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Création et entretien d'une biobanque vivante - Comment nous le faisons

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DOI :

10.3791/62065

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10 avril 2021

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1Department of General, Visceral, Vascular and Transplantation Surgery, University Medical Center Rostock, University of Rostock, 2Molecular Oncology and Immunotherapy, Department of General, Visceral, Vascular and Transplantation Surgery, University Medical Center Rostock, 3Institute of Pathology, University Medical Center Rostock

Dans cet article

Résumé

Dans les travaux suivants, nous décrivons les étapes consécutives nécessaires à l'établissement d'une grande biobanque de cancer colorectal et pancréatique.

Résumé

À la lumière des connaissances croissantes sur les propriétés inter-individuelles et l'hétérogénéité des cancers, le domaine émergent de la médecine personnalisée nécessite une plate-forme pour la recherche préclinique. Au cours des dernières années, nous avons établi une biobanque de cancers colorectaux et pancréatiques comprenant des tissus tumoraux primaires, des tissus normaux, du sera, des lymphocytes sanguins périphériques isolés (PBL), des xénogreffes dérivées du patient (PDX), ainsi que des lignées cellulaires cancéreuses primaires et secondaires. Puisque le tissu tumoral original est limité et le taux d'établissement des lignes primaires de cellules cancéreuses est encore relativement bas, PDX permettent non seulement la conservation et l'extension de la biobanque mais également la génération des lignes secondaires de cellules cancéreuses. En outre, les modèles PDX se sont avérés être le modèle in vivo idéal pour le dépistage préclinique des médicaments. Toutefois, le biobanque nécessite une préparation minutieuse, des lignes directrices strictes et une infrastructure bien adaptée. Des spécimens de colectomy, de duodenopancreatectomy ou de métastases réséqués sont rassemblés immédiatement après résection et transférés au département de pathologie. Respectant la priorité d'un rapport histopathologique impartial, à la discrétion du pathologiste traitant qui effectue les dissections, de petits morceaux de tumeur et des tissus non tumoraux sont récoltés.

Les parties nécrotiques sont jetées et le tissu tumoral restant est coupé en petits cubes identiques et cryopréservé pour une utilisation ultérieure. En outre, une petite partie de la tumeur est hachée et tendue pour la culture primaire de cellules cancéreuses. En outre, des échantillons de sang prélevés sur le patient avant et postopératoirement, sont traités pour obtenir le sérum et les PBLs. Pour l'engraftment PDX, les spécimens cryopréservés sont décongelés et implantés sous-cutanément sur les flancs de souris immunodéficientes. Le PDX résultant récapitule étroitement l'histologie des tumeurs « de donateur » et peut être employé pour la xénogreffe suivante ou cryopréserved pour l'usage ultérieur. Dans les travaux suivants, nous décrivons les différentes étapes de la création, de l'entretien et de l'administration d'une grande biobanque de cancer colorectal et pancréatique. En outre, nous soulignons les détails cruciaux et les mises en garde associés au biobanque.

Introduction

Au cours des dernières années, les connaissances accumulées sur les propriétés morphologiques, cliniques et génétiques des cancers ont mené à la conception du cancer comme une maladie hétérogène et individuelle. Par conséquent, la caractérisation mutationnelle des néoplasmes, outre les caractéristiques cliniques et pathologiques, a gagné en importance pour la prise de décision clinique et de nombreuses thérapies ciblées ont été développées pour diverses altérations moléculaires. Par exemple, l'efficacité du cétuximab dans le traitement du cancer colorectal peut être prédite par l'analyse du statut mutationnel KRAS et PIK3CA 1. La médecine de précision vise une approche sur mesure pour fournir la réponse de traitement la plus élevée chez chaque patient et éviter la toxicité des thérapies inefficaces2. Les biobanques contiennent des tissus, du sang et d'autres matériaux biologiques des patients atteints de cancer, qui sont liés aux données cliniques, et sont donc un excellent outil pour la recherche translationnelle sur le cancer. En raison du grand nombre d'échantillons cliniques, les biobanques permettent la détection de mutations rares, mais potentiellement médicamentables, qui offrent de nouvelles possibilités de traitement pour le patientindividuel 3.

Pour couvrir un spectre de recherche oncologique aussi large que possible, nous n'avons pas limité notre activité sur la seule récolte d'échantillons, mais nous nous sommes concentrés sur l'établissement de lignées cellulaires cancéreuses et de xénogreffes dérivées du patient (PDX). Les lignées cellulaires 2D traditionnelles demeurent la pierre angulaire de la recherche in vitro et sont le premier choix pour les dépistages de médicaments à grande échelle4,5. De plus, l'analyse des lignées cellulaires est souvent plus facile, moins coûteuse et plus facilement accessible. En outre, puisque les lymphocytes périphériques de sang patients-dérivés (PBL) sont disponibles, l'immunologie de tumeur peut également être étudiée in vitro6. Cependant, la majorité des médicaments nouvellement développés avec l'effectivité préclinique prometteuse dans les expériences in vitro ou in vivo basées sur la cellule, ont montré des résultats décevants dans les essais cliniques7. En revanche, les études précliniques basées sur des études in vivo de PDX ont reflété l'activité clinique des agents antineoplastic beaucoup plusfidèlement 8. Puisque le tissu pdx reflète étroitement les propriétés histologiques et moléculaires de la tumeur donneuse, les modèles pdx sont un bon moyen de propager les quantités souvent très limitées de tissu tumoral viable pour maintenir l'intégrité d'une biobanque et permettre l'échange d'échantillons entre les groupes de recherche et les institutions. En outre, les lignées de cellules cancéreuses dérivées du tissu PDX peuvent être établies significativement plus facilement que les lignées primaires de cellules cancéreuses9. Au cours des dernières années, notre groupe de travail a mis sur pied une biobanque intégrée complète contre le cancer colorectal et pancréatique en normalisant et en optimisant par étapes le flux de travail de tous les échantillons biologiques en question (figure 1).

