Analyse de la boucle R par Dot-Blot

Summary

Ce protocole détaille une méthode simple qui quantifie la boucle R, une structure d’acide nucléique à trois brins qui comprend un hybride ARN-ADN et un brin d’ADN déplacé.

Abstract

La structure d’acide nucléique à trois brins, R-loop, est de plus en plus reconnue pour son rôle dans la régulation des gènes. Initialement, on pensait que les boucles R étaient des sous-produits de la transcription ; mais des découvertes récentes faisant état d’une diminution du nombre de R-loops dans les cellules malades ont clairement montré que les R-loops ont des rôles fonctionnels dans une variété de cellules humaines. Ensuite, il est essentiel de comprendre les rôles des R-loops et comment les cellules équilibrent leur abondance. Un défi dans le domaine est la quantification des R-loops car une grande partie du travail repose sur l’anticorps monoclonal S9.6 dont la spécificité pour les hybrides ARN-ADN a été remise en question. Ici, nous utilisons des dot-blots avec l’anticorps S9.6 pour quantifier les R-loops et montrer la sensibilité et la spécificité de ce test avec la RNase H, la RNase T1 et la RNase III qui clivent les hybrides ARN-ADN, l’ARN simple brin et l’ARN double brin, respectivement. Cette méthode est hautement reproductible, utilise des équipements de laboratoire et des réactifs généraux, et fournit des résultats en deux jours. Ce test peut être utilisé dans la recherche et les milieux cliniques pour quantifier les R-loops et évaluer l’effet des mutations dans des gènes tels que la sénatoxine sur l’abondance de R-loop.

Introduction

Ce protocole fournit un guide étape par étape pour un test dot-blot qui permet une évaluation comparative rapide de l’abondance de R-loop, une structure d’acide nucléique à trois brins. La boucle R se forme lorsque l’ARN envahit un ADN double brin pour générer un hybride ARN-ADN et déplace l’autre brin d’ADN. Les R-loops se trouvent à différentes étapes du cycle de vie de l’ARN. Dans le complexe transcriptionnel, l’ARN naissant est synthétisé en complément de l’ADN matrice, et le brin non matrice est déplacé. L’hybride ARN-ADN court (<10 pb) est résolu à libérer l’ARN naissant afin qu’il puisse quitter le complexe ARN polymérase par le canal de sortie ^1,2. En dehors du complexe transcriptionnel, l’ARN naissant est proche de sa matrice d’ADN, qui est encore légèrement déroulée après avoir été copiée, de sorte que l’ARN peut se réhybrider avec sa matrice en formant des boucles R³. De plus, des R-loops peuvent se former lorsque les complexes de réplication et de transcription entrent en collision⁴, et dans la transcription antisens⁵. Compte tenu des nombreuses possibilités de leur formation, les R-loops ne sont pas rares et peuvent être trouvées dans 3 à 5 % du génome humain⁶, selon l’état de transcription de la cellule. Les boucles R se trouvent dans^{les sites 7} et 5 des promoteurs de gènes dans l’ARNm, ainsi que le long de l’ARN ribosomique⁸ et de l’ARN^{de transfert 9}. Les R-loops se trouvent également dans les régions télomériques des chromosomes.

Les R-loops jouent un rôle régulateur. Ils régulent l’expression des gènes en affectant la transcription au niveau des promoteurs^10,11, en médiant la recombinaison de changement de classe¹² et en facilitant l’édition du génome basée sur CRISPR 13,14,15. Comme de nombreux événements cellulaires, l’abondance de la boucle R est étroitement titrée ; trop ou trop peu de boucles R ont un impact sur le fonctionnement normal des cellules^16,17. Les R-loops sont régulés par une variété de protéines, notamment la RNase H, la sénatoxine et d’autres hélicases qui déroulent les hybrides ARN-ADN 18,19,20,21,22.

Pour surveiller l’abondance des R-loops, des méthodes à l’échelle du génome enrichissent d’abord les R-loops avec l’anticorps S9.6 ^8,23,24 ou avec d’autres nucléases²⁵ dont la RNase H 10,26,27, puis évaluent le nombre de R-loops enrichis par séquençage. Les premières versions de ces méthodes basées sur le séquençage n’offraient pas une couverture de séquence adéquate pour permettre une quantification précise, mais l’amélioration rapide des technologies de séquençage permet désormais l’analyse de la boucle R locus par locus. Des techniques d’immunofluorescence ont également été utilisées pour quantifier et localiser les R-loops^10,17. Ces méthodes sont exhaustives, mais elles ne sont pas pratiques dans de nombreux contextes cliniques ou en tant qu’évaluations initiales, car elles nécessitent un équipement coûteux et des analyses spécialisées.

