Présenté ici est un protocole de micro-injection d’embryon Helicoverpa armigera (Hübner) et d’identification de mutant knockout créé par l’édition du génome CRISPR / Cas9. Les insectes mutants permettent de poursuivre les recherches sur la fonction des gènes et l’interaction entre différents gènes in vivo.
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Article de méthode
Microinjection embryonnaire et identification des mutants Knockout de l’Helicoverpa Armigera éditée par le génome CRISPR/Cas9 (Hübner)
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le ver du coton, Helicoverpa armigera, est l’un des ravageurs les plus destructeurs au monde. Une combinaison de génétique moléculaire, de physiologie, de génomique fonctionnelle et d’études comportementales a fait de H. armigera une espèce modèle chez le Lepidoptera Noctuidae. Pour étudier les fonctions in vivo et les interactions entre différents gènes, la technologie d’édition du génome des courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées (CRISPR) / associée à la protéine 9 (Cas9) est une méthode pratique et efficace utilisée pour effectuer des études génomiques fonctionnelles. Dans cette étude, nous fournissons une méthode systématique étape par étape pour compléter l’élimination du gène chez H. armigera en utilisant le système CRISPR / Cas9. La conception et la synthèse de l’ARN guide (ARNg) sont décrites en détail. Ensuite, les étapes suivantes consistant en la conception d’amorces spécifiques à un gène pour la création d’ARN guide (ARNg), la collecte d’embryons, la micro-injection, l’élevage d’insectes et la détection de mutants sont résumées. Enfin, des conseils de dépannage et des notes sont fournis pour améliorer l’efficacité de l’édition de gènes. Notre méthode servira de référence pour l’application de l’édition du génome CRISPR/Cas9 chez H. armigera ainsi que chez d’autres papillons lépidoptères.
Introduction
L’application de la technologie d’édition du génome fournit un outil efficace pour atteindre des mutants de gènes cibles chez diverses espèces. L’émergence du système CRISPR (Clustered Regular Interspaced short palindromic repeats)/Associated Protein 9 (Cas9) fournit une nouvelle méthode pour manipuler les génomes1. Le système CRISPR/Cas9 se compose d’un ARN guide (aRNg) et de l’endonucléase Cas92,3, tandis que l’ARNg peut être divisé en deux parties, un ARN CRISPR complémentaire cible (ARN crnc) et un ARNnc transactivant (tracrRNA). L’ARNg s’intègre à l’endonucléase Cas9 et forme une r....
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Protocole
1. Conception d’amorces spécifiques au gène et préparation de l’ARNg
- Vérifier une région génomique conservée dans le gène d’intérêt grâce à des analyses d’amplification et de séquençage par PCR. Amplifier le gène cible à partir de l’ADN du génome de H. armigera et distinguer les exons et les introns.
REMARQUE: La spécificité de séquence du site guide est nécessaire pour éviter l’édition de gènes hors cible. Les sites guides de recherche possibles dans les exons sont proches de l’UTR 5' du gène. Ensuite, il est important de s’assurer que le gène est complètement non fonctionnel. Un résumé de la trajectoire d’écoulement pour la préparation de l’ARN....
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Résultats
Ce protocole fournit des étapes détaillées pour obtenir des lignées knock-out de gènes de H. armigera à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9. Les résultats représentatifs obtenus par ce protocole sont résumés pour la sélection de l’ADNg, la collecte et l’injection d’embryons, l’élevage d’insectes et la détection de mutants.
Dans cette étude, le site cible de notre gène d’intérêt était situé dans son deuxième exon (
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Discussion
L’application du système CRISPR/Cas9 a fourni un support technique puissant pour l’analyse de la fonction des gènes et de l’interaction entre divers gènes. Le protocole détaillé que nous présentons ici démontre la génération d’un mutant homozygote chez H. armigera via l’édition du génome CRISPR/Cas9. Cette procédure fiable fournit un moyen simple de mutagénèse génique dirigée chez H. armigera.
Le choix des sites cibles CRISPR pourrait affecter l’efficacité de la
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 à GW et 31171912 à CY).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Échelle d’ADN de 2 kb | TransGen Biotech | BM101 | |
| Capillary Glass | World Precision Instrucments | 504949 | désigné sous le nom de « verre capillaire » dans le protocole |
| Double Sided Tape | Minnesota Mining and Manufacturing Corporation | 665 | |
| Eppendorf FemtoJet 4i Microinjector | Eppendorf Corporate | E5252000021 | |
| Micromanipulateur Eppendorf InjectMan 4 | Eppendorf Corporate | 5192000051 | |
| Eppendorf Microloader Pipette Tips | Eppendorf Corporate | G2835241 | |
| GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit | Thermo Fisher Scientific | A29377 | |
| Satellite de microscope | Marque | 7105 | |
| Microscope | Olympus Corporation | SZX16 | |
| PrimeSTAR HS (Premix) | Takara Biomedical Technology | R040 | utilisé pour la détection des mutants |
| Sutter Micropipette Puller | Sutter Instrument Company | P-1000 | |
| TIANamp Genomic DNA Kit | TIANGEN Corporate | DP304-03 | |
| TrueCut Cas9 Protein v2 | Thermo Fisher Scientific | A36499 |
Références
- Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Garneau, J. E., et al. The CRISPR/Cas bacterial immune system cleaves bacteriophage and plasmid DNA. Nature. 468 (7320), 67-71 (2010).
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Réimpressions et autorisations