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Figure 1 :Flux de travail et organisation de la biobanque Veuillez cliquer ici pour voir une version plus large de ce chiffre.

Protocole

L'étude suivante a été approuvée par le comité d'examen institutionnel du Centre médical universitaire Rostock (II HV 43/2004, A 45/2007, A 2018-0054, A 2019-0187 et A 2019-0222). En outre, toutes les procédures vétérinaires pertinentes ont été approuvées par les Landesamt für Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit und Fischerei Mecklenburg-Vorpommern sous les numéros d'enregistrement LALLF M-V/TSD/ 7221.3-2-020/17 et 7221.3-1-007/19.

1. Conditions préalables expérimentales

  1. Respecter plusieurs conditions-cadres importantes pour établir et maintenir une biobanque.
    1. Utilisez une clinique avec un service chirurgical et un nombre suffisant de résections oncologiques ainsi qu'un laboratoire bien équipé et un personnel académique suffisant. Une bonne infrastructure et une liaison solide avec un département de pathologie de coopération sont d'autres conditions préalables.
    2. Pour la recherche in vivo, utilisez un établissement pour animaux avec des conditions de logement appropriées aux souris immunodéficientes.
    3. Obtenir l'autorisation d'un comité d'éthique des soins de santé pour toute recherche sur des documents dérivés du patient. Obtenir l'approbation de toute recherche in vivo auprès de l'autorité compétente conformément aux règlements législatifs locaux.

2. Collecte d'échantillons

  1. La veille de la chirurgie
    1. Évaluer tous les patients atteints d'un cancer colorectal ou pancréatique résécable et/ou de métastases correspondantes pour l'admissibilité aux biobanques. Évitez d'inclure les cas de prétraitement néoadjuvant, de tumeurs très petites, de tumeurs d'une dignité incertaine ou de lésions qui ont été partiellement réséquées endoscopiquement auparavant.
    2. Obtenir l'approbation écrite de la participation du patient lors de la discussion de consentement éclairé au sujet de l'intervention chirurgicale. Informer en temps opportun tous les chirurgiens impliqués, l'équipe de laboratoire ainsi que le pathologiste.
  2. Acquisition d'échantillons
    1. Informez tous les préposés de la salle d'opération (OR) de la collecte des tissus de la biobanque immédiatement avant le début de l'intervention chirurgicale.
      REMARQUE : Il est crucial que le tissu ne soit pas fixé en formaline. Si le tissu est immergé dans la formaline, il devient impropre au biobanque intégré.
    2. Tirez 40 mL de sang héparinisé (2 x 20 mL de seringue) ainsi qu'un tube sérique standard de 7,5 mL immédiatement après l'induction anesthésique et transférez-le rapidement au laboratoire pour l'isolement pbl et le traitement du sérum (voir l'étape 3-4).
    3. Obtenez le spécimen réséqué directement de la table d'opération, placez-le dans un récipient approprié et emmenez-le au service pathologique. Notez le point de temps de détachement de la circulation, la résection et l'arrivée à la pathologie.
      REMARQUE : L'aptitude de l'échantillon pour la biobanque doit être évaluée par le pathologiste coopérant qui dissèque une tranche de tumeur et de tissu non malin. N'excisez aucune partie du spécimen par vous-même qui pourrait compromettre le rapport pathologique ultérieur.
    4. Placer les deux morceaux de tissu dans un tube séparé de polypropylène de 15 à 50 mL avec une solution de stockage des tissus de 10 à 30 mL (ou DPBS) sur la glace. Notez l'heure de réception et transférez les spécimens immédiatement au laboratoire.
      REMARQUE : Les étapes suivantes du protocole 3-6 doivent être effectuées dans un cabinet d'écoulement laminaire dans des conditions strictement stériles. Utilisez tous les liquides à température ambiante.

3. Traitement sérique

  1. Centrifugeuse le tube sérique de 7,5 mL à 1128 x g et 4 °C pendant 15 min dans une centrifugeuse pré-refroidie.
  2. Sérum Aliquot 1 mL par tube dans des cryotubes pré-étiquetés et congeler dans de l'azote liquide.

4. Isolement du PBL par centrifugation de gradient de densité

REMARQUE : Travaillez parallèlement à chacune des deux seringues de 20 mL.

  1. Remplir 20 mL de sang héparinisé dans un tube de polypropylène de 50 mL et ajouter 15 mL de DPBS.
  2. Prenez 15 mL de Pancoll avec une pipette sérologique, insérez soigneusement la pipette jusqu'au fond du tube de polypropylène et relâchez le Pancoll très lentement pour former une couche sous la colonne sang/DBPS.
  3. Centrifugeuse à 375 x g pendant 15 min sans frein.
  4. Aspirer et transférer la couche d'interphase opaque entre la colonne médiane et supérieure des deux échantillons dans un nouveau tube en polypropylène de 50 mL et remplir de DPBS à 50 mL.
  5. Centrifugeuse à 270 x g pendant 15 min avec frein.
  6. Aspirer et jeter le supernatant, resuspendre la pastille cellulaire dans 4,5 mL de milieu de congélation.
  7. Aliquot 1,5 mL de suspension par cryotube, fermez les tubes hermétiquement et placez-les dans un récipient de congélation adapté au gel lent et conservez-les à -80 °C.

5. Traitement des tissus

REMARQUE : Commencez par la génération d'échantillons congelés instantanés de tumeurs et de tissus sains pour maintenir l'intégrité des acides nucléiques.

