Method Article

Microinjection embryonnaire et identification des mutants Knockout de l’Helicoverpa Armigera éditée par le génome CRISPR/Cas9 (Hübner)

DOI:

10.3791/62068

⸱

July 1st, 2021

 ,  ,  ,  ,  , 
1School of Chemical and Environmental Engineering, China University of Mining and Technology, 2State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences, 3Guangdong Laboratory of Lingnan Modern Agriculture, Shenzhen; Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Présenté ici est un protocole de micro-injection d’embryon Helicoverpa armigera (Hübner) et d’identification de mutant knockout créé par l’édition du génome CRISPR / Cas9. Les insectes mutants permettent de poursuivre les recherches sur la fonction des gènes et l’interaction entre différents gènes in vivo.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le ver du coton, Helicoverpa armigera, est l’un des ravageurs les plus destructeurs au monde. Une combinaison de génétique moléculaire, de physiologie, de génomique fonctionnelle et d’études comportementales a fait de H. armigera une espèce modèle chez le Lepidoptera Noctuidae. Pour étudier les fonctions in vivo et les interactions entre différents gènes, la technologie d’édition du génome des courtes répétitions palindromiques régulièrement espacées (CRISPR) / associée à la protéine 9 (Cas9) est une méthode pratique et efficace utilisée pour effectuer des études génomiques fonctionnelles. Dans cette étude, nous fournissons une méthode systématique étape par étape pour compléter l’élimination du gène chez H. armigera en utilisant le système CRISPR / Cas9. La conception et la synthèse de l’ARN guide (ARNg) sont décrites en détail. Ensuite, les étapes suivantes consistant en la conception d’amorces spécifiques à un gène pour la création d’ARN guide (ARNg), la collecte d’embryons, la micro-injection, l’élevage d’insectes et la détection de mutants sont résumées. Enfin, des conseils de dépannage et des notes sont fournis pour améliorer l’efficacité de l’édition de gènes. Notre méthode servira de référence pour l’application de l’édition du génome CRISPR/Cas9 chez H. armigera ainsi que chez d’autres papillons lépidoptères.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’application de la technologie d’édition du génome fournit un outil efficace pour atteindre des mutants de gènes cibles chez diverses espèces. L’émergence du système CRISPR (Clustered Regular Interspaced short palindromic repeats)/Associated Protein 9 (Cas9) fournit une nouvelle méthode pour manipuler les génomes1. Le système CRISPR/Cas9 se compose d’un ARN guide (aRNg) et de l’endonucléase Cas92,3, tandis que l’ARNg peut être divisé en deux parties, un ARN CRISPR complémentaire cible (ARN crnc) et un ARNnc transactivant (tracrRNA). L’ARNg s’intègre à l’endonucléase Cas9 et forme une ribonucléoprotéine (RNP). Avec l’ARNg, l’endonucléase Cas9 peut être dirigée vers un site spécifique du génome via la complémentation de base. Les domaines RuvC et HNH du Cas9 coupent le site cible du génome trois bases avant la séquence protospacer-adjacent motif (PAM) et créent une rupture double brin (DSB). Le clivage de l’ADN peut ensuite être réparé par deux mécanismes, la jonction terminale non homologue (NHEJ) ou la réparation dirigée par homologie (HDR)4. La réparation du DSB introduit des insertions ou des délétions comme moyen d’inactiver le gène ciblé, ce qui peut entraîner une perte complète de la fonction du gène. Par conséquent, la héréditaire et la spécificité du système CRISPR/Cas9 en font une méthode robuste pour caractériser les fonctions des gènes in vivo et analyser les interactions géniques5.

Avec de nombreux mérites, le système CRISPR/Cas9 a été appliqué à divers domaines, y compris la biomédecine6,7, la thérapie génique8,9 et l’agriculture10,11,12, et a été utilisé pour divers systèmes biologiques, y compris les micro-organismes13, les plantes14,15, les nématodes16 et les mammifères17 . Chez les invertébrés, de nombreuses espèces d’insectes ont été soumises à l’édition du génome CRISPR/Cas9, comme la mouche des fruits Drosophila melanogaster et au-delà18,19,20,21,22.

