Caractérisation d’une nouvelle technique de culture rétinienne organotypique humaine

Résumé

Cette étude vise à développer un nouveau modèle de culture rétinienne organotypique humaine (HORC) qui empêche de compromettre l’intégrité rétinienne lors de la manipulation des explants. Ceci est réalisé en cultivant la rétine avec le vitré sous-jacent et le pigment rétinien sous-jacent épithélium-choroïde (RPE-choroïde) et la sclérotique.

Résumé

Des modèles antérieurs de culture rétinienne organotypique humaine (HORC) ont utilisé des rétines détachées; cependant, sans le soutien structurel conféré par l’épithélium-choroïde pigmentaire rétinien (RPE-choroïde) et la sclérotique, l’intégrité de la rétine fragile peut facilement être compromise. L’objectif de cette étude était de développer un nouveau modèle HORC qui contient la rétine, la choroïde RPE et la sclérotique pour maintenir l’intégrité rétinienne lors de la culture d’explants rétiniens.

Après avoir coupé circonférentiellement le long du limbe pour enlever l’iris et le cristallin, quatre incisions profondes ont été pratiquées pour aplatir l’œillet. Contrairement aux protocoles HORC précédents, une tréphine a été utilisée pour couper non seulement la rétine, mais aussi la choroïde RPE et la sclérotique. Les explants à triple couche qui en ont résulté ont été cultivées pendant 72 h. La coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H & E) a été utilisée pour évaluer les structures anatomiques et les explants rétiniens ont été caractérisés par immunohistochimie (IHC) pour l’apoptose, l’intégrité cellulaire de Müller et l’inflammation de la rétine. Pour confirmer la possibilité d’induction de la maladie, les explants ont été exposés à un taux élevé de glucose (HG) et à des cytokines pro-inflammatoires (Cyt), pour imiter la rétinopathie diabétique (DR). Le test de billes magnétiques Luminex a été utilisé pour mesurer les cytokines liées à la RD libérées dans le milieu de culture.

La coloration H & E a révélé des lamelles rétiniennes distinctes et des noyaux compacts dans les explantes rétiniennes avec la choroïde RPE sous-jacente et la sclérotique, tandis que les rétines sans les structures sous-jacentes présentaient une épaisseur réduite et une perte de noyaux sévère. Les résultats de l’IHC ont indiqué l’absence d’apoptose et d’inflammation de la rétine ainsi que la préservation de l’intégrité des cellules de Müller. Les tests Luminex ont montré une augmentation significative de la sécrétion de cytokines pro-inflammatoires associées à la RD dans les explants rétiniens exposés à HG + Cyt par rapport aux niveaux de base à 24 h.

Nous avons développé et caractérisé avec succès un nouveau protocole HORC dans lequel l’intégrité de la rétine a été préservée sans apoptose ni inflammation de la rétine. De plus, la sécrétion induite de biomarqueurs pro-inflammatoires associés à la RD lors de l’exposition des explants rétiniens à HG + Cyt suggère que ce modèle pourrait être utilisé pour des études cliniquement traduisibles sur les maladies rétiniennes.

Introduction

La rétine est une structure oculaire hautement spécialisée responsable de la transformation de l’énergie lumineuse entrante en signaux électriques, qui sont ensuite traités par le cerveau pour la perception visuelle. La rétine humaine contient une gamme dynamique de types cellulaires, très organisés dans une structure lamellaire unique composée de deux couches synaptiques et de trois couches nucléiques¹ (Figure 1). L’homéostasie rétinienne est soutenue par les connexions complexes entre les cellules neurorétiniennes, les vaisseaux sanguins, les nerfs, les tissus conjonctifs et^{l’EPR 1.} En rai....

Protocole

Les cils de donneurs humains ont été obtenus auprès de la Banque nationale des yeux de Nouvelle-Zélande à la suite d’une excision cornéenne en vue d’une transplantation et approuvés par le Comité d’éthique de la santé et du handicap du Nord B (NTX/06/19/CPD/AM07).

REMARQUE: La culture doit être effectuée dans une armoire de biosécurité de classe II pour assurer des conditions de culture de tissus stériles. Les tissus doivent être cultivés dans les 24 heures post-mortem pour éviter une perte importante de l’intégrité de la rétine.

Résultats

L’intégrité rétinienne a été préservée dans ce modèle HORC. L’intégrité rétinienne a été préservée dans les explants rétiniens sandwich cultivés, mais a été perdue dans la rétine cultivée sans structures adjacentes. H&E a été mené pour examiner l’intégrité structurelle des explants rétiniens sandwich sectionnés après 72 h en culture. Les explantes rétiniennes sandwich ont montré une intégrité préservée et une structure de lamelles distincte de GCL à ONL avec des noyau.......

Discussion

HORC est actuellement le modèle le plus traduisible cliniquement dans la recherche rétinienne préclinique. Par rapport aux modèles de culture cellulaire in vitro, HORC peut mieux représenter l’anatomie de la rétine humaine in situ, en conservant les types de cellules rétiniennes dynamiques et leurs connexions avec les neurones, les vascularisations et l’environnement extracellulaire¹⁹. Par rapport aux modèles animaux, les HORC sont plus avantageux dans l’étude de la physiopathologie et la concepti.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poinçons de biopsie jetables (5 mm)	Integra York PA Inc., USA	21909-142	Appelés tréphines chirurgicaux dans cet article
IL-1&beta humaine ;	Peprotech, USA	200-01B	Concentration de travail : 10 ng/mL
Recombinant humain  ; TNF-a	Peprotech, États-Unis	300-01A	Concentration de travail : 10 ng/mL
de DAPI (1 & micro ; g/mL)	Sigma Aldrich, Allemagne#D9542		Coloration nucléaire. Dilution de travail 1:1000
DMEM/F-12, supplément GlutaMAX	Gibco, Thermofisher, Scientific Inc., États-Unis	10565018	Dulbecco' s Modified Eagle Mélange moyen d’éléments nutritifs F-12 contenant 1& fois ; mélange d’antibiotiques et d’antimycosiques (AA, 100&fois ; stock)
Ciseaux fins - Sharp-Blunt	Fine Science Tools (F.S.T)	14028-10	Pointes : Sharp-Blunt, Tranchant : 27mm, Longueur : 10cm, Alliage/Matériau : Acier inoxydable, Dentelé : Non, Forme de la pointe :
Pince Graefe	Fine Science Tools (F.S.T)	11050-10	Longueur : 10cm, Forme de l’embout : Droit, Embouts : Dentelés, Largeur de l’embout : 0,8 mm, Dimensions de l’embout : 0,8 x 0,7 mm, Alliage / Matériaux :
Souris monoclonale en acier inoxydable GFAP-Cy3	Sigma Aldrich, Allemagne	#C9205	Anticorps primaire conjugué à Cy3. Dilution de travail 1:1000.
Souris monoclonale Vimentin-Cy3	Sigma Aldrich, Allemagne#C9080		Anticorps primaire conjugué à Cy3. Dilution de travail 1:50.
Rabbit polyclonal TUNEL (In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein)	Sigma Aldrich, Allemagne#	11684795910	Anticorps primaire conjugué à la fluorescéine-dUTP. Dilution de travail 1:10 avec une solution tampon enzymatique.

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