  1. Spécimen de tissu tumoral
    1. Transférer le spécimen de tumeur avec plusieurs mL de solution de stockage de tissu du tube de polypropylène à une boîte de Petri. Rincer à l'aide de DPBS si nécessaire. Évitez de toucher le spécimen et utilisez deux scalpels stériles pour manipuler le tissu. Évitez la dessication à tout moment.
    2. Pesez le spécimen de tumeur sur une échelle commode dans un plat séparé et notez le poids de tissu.
    3. Évaluer la taille, la forme et la qualité tissulaire du tissu tumoral avant de couper. Visez à obtenir au moins une pièce de la taille d'une tête d'épingle pour le gel instantané et quatre cubes d'environ 30 mm3 (longueur de bord 3 x 3x 3 mm) chacun pour une cryopréservation vitale. Générer autant de 30 mm3 -cubes en quadruplés que possible et générer une pièce pour casser la congélation par 5 quadruples. Prenez également en compte que les parties nécrotiques doivent être coupées de sorte que les cubes se composent de tissu vital seulement.
    4. Générer des tranches de 3 mm d'épaisseur. Couper les portions nécrotiques, reconnaissables comme masse gel-like ou liquide, et couper les tranches en cubes des deux tailles désirées.
      REMARQUE : Ne jetez aucun tissu à ce stade.
    5. Gel instantané
      1. Étiquetez les cryotubes en conséquence (voir l'étape 7.7).
      2. Placez un petit morceau de tissu par cryotube pré-étiqueté. Submergez immédiatement les échantillons dans de l'azote liquide pendant plusieurs minutes et conservez-les à -80 °C par la suite.
    6. Cryopréservation des tissus vitaux
      1. Étiquetez les cryotubes en conséquence (voir l'étape 7.7) et remplissez chacun de 1,5 mL de congélateur moyen. Placez le contenant de congélation à côté du banc.
        REMARQUE : Suivez les prochaines étapes le plus rapidement possible. Étant donné que le DMSO dans le milieu du congélateur a des propriétés cytotoxiques, le temps du tissu immergé dans le milieu du congélateur sans refroidissement approprié ne doit pas dépasser 2 minutes.
      2. Disposer les 30 mm3 cubes en quadruplés. Shove tissu nécrotique et d'autres restes au bord du plat, mais ne les jetez pas.
      3. Scoop les cubes avec la lame de scalpel et transférer 4 cubes par cryotube. Assurez-vous que les morceaux de tumeur sont entièrement immergés dans le milieu du congélateur. Fermez les tubes hermétiquement et placez-les dans un contenant de congélation adapté à une congélation lente et conservez-les dans un congélateur de -80 °C.
      4. Transférer les cryotubes dans un système de stockage adapté pour un stockage à long terme à -140 °C ou moins. La documentation dans le système de gestion des stocks de laboratoire est obligatoire.
  2. Spécimen de tissu sain : Répétez les étapes 5.1.1. à 5,1,6,4 pour l'échantillon de tissu sain.

6. Culture cellulaire primaire

  1. Désintégrer les restes du tissu tumoral, y compris la ferraille nécrotique, dans la boîte de Petri avec les scalpels en morceaux aussi petits que possible.
  2. Placer une passoire à cellules stériles (taille de 100 μm de pore) sur un tube de polypropylène de 50 mL.
  3. Utilisez une pipette sérologique pour ajouter 5-10 mL de DPBS à la boîte de Petri, faire flotter les restes de tissu et pipette de haut en bas pour générer une suspension.
  4. Transférer la suspension avec la pipette à la passoire cellulaire.
  5. Répétez les étapes 6.3-6.4 jusqu'à ce que tous les tissus restent sont résolus à partir de la boîte de Pétri.
  6. Utilisez le piston d'une seringue uni sensée de 20 mL pour presser la suspension cellulaire et tissulaire à travers la passoire cellulaire.
  7. Rincer avec 5-10 mL de DPBS frais, jeter la passoire cellulaire et fermer le tube correctement.
  8. Centrifuger la suspension à 180 x g pendant 5-10 minutes.
  9. Préparer un collagène-J précoated 6 plaque de puits avec 1,5 mL de milieu par puits.
  10. Aspirer et jeter le surnatant. Resuspendez la pastille dans 3 mL de DPBS ou moyen et ajoutez 500 μL de la suspension à chaque puits. Placer la plaque dans l'incubateur (100% d'humidité, 5% de CO2,37 °C)
  11. Surveillez quotidiennement la plaque pour la croissance et la contamination des cellules.
    REMARQUE : D'autres cellules de culture jusqu'à l'établissement d'une lignée cellulaire permanente ne sont pas décrites ici.