Helicoverpa armigera est l’un des ravageurs les plus destructeurs au monde23 et endommage de nombreuses cultures, notamment le coton, le soja et le sorgho24,25. Avec le développement de la technologie de séquençage, le génome de H. armigera, ainsi que celui d’une gamme d’espèces d’insectes lépidoptères, ont été séquencés complètement26,27,28,29. Un grand nombre de gènes de résistance et de récepteurs olfactifs ont été identifiés et caractérisés à partir de ces insectes au cours des dernières années19,27,28,29. Certains gènes liés à la résistance ont été identifiés chez H. armigera, tels que les gènes codant pour la cadhérine30, un transporteur de cassettes liant l’ATP31,32, ainsi que HaTSPAN133. L’élimination de ces gènes à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 entraîne un niveau élevé de résistance à la toxine Bacillus thuringiensis (BT) chez les souches sensibles. En outre, Chang et al. (2017) ont éliminé un récepteur de phéromones, ce qui a validé sa fonction significative dans la régulation du temps d’accouplement19. Ces rapports suggèrent que CRISPR/Cas9 peut agir comme un outil efficace pour étudier la fonction des gènes in vivo dans les systèmes d’insectes. Cependant, une procédure détaillée pour la modification CRISPR/Cas9 dans les systèmes d’insectes reste incomplète, ce qui limite sa gamme d’applications en génomique fonctionnelle des insectes.

Nous présentons ici un protocole pour éliminer un gène fonctionnel chez H. armigera à l’aide du système CRISPR/Cas9. Un protocole détaillé étape par étape est fourni, y compris la conception et la préparation d’amorces spécifiques aux gènes pour la production d’ARNg, la collecte d’embryons, la microinjection, l’élevage d’insectes et l’identification des mutants. Ce protocole sert de référence précieuse pour manipuler tout gène fonctionnel chez H. armigera et peut être étendu à d’autres espèces de lépidoptères.

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Protocol

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1. Conception d’amorces spécifiques au gène et préparation de l’ARNg

  1. Vérifier une région génomique conservée dans le gène d’intérêt grâce à des analyses d’amplification et de séquençage par PCR. Amplifier le gène cible à partir de l’ADN du génome de H. armigera et distinguer les exons et les introns.
    REMARQUE: La spécificité de séquence du site guide est nécessaire pour éviter l’édition de gènes hors cible. Les sites guides de recherche possibles dans les exons sont proches de l’UTR 5' du gène. Ensuite, il est important de s’assurer que le gène est complètement non fonctionnel. Un résumé de la trajectoire d’écoulement pour la préparation de l’ARNg est illustré à la figure 1.
  2. Choisissez les cibles sgRNA. Utilisez le site web en ligne CRISPR CRISPOR (Version 4.97) (http://crispor.tefor.net/crispor.py) pour rechercher des sites guides possibles dans les exons proches de l’UTR 5' du gène. Entrez la séquence exon dans la zone de texte et sélectionnez le génome cible dans Helicoverpa armigera (Harm_1.0). Choisissez l’option protospacer adjacent motif (PAM) de « 20 bp-NGG » et laissez les autres paramètres sur les paramètres par défaut en fonction des manuels d’utilisation des sites Web.
  3. Comparez les séquences de guidage prédites à partir du logiciel et choisissez la séquence de guide avec l’efficacité prédite la plus élevée et le moins de discordances possible pour améliorer l’efficacité de l’édition et réduire l’édition hors cible. Une séquence guide de 20 pb contenant un ou deux G sur l’UTR 5' est recommandée car elle pourrait augmenter l’efficacité de coupe.
    REMARQUE: Une paire d’ARNg dans les régions exon est également recommandée pour obtenir une délétion de segment important, ce qui simplifie la détection des mutants dans les étapes ultérieures. Assurez-vous que la distance d’espacement entre les deux séquences de guidage sélectionnées est d’au moins 100 pb. Dans ce protocole, nous choisissons la protéine SpCas9 couramment utilisée, qui reconnaît le motif NGG. Selon les instructions du fabricant, la séquence guide dépourvue de G est également acceptable lors du choix du promoteur T7 car le promoteur ajoute un G à l’UTR 5' de la séquence.
  4. Concevoir des oligonucléotides avant et arrière. Réglez l’ordre de séquence sur 5'-20 bp guide sequence-NGG-3' et inversez compléter la séquence de guide. Ajoutez la séquence de promoteur T7 à la séquence de guidage de brin avant et arrière, respectivement selon le guide de l’utilisateur du kit de synthèse d’ARNg.
    REMARQUE: La séquence PAM NGG doit être exclue de la séquence d’oligonucléotides.
  5. Générez l’ARNg à l’aide du kit de synthèse d’ARNg. Ce processus comprend trois étapes : l’assemblage du gabarit d’ADN, la transcription in vitro et la purification de l’ARNg (Figure 2). Effectuez chaque étape conformément aux instructions d’utilisation.

