
    1. Diluer différentes quantités d’αDEC-205/OVA (par exemple, 200, 100 et 50 ng), de l’αDEC-205 non conjugué (par exemple, 250, 125, 62,5 ng), d’OVA pur (par exemple, 80 et 70 ng), un échantillon d’αDEC-205/OVA non concentré de l’étape 3.4.2. (par exemple, 125 ng) et une aliquote d’écoulement I et II (étapes 3.4.5 et 3.4.7., respectivement; facultatif) dans 4 x tampon d’échantillon de FDS non réducteur.
    2. Dénaturer les échantillons à 65 °C pendant 10 min et 550 tr/min dans un bloc chauffant.
  11. Chargez les échantillons et un étalon de protéines dans un gel SDS et exécutez l’électrophorèse sur gel.
  12. Effectuer le transfert standard des protéines du gel SDS vers une membrane PVDF (difluorure de polyvinylidène) activée par le méthanol (75 min, 125 mA).
  13. Après le buvard, placez la membrane dans un plat approprié et bloquez la membrane en pipetant 25 mL de tampon bloquant à 10% (lait en poudre / TBS-T) dans le plat contenant la membrane.
    REMARQUE: Les solutions de blocage diffèrent entre la détection αDEC-205 et OVA (étape 4.5.).
    1. Incuber la membrane dans la solution bloquante pendant 60 min à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C (à l’aide du shaker de plate-forme).
  14. Jeter la solution bloquante et tacher la membrane avec l’anticorps αrat-IgG(H+L)-HRPO de chèvre dans un tampon de lait en poudre à 5 % /anticorps TBS-T (dilution 1:5 000) en pipetant 15 mL de solution d’anticorps sur la membrane dans la boîte.
    REMARQUE: Les tampons d’anticorps diffèrent entre la détection αDEC-205 et la détection OVA (étapes 4.6./ 4.8.).
    1. Incuber la membrane pendant 45 min à température ambiante ou toute la nuit à 4 °C (à l’aide du shaker de plate-forme).
  15. Lavez soigneusement la membrane dans le plat comme décrit aux étapes 4.7.1.- 4.7.4. (utilisez le shaker de plate-forme).
  16. Utilisez un réactif de détection approprié pour développer le signal HRP et détecter la chimiluminescence dans une pièce sombre à l’aide d’un film radiographique ou via un système d’imagerie.

5. Vérification de la conjugaison chimique par ELISA

  1. Effectuer ELISA pour une vérification plus approfondie de la conjugaison chimique réussie résultant en αDEC-205/OVA.
  2. Enduire une plaque ELISA appropriée de 96 puits avec 100 μL/puits d’anticorps αOVA de lapin de 3 ng/μL dans un tampon de revêtement (bicarbonate de sodium de 0,1 M (NaHCO3)pH 9,6 dilué dansH2O).
    1. Incuber la plaque pendant la nuit à 4 °C.
  3. Après le revêtement, lavez la plaque trois fois avec du PBS, par exemple à l’aide d’une rondelle ELISA.
  4. Bloquez la plaque en pipetant 200 μL de tampon bloquant (10% FCS en PBS) dans chaque puits de la plaque et incubez la plaque pendant 30 min à température ambiante.
  5. Diluer en série αDEC-205/OVA (obtenu à partir de l’étape 3.6.) 1:2 dans un tampon bloquant (10 % FCS dans PBS) pour obtenir des dilutions allant de 6 μg/mL à 93,8 ng/mL αDEC-205/OVA et ajouter 100 μL/puits de ces quantités décroissantes d’αDEC-205/OVA aux puits.
    1. Incuber la plaque pendant 1 h à température ambiante.
  6. Lavez la plaque trois fois avec du PBS, par exemple à l’aide d’une rondelle ELISA.
  7. Ajouter 100 μL de l’anticorps chèvre αrat-IgG+IgM(H+L)-HRPO (dilué à 1:2 000 dans un tampon bloquant (10 % FCS dans PBS)) à chaque puits de la plaque.
    1. Incuber pendant 1 h à température ambiante.
  8. Lavez la plaque trois fois à l’aide de PBS, par exemple à l’aide d’une laveuse ELISA.
  9. Ajouter 50 μL de substrat HRPO aux puits. Lorsque vous observez une réaction de couleur claire, arrêtez la réaction par addition de 150 μl de solution d’arrêt(1MH 2 SO4)par puits.
  10. Après 5 min, lire l’absorption à 450 nm à l’aide d’un lecteur ELISA.