7. Génération PDX

  1. Effectuez des expériences in vivo uniquement par des personnes dûment qualifiées répondant aux exigences de l'autorité compétente de votre juridiction.
  2. Maison souris immunodéficientes dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes (FPS) répondant aux exigences de la souche de souris utilisée. Les mesures d'hygiène comprennent des cages ventilées individuellement, des aliments autoclavés, de l'eau et du matériel de nidification, ainsi qu'une serrure à air de sécurité et le port d'équipement personnel et protecteur.
  3. Autoclavez tous les instruments à l'avance et n'utilisez qu'un seul ensemble d'instruments pour chaque cas de tumeur afin d'éviter la contamination croisée. Manipulez le tissu tumoral aussi aseptique que possible. Tous les articles en plastique nommés ci-dessous doivent être stériles, à usage unique et jetés après chaque chirurgie.
    REMARQUE : Déterminée par la méthode de congélation de quatre morceaux de tissu tumoral par cryotube, la génération PDX nécessite toujours deux souris par échantillon, ce qui entraîne idéalement quatre tumeurs PDX.
  4. Choisissez la tumeur primaire désirée pour l'engraftment par l'intermédiaire du système de gestion d'inventaire de laboratoire et transférez l'échantillon (tissu tumoral vital préservé) du réservoir principal de stockage à un récipient portatif d'azote liquide (le stockage intermédiaire à -80 °C sur la glace sèche est également commode).
  5. Mettez de l'équipement de protection individuelle avant d'entrer dans la section FPS (gommages, sabots, tablier, housse de cheveux, masque chirurgical et chaussures de survaveuse), désinfectez vos mains et tout l'équipement.
  6. Matrigel trempage
    1. Retirer le cryotube former le récipient d'azote liquide et attendre le dégel de l'échantillon.
    2. Étiquetez un tube de polypropylène de 50 mL et remplissez de 35 mL de DPBS.
    3. Inclinez le cryotube de haut en bas et transférez le contenu immédiatement dans le tube de polypropylène dès que la neige fondante moyenne peut être déplacée. Rincez doucement les morceaux de tissu tumoral, jetez le volume principal du tube dans un récipient séparé, fermez le couvercle et placez le tube sur le côté vers le bas, de sorte que les quatre morceaux de tissu se rassemblent dans le couvercle.
    4. Mettre une boîte de Pétri sur l'accumulateur de refroidissement et placer 100 μL de Matrigel comme une gouttelette unique au milieu. Utilisez des forceps anatomiques pour transférer les morceaux de tumeur dans le Matrigel. Assurez-vous que chaque pièce est entièrement recouverte de Matrigel. Incuber pendant 10 minutes à 4 °C.
  7. Anesthésie de souris (2 souris par échantillon, travail en parallèle)
    1. Préparer un stock de 3:1- d'une solution anesthésique de kétamine (100 mg/mL) et de xylazine (20 mg/mL). La dose recommandée est de 90/6 mg/kg de poids corporel.
    2. Pesez la souris et dessinez la solution anesthésique nécessaire en une seule seringue à insuline à usage unique.
    3. Placez la souris sur la grille de la cage, tirez doucement sa queue d'une main pour induire un mouvement vers l'avant et crabe simultanément le cou avec une poignée pincée de l'autre main. Soulevez la souris de la grille et tournez la main de fixation, de sorte que le dos de l'animal repose sur votre paume. Immobiliser l'une des pattes postérieures avec votre pinky et injecter les narcotiques intraperitoneally. Remettre la souris dans sa cage et attendre l'induction narcotique.
    4. Placez la souris anesthésiée sur la plaque chauffante et couvrez les yeux d'onguent pour éviter les dommages cornéens. Asses la profondeur de l'anesthésie en pinçant doucement le pied arrière de la souris avec des forceps chirurgicaux.
      REMARQUE : L'absence de mouvement indique une narcose profonde. Tout type de mouvement nécessite soit plus de temps pour atteindre la profondeur narcotique désirée ou une dose supplémentaire d'anesthésiques.
  8. Intervention chirurgicale
    1. Former un pli cutané en pinçant le cou de la souris et injecter la puce sous-cutanée avec l'applicateur (Voir l'étape 9 pour les détails de programmation)
    2. Raser les flancs de la souris si nécessaire (lessouris nu/nu NMRI n'ont pas besoin de rasage), appliquer la povidone-iode à l'aide d'un coton-tige et utiliser un drapé chirurgical pour créer un champ stérile.
    3. Soulevez la peau du flanc avec des forceps chirurgicaux, faites une petite incision d'environ 4 mm et formez une petite poche sous-cutanée par une préparation émoussée avec des ciseaux.
    4. Mettez un morceau de tumeur dans chaque poche et placez-le à l'extrémité arrière.
    5. Couper l'extrémité d'une pointe de pipette de 100 μL et aspirer le matrigel restant de la boîte de Pétri et l'appliquer également dans chaque poche de peau.
    6. Fermez les plaies avec de simples sutures interrompues et appliquez un pansement en aérosol.
  9. Scannez la puce et vérifiez la validité de la souris et de la tumeur-ID.
  10. Préparez une nouvelle cage avec de la literie fraîche et du matériel de nidification, ainsi qu'un bâton rongeant. Pliez un « coussin » des serviettes en papier et mentez la souris avec la tête surélevée sous une lampe thermique infrarouge.
  11. Mélanger 0,25 mL de trimethoprim/sulfamethoxazole (400 mg/80 mg) avec 100 ml d'eau potable et administrer par l'intermédiaire de la bouteille. Considérez qu'une souris consomme environ 150 mL par kg de poids corporel par jour.
    REMARQUE : Puisque le PDX-modèle sous-cutané n'est pas associé à la douleur postopératoire, ni pendant le processus de guérison de blessure, ni pendant la excroissance de tumeur, l'analgésie postopératoire n'est pas exigée. Veuillez noter que les lignes directrices sur le bien-être des animaux de votre institution ou autorité peuvent différer.
  12. Surveillance des animaux expérimentaux
    1. Surveillez les souris quotidiennement pour les signes de détresse. Cela peut être délégué à des gardiens d'animaux qualifiés.
    2. Maintenez le traitement antibiotique postopératoire avec le dosage susmentionné pendant 4 semaines. Remplacer le mélange d'antibiotiques deux fois par semaine.
    3. Mesurez la taille de la tumeur au moins une fois par semaine, idéalement tous les jours, avec un étrier (volume tumoral = 0,52 x longueur x largeur x hauteur [mm3])et enregistrez dans la base de données.

8. Récolte et transformation pdx

  1. Récoltez et traiter la tumeur PDX, lorsque :
    La taille de la tumeur atteint le volume cible de 1.500 mm3.
    L'animal porteur de tumeur montre des signes de détresse et/ou de maladie et le traitement est futile.
    La tumeur devient ulcérée ou pénètre dans la peau de la souris.
  2. Lisez la puce pour identifier le PDX correct.
  3. Euthanasier la souris par une méthode légale (selon les directives nationales) comme par exemple co2-asphyxation ou injection de kétamine/xylazine suivie d'une dislocation cervicale.
  4. Soulevez la peau avec des forceps chirurgicaux sur les flancs et incisez avec des ciseaux Metzenbaum à quelques millimètres de la tumeur.
  5. Détachez la peau au-dessus de la tumeur par la préparation émoussée, puis saisissez soigneusement la tumeur avec des forceps anatomiques et détachez la tumeur du fascia superficiel du corps.
  6. Rincez la tumeur avec du DPBS, mettez-la dans une boîte de Pétri et retirez le tissu conjonctif adjacent.
  7. À ce stade, effectuez l'un des éléments suivants :
    1. Couper 30 mm3 cubes et créer un nouveau PDX (Procéder au protocole au point 7.7.4).
    2. Couper la tumeur en tranches, qui sont ensuite transférées sur des cassettes d'histologie et conservées dans 4% de formaldéhyde pour une intégration ultérieure de paraffine.
    3. Préserver la tumeur dans un tube avec une solution de stockage des tissus pour l'ajouter à la biobanque (Procéder au protocole à l'étape 3.) et / ou créer des lignées cellulaires dérivées de PDX (Procéder au protocole à l'étape 4.)