2. Préparation et collecte d’embryons

  1. Séparez les nymphes mâles et femelles comme décrit par Hongtao et al.34 et séparez-les en deux cages en filet différentes. Après l’éclosion, nourrissez-les avec environ 30 mL de solution de sucre blanc à 10 % (p/v) dans du coton absorbant dans une boîte de Pétri.
    NOTE: 3 g de sucre blanc ont été dissous dans 30 mL d’eau stérile pour préparer la solution de sucre blanc à 10% (p / v).
  2. Sélectionnez 50 individus en bonne santé parmi les mâles de 3 jours et les femelles de 2 jours, respectivement, et mélangez-les dans une cage en filet propre. Placez un morceau de coton contenant 10% (p /v) de solution de sucre dans la cage et gardez le coton humide. Couvrez les cages en filet avec de la gaze et fixez la gaze avec un élastique. Vaporisez de l’eau sur la gaze pour rester humide.
  3. Laissez les papillons mâles et femelles sélectionnés à l’étape 2 s’accoupler complètement et observer la quantité de ponte.
    REMARQUE: Le pic de ponte de H. armigera apparaît après 21h00.m. Par conséquent, le moment de l’accouplement doit être pris en compte pour assurer un nombre suffisant d’œufs dans les étapes suivantes. Au pic de la ponte, remplacez la gaze par un chiffon noir et laissez la ponte libre pendant 30 min. Remplacez le chiffon noir toutes les 30 minutes pour la collecte des œufs frais (Figure 3A).
  4. Coupez le tissu noir en taches de forme irrégulière d’une taille d’environ 3 mm. Assurez-vous qu’il y a plus d’œufs sur chaque parcelle.
    REMARQUE: Évitez de choisir des œufs ridés car ils ne sont généralement pas fécondés.
  5. Collez du ruban adhésif double face sur une lame de microscope (25 mm x 75 mm) (Figure 3B). À l’aide de pinces, collez les patchs avec des œufs en rangée sur la surface du ruban adhésif double face. Appuyez sur la marge de chaque patch pour vous assurer qu’ils adhèrent fermement à la bande. Recueillir 50 à 100 œufs par lame de microscope (Figure 3C).
    REMARQUE: Les patchs doivent couvrir toute la surface du ruban adhésif double face, sinon la larve à couver aura du mal à ramper.
  6. Avant la microinjection, gardez la lame du microscope sur la glace pour retarder le développement des embryons.

3. Microinjection d’embryons

  1. Préparez l’aiguille en tirant un verre capillaire à l’aide d’un extracteur de micropipette (Figure 4A). Réglez la chaleur sur 540, tirez sur 80, Vel sur 75, sur le temps sur 170 et sur la pression sur 450. Broyez la pointe de l’aiguille à l’aide d’un micro broyeur. L’aiguille idéale montre une pointe tranchante (Figure 4B).
  2. Préparation de solutions injectables. Ajouter 2 μL de protéine Cas9 commercialisée (1 mg/mL) et d’ARNg (concentration finale de 300-500 ng/μL) à de l’eau sans RNase dans un tube pcR pour obtenir un mélange de volume de 10 μL. Le volume d’ARNg dépend de sa concentration. Bien mélanger en pipetant et mettre sur la glace.
    REMARQUE: Toutes les pointes de pipette et les tubes PCR utilisés dans cette étape sont exempts de RNase.
  3. Définissez les paramètres du micro-injecteur électronique. Réglez la pression d’injection (pi) à 1 500 hPa, le temps d’injection (ti) à 0,1 s et la pression de compensation (pc) à 30 hPa.
  4. Chargez 2 μL du mélange dans une aiguille à l’aide d’une pointe de pipette de micro-chargeur. L’air résiduel dans la pointe de l’aiguille doit être évacué autant que possible.
  5. Connectez l’aiguille d’injection à un micromanipulateur et assurez une connexion étroite entre les deux parties.
  6. Placez une lame dans une boîte de Pétri (100 mm) et placez-la sur la scène du microscope (Figure 5A).
  7. Ajustez la position de la pointe de l’aiguille au microscope optique jusqu’à ce que la pointe de l’aiguille et les embryons soient visibles au microscope (figure 5B).
  8. Réglez le volume de la gouttelette. Appuyez sur la pédale et observez la goutte de liquide à l’extrémité de l’aiguille. Ajustez la pression d’injection du micro-injecteur jusqu’à ce que le volume d’une goutte liquide représente environ un dixième du volume des embryons.
    REMARQUE: La qualité de l’aiguille d’injection est vitale pour le taux de survie des embryons.
  9. Insérez soigneusement la pointe de l’aiguille dans l’hémisphère supérieur d’un embryon à un angle de 45 degrés (Figure 5C). Appuyez sur la pédale pour délivrer le mélange dans l’embryon. L’injection entraîne une légère expansion de l’embryon. Rétractez immédiatement l’aiguille de l’embryon et déplacez la boîte de Pétri d’une main jusqu’à ce que l’embryon suivant soit à proximité de l’aiguille et injectez l’embryon suivant avec la même procédure.
    REMARQUE: L’écoulement cytoplasmique au trou d’épingle est acceptable. Si la fuite cytoplasmique est trop importante, ajustez l’angle de l’aiguille à un angle plus sévère jusqu’à ce que l’écoulement du liquide soit contrôlé.
  10. Injecter au moins 300 embryons pour assurer une quantité suffisante d’éclosion. Couvrir le couvercle de la ou des boîtes de Pétri après l’injection.
    REMARQUE: Le temps entre la ponte et l’injection des 50-100 embryons est limité à 2 h. La plupart des embryons sont encore au stade d’une cellule dans ce laps de temps. En général, il est utile de répéter la procédure de ponte pendant l’injection d’embryons pour favoriser l’efficacité.