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Résultats

La conjugaison chimique de la protéine αDEC-205 à la protéine OVA à l’aide de ce protocole permettra généralement la génération efficace d’αDEC-205/OVA pour les approches de ciblage DC in vivo. Il existe différentes stratégies pour vérifier la technique elle-même et pour tester la fonctionnalité du conjugué donné. L’analyse par transfert Western et ELISA sont utilisés pour vérifier la conjugaison réussie et en même temps détecter les OVA potentiellement libres

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Discussion

La conjugaison chimique d’un anticorps spécifique au récepteur de l’endocytose et d’un antigène protéique fournit une approche efficace et, surtout, flexible pour le ciblage in vivo dc dans des modèles murins précliniques. Avec notre protocole, nous fournissons une approche efficace pour la conjugaison réussie de l’antigène modèle OVA à un anticorps IgG spécifique DEC-205.

Dans notre protocole, αDEC-205 est purifié à partir d’une lignée cellulaire d’hybridome et dans le passé, nous av...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient S. Prettin pour son assistance technique experte. Ce travail a été soutenu par une subvention de l’Association Helmholtz des centres de recherche allemands (HGF) qui a été fournie dans le cadre de l’Alliance Helmholtz ''Immunothérapie des cancers'' (HCC_WP2b).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
tampon d’anticorps 2 %2 %(p/v) Slim-Fast Chocolat en poudre dans un
tampon d’anticorps5 % de lait en poudre (p/v) dans un tampon de blocage de TBS-T
(ELISA)10 % FBS dans un
tampon de blocage PBS 4 %4 %
10 %10 % de lait en poudre (p/v) en Flacon de culture cellulaire TBS-T
T25Greiner Bio-One690175nous utilisons des flacons de culture cellulaire à capuchon filtrant standard CELLSTAR ; alternativement, utilisez un flacon de culture cellulaire en suspension (690195 )
flacon de culture cellulaire T75Greiner Bio-One658175nous utilisons des flacons de culture cellulaire standard CELLSTAR  ; bouchon filtrant ; alternativement, utilisez un flacon de culture en suspension (658195)  ;
Flacon de culture cellulaire T175Greiner Bio-One661175nous utilisons des flacons de culture cellulaire standard CELLSTAR ; alternativement utiliser un flacon de culture en suspension (661195)
concentrateur centrifuge MWCO 10 kDaSartoriusVS2001Vivaspin 20 concentrateur
concentrateur de protéines MWCO 100 kDa, 5 - 20 mlThermo Fisher Scientific88532Concentrateur de protéines Pierce, PES 5 -20 ml ; nous utilisons le Concentrateur Pierce 150K MWCO 20mL (numéro de catalogue 89921), qui n’est cependant plus disponible  ;
flacons centrifugesNalgene525-2314PPCO (copolymère de polypropylène) avec bouchon à vis en PP (polypropylène), 500 ml ; obtenu à partir de VWR, Allemagne
tampon de revêtement (ELISA)0,1 M de bicarbonate de sodium (NaHCO3) en H2O (pH 9,6)
Colonnes de dessalage MWCO 7 kDaThermo Fisher Scientific89891Thermo Scientific Zeba Spin Colonnes de dessalage, 7K MWCO, 5 mL
réactif de détection ELISA (substrat HRPO)Sigma-Aldrich/MerckT8665-100ML3,3&prime ;,5,5&prime ;-Tetramethylbenzidine (TMB) système de substrat liquide
réactif western blot (substrat HRPO)Roche/Merck12 015 200 01Lumi-Light Western Blot substrate (Roche)
tube de dialyse MWCO 12 - 14 kDaSERVA Electrophorèse44110Tubulure de dialyse Visking, 16 mm de diamètre
ELISA 96 puits ThermoFisher Scientific442404MaxiSorp Nunc-Immuno Plate