9. Biobanque et gestion des données

  1. Assigner un ID interne à chaque cas de tumeur selon le tableau 1.
Emplacement/nom du laboratoireentité cancérablenombre de cas consécutifsspécificationnombre consécutif
C=colorectal_Met=Métastase
P=pancréatique_Tu=Tumeur
Exemple : HROC389_Met2 = Rostock, cancer colorectal, cas 389, deuxième métastase

Tableau 1 : Définition de l'iD de l'échantillon.

  1. Stockez le consentement du patient sous forme électronique et papier avec la tumeur-ID.
  2. Recueillir autant de données cliniques que possible et les stocker anonymement et séparément.
  3. Utilisez un logiciel de gestion des données (p. ex., Freezerworks) ou autre et créez une interface avec un logiciel d'impression d'étiquettes pour générer des étiquettes de code à barres autodé collage résistantes à la température.
  4. Ajoutez un nouvel échantillon en ouvrant le logiciel de gestion des données, définissez le type d'échantillon et enregistrez les informations suivantes : identification tumorale, type de tissu, méthode de congélation, date, employé responsable, numéro de passage, identification de la souris et souche de souris.
  5. Attribuez les échantillons à des positions spécifiques dans le réservoir de stockage.
  6. Traçage et surveillance du PDX (S'applique à l'étape 7-8)
    1. Utilisez une base de données MS Access (ou un système similaire) sur un appareil portable compatible Bluetooth (ordinateur portable ou tablette) pour enregistrer l'identification tumorale, la date d'implantation, la date d'euthanasie, l'âge et la tension de la souris ainsi que la croissance tumorale au fil du temps.
    2. Connectez le lecteur de micropuce à l'appareil et lisez la puce avant l'implantation.
    3. Attribuez un ID spécifique à chaque souris; nous utilisons le schéma suivant : ( voirle tableau 2 ci-dessous)
    4. Après l'implantation, enregistrez l'ID avec les caractéristiques de la souris dans la base de données.
    5. Relisez la puce et vérifiez si les spécifications de la puce, de la base de données et de l'étiquette cryotube sont cohérentes.
    6. Créez une étiquette pour chaque cage de souris en conséquence.
      REMARQUE : Pour créer un back-up physique, collez les étiquettes cryotube avec les étiquettes de micropuce correspondantes dans un livret et une date de note et une souche de souris.
    7. Pour surveiller la croissance tumorale de l'individu PDX, numérisez la puce de la souris avec le lecteur connecté au dispositif de base de données pour identification et enregistrez la taille de tumeur mesurée par l'étrier chaque semaine.
    8. Planifiez le point de temps idéal de la récolte pdx en analysant la courbe de croissance de la tumeur.
Tumeur-IDStockage antérieur en N2 (=f)Numéro de passage (=T)nombre consécutif de souris (=M)
Exemple : HROP12 fT0 M1 = Rostock, cancer du pancréas, cas 12, généré à partir de tissus primaires congelés, premier passage, souris 1.

Tableau 2 : Définition de l'ID PDX.

Résultats

Entre nos mains, le taux d'établissement des cultures de cellules primaires (Figure 2A & B) était de 12,9% dans une grande série9. La majorité des tentatives d'isoler les cellules tumorales extensibles des spécimens réséqués chirurgicaux frais ont échoué en raison d'un manque d'excroissance ou d'une contamination précoce. L'établissement de la lignée cellulaire a été considéré comme réussi après 3 passages avec une croissance régulière dans des conditions de culture standard (DMEM, 10% FCS, vaisseau de culture standard) et la validation de la différenciation épithéliale via FACS-analyse10. Les lignées cellulaires dérivées de tumeurs PDX (Figure 2C & D) ont montré un taux d'établissement plus élevé de 23,6%, ce qui est également dû à la possibilité de tentatives répétitives contrairement aux tumeurs primaires réséquées9. Toutefois, certaines cultures mixtes (figure 2E) ne peuvent pas être libérées de la croissance fibroblastique ou sont même perdues en raison de la prolifération fibroblastique (Figure 2F).

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Figure 2: Culture cellulaire. Lignées primaires de cellules cancéreuses, dérivées d'une métastase du cas de cancer du côlon HROC313, passage 21 (A) et cas de cancer pancréatique HROP88, passage 5 (B). Lignées de cellules cancéreuses dérivées du PDX du côlon PDX HROC285 T0 M2 (D) et pancréatiques PDX HROP10 T5 M2, passage 4 (E). Culture mixte des fibroblastes et des cellules cancéreuses du cancer du pancréas HROP75, passage 8 (C) et surcroissance fibroblastique (F). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Compte tenu des changements dans le protocole de génération PDX, souches de souris utilisées et aussi expérimentateurs sur plusieurs années, ainsi que de grandes différences dans la quantité de tissu tumoral disponible pour l'engraftment, il n'est pas trivial de donner le taux de réussite global de la génération PDX. Dans une série très récente d'expériences de génération PDX réalisées par deux chercheurs (S.M. et F.B.), des taux de croissance primaire de 63 % pour le PDX colorectal (une histologie exemplaire peut être représentée à partir de la figure 3A)et de 48 % pour le PDX pancréatique(figure 3B)ont été observés. L'repousse des lymphomes murins ou humains au site d'implantation est relativement rare, mais peut imiter la croissance réussie de PDX (figure 3C). Outre l'examen histopathologique, la concordance entre les modèles PDX et leurs patients donneurs a été régulièrement confirmée par une courte analyse de répétition en tandem (STR) (Figure 3D). À ce jour, la biobanque comprend >50 lignées primaires et >50 lignées de cellules cancéreuses pancréatiques primaires et 6 lignées cellulaires pancréatiques secondaires ainsi que des modèles pdx >150 colorectal et 19 modèles pdx pancréatiques.