4. Élevage d’insectes post-injection

  1. Propagation des embryons G0.
    1. Incuber les embryons à 60% d’humidité relative et 28°C dans une boîte climatique artificielle avec 14 h de lumière/10 h d’obscurité.
    2. Vérifiez le développement des embryons quotidiennement après l’injection. Lorsque la couleur de surface des embryons s’est assombrie, mettez un régime artificiel dans la boîte de Pétri autour de la lame du microscope et vérifiez le développement des embryons toutes les 12 heures.
      REMARQUE: Le régime artificiel est préparé comme décrit par Wu et al.35 et Jha et al.36.
    3. Préparez des plaques de culture de 24 puits et remplissez chaque puits jusqu’à un tiers de sa capacité volumétrique avec un régime artificiel.
    4. Choisissez les larves à couver (figure 5D) à l’aide d’un petit pinceau et transférez-les sur la plaque de culture de 24 puits. Insérez une larve par puits pour vous assurer que chaque larve a suffisamment de nourriture pour survivre.
      NOTE: Les larves de H. armigera ont été élevées individuellement dans chaque puits car elles se cannibalisaient généralement les unes les autres.
  2. Élevage de larves G0
    1. Élevez les larves dans les mêmes conditions que les embryons.
    2. Vérifiez les larves écloses tous les jours. Lorsque les larves atteignent le stade du troisième stade, transférez chaque larve dans une nouvelle dactylèthrae en verre, remplissant un cinquième du volume avec un régime artificiel.
    3. Environ 12 d après l’incubation, les larves matures devraient commencer à se nymphoser.
    4. Les nymphes matures G0 se distinguent en fonction du sexe et sont placées dans des cages séparées avant l’éclosion. Les nymphes du même âge de type sauvage sont également préparées.
  3. G0 adultes en train d’élever
    1. Vérifiez quotidiennement l’éclosion des nymphes sauvages et mutantes.
    2. Transférez les adultes mâles G0 nouvellement éclos et les femelles adultes de type sauvage dans une cage en filet fraîche et établissez le rapport entre le type G0 et le type sauvage à environ 1:1. Fournissez-leur une solution de sucre à 10% (p / v) tombée dans des boules de coton.
    3. Insectes d’élevage utilisant la méthode de routine ci-dessus jusqu’à la nymphose de la première génération (G1).
    4. À l’aide d’une dactylethrae, transférer la paire unique d’adultes G1 nouvellement éclose dans un bocal en plastique (13 cm x 12 cm x 12 cm) fourni avec une solution de sucre à 10% (p / v). Couvrir chaque pot de gaze. Prenez environ 50 paires d’adultes G1 au total.
      NOTE: L’eclosion des papillons femelles est antérieure à celle des papillons mâles. En général, un mâle de 3 jours et une femelle de 2 jours sont sexuellement matures et prêts à s’accoupler. Les adultes nouvellement éclos ne s’accoupleront pas dans leur première période de lumière sans se nourrir.
    5. Recueillir les adultes G1 dans un bocal en plastique après avoir pondu des œufs. Mettez chaque papillon adulte dans un tube de centrifugeuse de 1,5 mL.