sérum fœtal pour veauPAN-BIOtechP40-47500FBS Good forte
ISF-1 mediumBiochrom/bioswisstecF 9061-01
lait en poudreCarl RothT145.2lait en poudre, de qualité buvard, faible en gras ; alternativement, nous avons également utilisé du lait écrémé en poudre conventionnel du supermarché
NLDC-145 hybridomeATCCHB-290si ce n’est pas déjà à portée de main, les cellules d’hybridome peuvent être acquises à partir de l’ATCC
tampon d’échantillon SDS non réducteur 4 x  ;pour 12 ml : 4 ml de 10 % SDS, 600 & micro ; l 0,5 M Tris-HCl (ph 6,8), 3,3 ml stérile H2O, 4 ml de glycérine, 100 & micro ; l de 5 % Bromphenol Blue
ovalbuminHyglos (via BioVendor)321000EndoGrade OVA ultra-pur avec < 0,1 UE/mg
Pénicilline/StreptomycineThermo Fisher Scientific15140122Gibco Pénicilline/Streptomycine 10.000 U/ml ; alternativement Gibco Pénicilline/Streptomycine 5.000 U/ml (15070-063) peut être utilisé
PETG polyéthylène téréphtalate glycol flacons roulants de culture cellulaireNunc In Vitro734-2394standard PDL-coated, ventilé (1.2X), 1050 cm² ;, 100 - 500 ml de volume ; obtenu auprès de VWR, Allemagne  ;   ;
Bandelettes indicatrices de pHMerck109535bandelettes indicatrices de pH 0-14
chèvre polyclonale & alpha ; rat-IgG(H+L)-HRPO (western blot)Jackson ImmunoResearch  ;112-035-062obtenu de Dianova, Allemagne ; utilisé à 1:5000 pour
chèvre polyclonale Western blot & alpha ; anticorps rat-IgG+IgM-HRPO  ; (ELISA)Jackson ImmunoResearch  ;112-035-068obtenu de Dianova, Allemagne ; utilisé à 1:2000 pour ELISA
polyclonal chèvre & alpha ; lapin-IgG-HRPO (western blot)Jackson ImmunoResearch  ;111-035-045  ;obtenu de Dianova, Allemagne ; utilisé à 1:2000 pour le western blot
lapin polyclonal & alpha ; OVA (ELISA)Abcamab181688utilisé à 3 ng/µ ; l
lapin polyclonal &alpha ; Anticorps OVA (western blot)OriGeneR1101utilisé à 1:3 000 pour le western blot
Protéine G Colonne de sépharoseMerck/MilliporeP32965 ml Protein G Sepharose, Fast Flow sont emballés sur une colonne vide-10 (Merck, GE 17-0435-01)
étalon de protéinesThermo Fisher Scientific26616PageRuler Prestained Échelle de protéines 10 - 180 kDa
Membrane PVDF (difluorure de polyvinylidène)Merck/MilliporeIPVH00010immobilon-P bouchon en caoutchouc à membrane PVDF (difluorure de polyvinylidène)
Omnilab5230217DEUTSCH & Bouchons en caoutchouc NEUMANN (inférieur &Phi ; 17 mm ; supérieur &Phi ; 22 mm)
tube en siliconeOmnilab5430925DEUTSCH & NEUMANN (intérieur &Phi ; 1 mm ; extérieur &Phi ; 3 mm)
Slim-Fastnous avons utilisé du chocolat Slim-Fast ordinaire disponible gratuitement en pharmacie car dans cette approche western blot, il a donné de meilleurs résultats que la
solution d’arrêt du lait en poudre (ELISA)1M H2SO4
sulfo-SMCCThermo Fisher Scientific22322Réticulant Pierce Sulfo-SMCC ; ou utiliser le numéro de catalogue A39268 (10 x 2 mg)
unité de filtre à seringue 0,22 & micro ; m  ;Merck/MilliporeSLGV033RSUnité de filtre à seringue Millex-GV, 0,22 & micro ; m, PVDF, 33 mm, stérilisé aux rayons gamma
seringue 10 mlOmnilabSeringues jetables Injekt® ; Canules Solo B.Braun
Sterican® ;B. BraunSterican® ; G 20 x 1 1/2" » ; 0,90 x 40 millimètre ; jaune
TBS-TSolution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % (v/v) Tween 20
TCEP-HClThermo Fisher ScientificA35349
Connecteur de tubeOmnilabKleinfeld pour tube en silicone
TBS-T 5 % (p/v) Poudre de chocolat Slim-Fast dans un tampon de blocage TBS-T centrifuge la miniature

Références

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