figure-results-2
Figure 3: Comparaison histologique représentative du PDX colorectal (A) et pancréatique (B). Lymphome humain au site d'implantation imitant la croissance de PDX (C). Test d'identité génétique d'un modèle PDX (HROC430 T1 M2) au tissu tumoral patient d'origine (HROC430Tu) par courte répétition en tandem (STR) analyse. Comparaison des neuf loci STR, vWA, THO1, TPOX, CSF1 PO (colorant FAM) et D5S818, D13S317, D7S820, D16S539 (colorant HEX) utilisant le multiplex PCR avec amorce fluorescente-étiquetée suivant l'électrophoresis capillaire a confirmé la concordance génétique de la PDX et de la tumeur donneuse (D). S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

La génération d'une biobanque vivante présuppose, outre le respect des réglementations légales en matière de vie privée, de droit médical et de bien-être animal, une bonne infrastructure et une équipe bien coordonnée. Il s'est avéré avantageux d'impliquer directement une partie du personnel chirurgical dans les procédures de recherche, car ils peuvent très bien évaluer l'adéquation du patient individuel pour le don de tissus. En outre, les patients ont tendance à consentir avec le biobanque plus fréquemment, lorsque leur approbation écrite est obtenue dans le cadre de la discussion sur le consentement éclairé chirurgical. Pour gagner du temps et des ressources, les cas qui donneront vraisemblablement des quantités insuffisantes de tissu tumoral ne devraient pas être sélectionnés pour le biobancaire. Quand il s'agit de l'acquisition de spécimens, la maxime « la communication est la clé » est une vérité simple, mais souvent négligée. Il suffit d'une seule infirmière de théâtre ou d'un collègue chirurgical non informé pour ruiner le spécimen dès le départ en procédant comme d'habitude et en ajoutant du formaldéhyde à l'échantillon de résection. Par conséquent, il est absolument crucial que chaque membre du personnel concerné se familiarise avec le SOP pour la biobanque. Les chirurgiens devraient être remarqués la veille et dès le début de l'intervention au sujet de la collecte prévue des tissus. De plus, les cas sélectionnés pour le biobanque devraient être mis en évidence dans le plan électronique de la SA. La récolte des tissus de l'échantillon chirurgical doit être effectuée par un pathologiste. Tout d'abord, cela permettra de s'assurer que la récolte des tissus n'interfère pas avec le rapport pathologique final. Deuxièmement, cela augmente la probabilité de recevoir des tissus avec des quantités suffisantes de tissu cancéreux viable. Particulièrement dans les cancers pancréatiques avec une réaction desmoplastic prononcée et les secteurs nécrotiques fréquents, les parties viables sont difficiles à identifier macroscopically pour l'oeil non formé. À titre d'exception à cette règle, les blocs tissulaires provenant de grandes métastases hépatiques ou pulmonales peuvent parfois être excisés « table arrière » par le chirurgien, si les marges chirurgicales peuvent être définies macroscopiquement. Le cancer rectal réséqué par excision mésorectale totale (TME), pourrait ne pas convenir au biobancaire, puisque la récolte de tissu du spécimen réséqué avant l'intégration de paraffine pourrait interférer avec l'évaluation de qualité de TME. Alternativement, le tissu pour le biobancaire peut être acquis par biopsie transanale du cancer rectal.

Les taux d'établissement pour les cultures de cellules primaires dérivées de la tumeur originale sont généralement faibles. Les cultures cellulaires secondaires dérivées du PDX peuvent plus probablement être établies avec succès. Nous recommandons l'essai de différents médias pour chaque cas et l'utilisation des suppléments antibiotiques pour les premiers passages pour réduire la contamination au minimum puisque le tissu récolté est rarement stérile. Après propagation réussie, chaque lignée cellulaire individuelle doit être confirmée comme lignée de cellules cancéreuses par analyse FACS et régulièrement testée pour la contamination par le mycoplasma. Pour exclure la contamination croisée, une analyse régulière de str est conseillée. Il convient de noter que le protocole d'établissement des lignées cellulaires primaires et secondaires est constamment soumis à l'optimisation. Les détails concernant la composition et les taux de réussite des médias simples dépassent clairement le cadre de ce travail et seront publiés séparément.

Pour l'engraftment de PDX, le tissu de tumeur peut être implanté directement après résection ou cryopréservé dans le sérum foetal de calve avec 10% DMSO ou médias semblables de congélation pour l'implantation retardée. L'implantation immédiatement après la récolte de tissu de tumeur met une contrainte sur la logistique et le personnel de laboratoire, et les résultats de xénogreffe après cryopreservation ne sont pas inférieurs du tout 10. En outre, l'incubation du tissu dans Matrigel avant l'implantation de tumeur, augmente de manière significative des taux d'engraftment12. Nous recommandons l'engraftment retardé suivant la conclusion pathologique définie et l'élimination immédiate des spécimens erronément rassemblés de tissu. Puisque le taux de succès de l'engraftment primaire augmente avec l'immunodéficience de la souris destinataire, nous avons tendance à employer des souris de NSG pour le tout premier passage de PDX. Après le premier engraftment réussi de PDX, les sourisnu/nu de NMRI peuvent et devraient être employées pour les passages suivants et l'expansion de tissu. Cette souche est plus robuste, moins chère et plus facile à reproduire par rapport au NSG ou à des souches immunodéficientes similaires, mais montre toujours des taux d'engreffe raisonnables. En outre, sa nudité facilite l'implantation et la surveillance de la croissance tumorale. Pour augmenter les taux d'engraftment dans les passages suivants, nous recommandons le transfert direct des tissus pdx fraîchement récoltés aux souris hôtes chaque fois que possible, particulièrement pour le PDX à croissance lente et les cas avec un taux primaire bas de succès d'engraftment. Collins et Lang ont récemment passé en revue 14 études de l'établissement côlorectal de PDX et ont rapporté des taux d'engraftment variant de 14 à 100% avec un taux médian d'établissement de PDX de 68%, ce dernier étant compatible avec nos résultats13. Conformément à la littérature, nous avons observé des taux d'établissement plus faibles de pancréas par rapport au cancer colorectal PDX14. Indépendamment de la souche de souris hôte et de l'entité tumorale, la croissance des lymphomes à cellules B et des lymphomes murins associés au virus d'Epstein-Barr (EBV) du côté de l'implantation pose un piège important15,16. Si elles ne sont pas reconnues, ces tumeurs peuvent « contaminer » les passages ultérieurs et ainsi confondre les résultats consécutifs. La croissance rapide peu commune de PDX et le gonflement des ganglions lymphatiques cervicaux, axillaires et inguinaux sont des indicateurs forts de la croissance de lymphome murine, mais l'examen histologique régulier de PDX est néanmoins conseillé. En outre, la concordance génétique entre PDX et le patient donneur correspondant devrait être testée régulièrement par analyse STR. Idéalement, la biobanque devrait être liée à une base de données clinique comprenant les caractéristiques des patients (information générale, survie, survie sans rechute, thérapie, néoplasie secondaire, etc.). En raison des réglementations légales en matière de protection de la vie privée et de l'absence d'une telle base de données anonymisée, notre ensemble de données cliniques est régulièrement administré et mis à jour manuellement par les médecins coopérants.