5. Détection des mutants knock-out

  1. Concevez une paire d’amorces couvrant le site tronqué prévu. Les amorces doivent être placées à au moins 50 pb de chaque côté (en amont et en aval) du site cible.
    REMARQUE: Les amorces pour l’identification de la séquence cible couvrent souvent de grandes portées pour amplifier efficacement.
  2. Effectuer la réaction pcR à l’aide des amorces de génotypage avec l’ADN du génome extrait dans la section 1. Effectuer un cycle PCR à 95 °C pendant 20 s; 35 cycles de 95 °C pendant 20 s, 55 °C pendant 20 s, 72 °C pendant 1 min; 72 °C pendant 5 min et 4 °C en attente. Vérifier le produit de réaction via un gel d’agarose à 1 % (p/v). La paire d’amorces de détection sélectionnée a été confirmée par la qualité du produit PCR. Si les bandes sont évidentes et spécifiques, les amorces pourraient être utilisées pour une détection ultérieure des mutants en fonction de la taille des amplicons.
  3. Écran pour les personnes potentiellement modifiées. Retirez soigneusement une patte arrière à l’aide d’une pince et placez chaque jambe dans un tube à matrice de lysage, respectivement. Étiquetez le tube de matrice de lysage conformément au nombre sur les dactylètres en verre.
  4. Homogénéiser la patte arrière à l’aide d’un homogénéisateur tissulaire. Réglez la vitesse à 6,0 m/s et le temps à 60 s. Extraire l’ADN génomique de l’échantillon homogénéisé à l’aide d’un kit d’extraction d’ADNg commercial conformément aux instructions du fabricant.
  5. Amplifier le segment de gène à l’aide d’amorces de génotypage avec les mêmes conditions de réaction PCR que celles décrites à l’étape 2. Confirmez le génotype par un service de séquençage de gènes. Une fois que les génotypes mutants G1 (ciblent le même site) contenus dans le même pot ont été détectés, conservez la progéniture G1 et renommez-la en génération deux (G2).
  6. Mettez les individus G1 du même génotype dans une cage en filet. Auto-croisez les progénitures G1 et continuez à dépister en utilisant les mêmes méthodes.
  7. Amplifier le segment de gène et confirmer le génotype avec la même procédure que celle décrite à l’étape 2. Obtenez des lignées homozygotes G2 et maintenez la ligne mutante knock-out.

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Results

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Ce protocole fournit des étapes détaillées pour obtenir des lignées knock-out de gènes de H. armigera à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9. Les résultats représentatifs obtenus par ce protocole sont résumés pour la sélection de l’ADNg, la collecte et l’injection d’embryons, l’élevage d’insectes et la détection de mutants.

Dans cette étude, le site cible de notre gène d’intérêt était situé dans son deuxième exon (

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Discussion

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L’application du système CRISPR/Cas9 a fourni un support technique puissant pour l’analyse de la fonction des gènes et de l’interaction entre divers gènes. Le protocole détaillé que nous présentons ici démontre la génération d’un mutant homozygote chez H. armigera via l’édition du génome CRISPR/Cas9. Cette procédure fiable fournit un moyen simple de mutagénèse génique dirigée chez H. armigera.

Le choix des sites cibles CRISPR pourrait affecter l’efficacité de la

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Disclosures

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ce travail a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (31725023, 31861133019 à GW et 31171912 à CY).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Échelle d’ADN de 2 kbTransGen BiotechBM101
Capillary GlassWorld Precision Instrucments504949désigné sous le nom de « verre capillaire » dans le protocole
Double Sided TapeMinnesota Mining and Manufacturing Corporation665
Eppendorf FemtoJet 4i MicroinjectorEppendorf CorporateE5252000021
Micromanipulateur Eppendorf InjectMan 4Eppendorf Corporate5192000051
Eppendorf Microloader Pipette TipsEppendorf CorporateG2835241
GeneArt Precision gRNA Synthesis KitThermo Fisher ScientificA29377
Satellite de microscopeMarque7105
MicroscopeOlympus CorporationSZX16
PrimeSTAR HS (Premix)Takara Biomedical TechnologyR040utilisé pour la détection des mutants
Sutter Micropipette PullerSutter Instrument CompanyP-1000
TIANamp Genomic DNA KitTIANGEN CorporateDP304-03
TrueCut Cas9 Protein v2Thermo Fisher ScientificA36499

References

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