Alors que les biobanques conventionnelles se limitent à la recherche en observatoire, une biobanque vivante offre la possibilité d'interventions in vitro et in vivo. Les lignées cellulaires dérivées du patient sont un outil important pour la recherche fondamentale, les dépistages de médicaments à haut débit et l'évaluation de nouveaux agentspharmaceutiques 4. Les modèles pdx correspondants, cependant, sont d'une importance croissante, puisqu'ils récapitulent étroitement l'histologie de la tumeuroriginale 17,18 et montrent une stabilité génétique élevée sur plusieurs passages19,20. Notre biobanque PDX a fait ses preuves en tant qu'excellente plate-forme pour la recherchepréclinique et fondamentale 6,21. De plus, étant donné que les grandes collections pdx reflètent adéquatement l'hétérogénéité interindéterminée de la population de patients, l'approche de l'essai clinique PDX (PCT) (un animal par modèle par traitement) a gagné en importance pour le développement de médicaments puisqu'elle permet la prédiction fidèle de la réponse clinique aux nouveaux médicaments et au régime combinatoire8. Nous évaluons également actuellement de nouveaux médicaments expérimentaux dans le cas de petits essais sur le PCT.

En dépit de ces résultats prometteurs, la durée médiane d'établissement de 12.2 mois, empêche l'applicabilité clinique des modèles de PDX en tant que « souris d'avatar » pour tester des options de traitement anticancéreux, au moins pour ces patients ayant besoin du traitement immédiat d'adjuvant ou même de neoadjuvant22. Un autre inconvénient des modèles PDX standard est le manque d'utilisabilité pour les tests d'immunothérapie en raison de l'immunodéficience des souris hôtes. Pour surmonter ces limitations, plusieurs souches de souris « humanisées » ont été développées. Ces souris sont fortement immunocompromised, mais peuvent être reconstituées avec divers types de cellules humaines dérivées de moelle ou CD34+ cellules souches hématopoïétiques suivant la excroissance de PDX23,permettant l'évaluation de la cytotoxicité lymphocyte-médiée et de la réponse de thérapie au traitement immunitaire d'inhibiteur de pointde contrôle 24,25.

Au cours des dernières années, les organoïdes d'origine patiente (AOP) sont apparus comme d'importants modèles de cancer en concurrence avec pdx. Dérivées des morceaux intacts de tumeur et cultivés dans un échafaudage extracellulaire de matrice, ces structures tridimensionnelles reflètent étroitement les propriétés histologiques et génétiques de la tumeur originale. La possibilité d'expansion et de cryopréservation à long terme fait de l'AOP un complément idéal d'une biobanquevivante 26,27. En plus d'un taux relativement élevé d'établissement, la prévision fiable de réponse de drogue a été rapportée pour AOP de plusieurs entités detumeur 28. En outre, des PDOs ont même été générés à partir des cellules tumorales circulantes et également l'établissement simultané des organoïdes du tissu sain correspondant est possible, permettant l'évaluation de la toxicité thérapie-connexe sur une basepatient-individu 29,30. Cependant, comparé aux cultures conventionnelles de cellules 2D, la culture organoïde prend du temps et les composés matriciels extracellulaires artificiels peuvent interférer avec certaines procéduresanalytiques 31. En outre, les organoïdes du cancer sont sensibles à la surcroissance par des organoïdes non malins à croissance plus rapide dérivés de l'épithéliumsain 30. En raison d'un manque de stroma, de vaisseaux sanguins et de cellules immunitaires, les PPO sont pour la plupart inapplicables pour l'essai des agents immunothérapeutiques antiangiogéniques. Pourtant, de nouvelles méthodes de culture permettent la modélisation du microenvironnement tumoral in vitro, faisantdes PDA un véritable concurrent pour les modèles PDX32. Dans un proche avenir, les modèles tumoraux patients-individuels, combinés à de puissants outils génétiques comme le séquençage de prochaine génération, ouvriront, espérons-le, la voie vers une véritable médecine de précision et des approches de traitement sur mesure.

Remerciements

Nous reconnaissons volontiers Jenny Burmeister, notre assistante graphique, pour l'enregistrement et le montage de la vidéo. En outre, nous remercions nos collègues du département chirurgical et pathologique pour la collaboration de longue date. Nous tenons également à remercier Marcus Müller, directeur de production du Centre informatique et des médias de l'Université de Rostock, d'avoir fourni l'équipement d'enregistrement audio et d'avoir affiné la qualité sonore.

FINANCEMENT : La Fondation allemande d'aide au cancer (DKH e.V.), le numéro de subvention 108446 et le numéro de subvention TBI-V-1-241-VBW-084 de l'État du Mecklembourg-Vorpommern ont financé en partie cette recherche.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bacillol® ; AF; 1LBode, HartmannREF 973380désinfection
PP tube à centrifuger, 15ml ; stérileGreiner Bio OneGBO Cat. N° :188271tube à centrifuger
Tube à centrifuger PP, 50ml, stérileSarstedt Numéro decommande : 62.547.254tube à centrifuger
BD DiscarditTM II Seringue 20mlBDREF 300296prélèvement sanguin
Sérum 7,5ml Sarstedt MonovetteSarstedtNuméro d’article : 01.1601prélèvement
sanguin Pipette sérologique 10mlSarstedtREF 86.1254.001transfert de liquide
Pipetboy ratiolab® ; accupettaRatiolabNuméro d’article : RL3200300transfert de liquide
PIPETBOY acu 2Integra BiosciencesVWR Cat.No : 613-4438transfert de liquide
DPBS ; sans Ca & MgPan BiotechCat. N° : P04-36500lavage
Pancoll humainPan BiotechCat. N° : P04-60500centrifugation à gradient
de densité DMEM/F12 (Dulbecco' s Aigle modifié Medium)PAN BiotechCat. N° : P04-41500culture cellulaire
FBS Good Forte (Sérum de bovin filtré)PAN BiotechCat. N° : P40-47500culture cellulaire
L-Glutamine 200mMPAN BiotechCat. N° : P04-80100culture cellulaire
Trypsine / EDTAPAN BiotechCat. N° : P10-023100culture cellulaire
DMSO (Dimethyl Sulfoxid for cell culture)PanReac AppliChemVWR Cat.No : A3672.0250congélation
Medium (FCS avec 10 % de DMSO)selfmade---cell freezing
cryotube- CryoPure 2mlSarstedt72380congélation cellulaire
6-Well plaque de culture cellulaire ; stérile ; avec couvercleGreiner bio-oneN° cat. : 657 160cellules
, boîte de Pétri 92 x 16 mm, PS, sans camesSarstedtCat. Réf. : 82.1472.001préparation de tissus
lames chirurgicales stérilesB.Braun (Aesculap)REF BB510préparation de tissus
BD DiscarditTM II Seringue 10mlBDREF 309110
crépine de cellules de préparation de tissus ; jaune ; 100µ ; mFalconREF 352360préparation tissulaire
CoolCellbiocisionNuméro d’article : 210004récipient réfrigérant avec -1° ; C/min
Dewar  ; navire de transport type 27 B, 2 l, 138 mmKGWCat. N° : Système de transport HT39.1
Pointe de pipette 200µ ; lSarstedtREF 70.760.002transfert de liquide
Pointe filtrante 1000µ ; lSarstedtREF 70.762.411de transfert de liquide
200µ ; l, jauneEppendorfCat. N° : 3121 000.082de transfert de liquide
1000µ ; l, bleuEppendorfCat. Réf. : 3121 000.120transfert de liquide
  ; BB 6220 CUHeraeusRéf. cat. : Plaqueculture
51012839 PRÄ ; ZITHERMHarry Gestigkeit GmbH---heating
Microscope Zeiss Primo VertCarl Zeiss MicroImaging GmbHNuméro de série. 3842000839imagerie des cultures cellulaires
Banc stérile Écoulement sûr 1,8 nuncnunc GmbH & Co. KGde travail stérile
-80° ; CKryotec-Kryosafe GmbH---stockage d’échantillons
Balance électronique MP-300Chyo---Scale
BD Micro-fine, U100 seringue à insulineBDREF 324826anesthésique
injectable Rompun 2 %; 25mlNuméro d’agrément Bayer : 6293841.00.00anesthésie
Kétamine 100 mg/ml, 25mlCP-Pharma GmbHnuméro d’agrément : 401650.00.00anesthésie
GES3S LecteurDatamarsnon disponibleLecteur RFID
ISO-Transpondeur FDX-B (1,4x8mm)Peddymark---Puce RFID
Cotrim-ratiopharm® ;   ; Ampullen SF 480  ; mg/5  ; mlRatiopharmPZN-03928197antibiotique eau potable
Plaque chauffante #FM-20 42x28cmDragon---heating
Lampe chauffanteélectrique Petra, Burgau---heating
Pommade pour les yeux et le nez (5 % Dexpanthenol) BepanthenBayerPZN-01578675Protection oculaire
pince à épiler anatomiqueB.Braun AesculapBD21 ORinstruments chirurgicaux
pince à épiler chirurgicaleB.Braun AesculapBD50 1 Rchirurgicaux
ciseauxB.Braun AesculapBC05 6Rinstruments chirurgicaux
aiguille  ; supportB.Braun AesculapBH1 1 OUinstruments chirurgicaux
Prolene 5-0EthiconXN8870. P32matériau de suture chirurgicale
Pansement de pulvérisation perméable à la vapeur d’eau OpsiteSmith& NeveuREF 66004978, PZN- 02063507matériau de suture chirurgicale
Champ d’ouverture adhésive BarrièreREF 904622échange de gaze de tissu OP stérile
Gazin® ;; stérile ; 10x10 cmLohmann& RauscherREF 18506tissu OP stérile
Raucotupf applicateurs à embout en cotonLohmann& RauscherREF 11969applicateur
Corning® ; Matrigel Matrice de membrane basaleCorningN° cat. : 354234Matrice de membrane basale
Solution iodée Braunol (7,5g de povidone iodée)B.Braun Melsungen AGNuméro d’article : 18839désinfection
MACS® ; Solution de stockage de tissusMiltenyi Biotec GmbHN° d’article :130-100-008solution de stockage
Formafix 4 %Grimm med. Logistik GmbHNuméro d’article :solution de fixation
Logiciel FreezerworksBasicDataworks Development, Inc---sample organization
Zebra TLP 2844 imprimanteZebra---label printer
cellulaire Pipette Pipette incubateur de chauffante de cellulaire---congélateur instruments F10010G

Références

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