Une procédure qui peut être effectuée uniformément dans tous les laboratoires en milieu clinique est nécessaire. Les dot-blots offrent une telle option car ils peuvent être effectués sans équipement spécifique ni analyse informatique. En tant qu’étape préliminaire ou en milieu clinique pour évaluer les effets des mutations sur les R-loops, ces dot-blots doivent fournir des résultats sensibles et spécifiques. Ici, nous décrivons notre test qui identifie spécifiquement les R-loops ; il exclut les signaux de l’ADN double brin (ds), de l’ARN double brin et de l’ARN simple brin. Notre protocole utilise l’anticorps S9.6²⁷ pour identifier les hybrides ARN-ADN dans les R-loops et intègre la RNase H, une endoribonucléase qui clive et conduit donc à la dégradation de l’ARN dans un hybride ARN-ADN^20,28, pour s’assurer que les signaux détectés sont ceux des hybrides. Nous avons également incorporé la RNase T1 qui clive l’ARN simple brin à la guanine^29,30, et la RNase III qui clive l’ARN double brin, y compris les boucles de tige^31,32 pour vérifier les signaux non spécifiques. L’anticorps S9.6 reconnaît les hybrides ARN-ADN de différentes longueurs, même ceux qui ne font que 8 nucléotides de long³³.

Ici, nous présentons le protocole qui commence par l’isolement des acides nucléiques suivi d’une préparation par transfert de points et d’une détection de boucle R avec l’anticorps S9.6. Notre protocole comprend des étapes pour s’assurer qu’un nombre égal d’échantillons sont chargés et que les signaux sont spécifiques. Il fournit des oligonucléotides pour servir de contrôles positifs et négatifs. Il s’agit d’une méthode rapide, facile et conviviale pour évaluer l’abondance de la boucle R.

Protocol

1. Lyse cellulaire pour le fractionnement nucléaire

1. Lavez deux fois les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Retirez des cellules des boîtes de culture tissulaire à l’aide de techniques standard de dissociation cellulaire telles que la trypsine. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
   REMARQUE : Les étapes décrites ci-dessous ont été utilisées pour l’analyse des fibroblastes primaires de la peau humaine, bien qu’un éventail de types de cellules puisse être analysé. Les fibroblastes ont été cultivés dans un milieu basal contenant 10 % de sérum fœtal bovin. Alternativement, le tampon de lyse cellulaire (tableau 1) peut être ajouté directement à la culture cellulaire après le lavage.
2. Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 1,5 mL pour granuler les cellules.
3. Centrifuger l’échantillon à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer les médias.
4. Lavez deux fois avec de la glace 1x PBS en utilisant les réglages de centrifugation à l’étape 1.3.
5. Ajouter un tampon de lyse à cellules froides (tableau 1) à la pastille cellulaire (300 μL par 2 x 10⁶ cellules). Pipette de haut en bas pour remettre la pastille en suspension.
6. Incuber sur glace pendant 10 min.
7. Faites tourner à 500 x g pendant 5 min pour granuler les noyaux.
8. Jeter le surnageant et remettre la pastille nucléaire en suspension dans 400 μL de tampon de lyse nucléaire froid (tableau 1).
9. Incuber sur glace pendant 10 min.
   REMARQUE : Le fractionnement des compartiments nucléaires et cytoplasmiques des cellules assure la spécificité du signal. La qualité de la séparation nucléaire et cytoplasmique peut être évaluée avant de procéder (Tableau 2).
10. Ajouter 3 μL de protéinase K à 20 mg/mL et incuber pendant 3 à 5 h à 55 °C.
    REMARQUE : Les volumes indiqués sont pour 2 x 10⁶ cellules, augmentez ou diminuez si nécessaire.

2. Purification de l’ADN génomique (qui comprend les hybrides ARN-ADN)

1. Si l’ADN est visqueux, effectuez une sonication pour réduire la viscosité (par exemple, sonication à haute puissance, 30 s ON/30 s OFF, pendant 2 min à l’aide d’un bain-marie à 4 °C).
2. Ajouter 400 μL de tampon d’élution (tableau 1) et 400 μL d’alcool phénol :chloroforme-isoamylique (25:24:1 pH 8,0).
3. Vortex pendant 10 s.
4. Faites tourner à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C.
5. Transférez la phase aqueuse (environ 350 μL) dans un nouveau tube.
6. Extraire une fois à l’aide de 1 volume de chloroforme, agiter pendant 10 s, puis essorer à 12 000 x g pendant 5 min à 4 °C. Transvasez la phase aqueuse dans un nouveau tube (environ 300 μL).
7. Ajouter 35 μL d’acétate de sodium 3 M (pH 5,2), 1 μL de glycogène et 700 μL d’éthanol 100 % glacé.
8. Vortex pendant 10 s et rotation à 12 000 x g pendant 30 min à 4 °C.
9. Lavez la pastille avec 1 ml d’éthanol à 70 %.
10. Vortex pendant 10 s et rotation à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.
11. Jetez le surnageant et laissez sécher la pastille à l’air.
12. Ajouter 12 μL de tampon d’élution et agiter pendant 10 s pour remettre en suspension. Incuber l’échantillon pendant 30 min à 37 °C avec agitation ou à 4 °C pendant la nuit pour remettre la pastille en suspension.
13. Mesurez la concentration d’ADN à l’aide de la spectrophotométrie standard.
    REMARQUE : Les volumes indiqués sont pour 2 x 10⁶ cellules, augmentez ou diminuez si nécessaire. L’ADN (avec des hybrides ARN-ADN) peut être stocké à -20 °C, si nécessaire.

3. Transfert d’échantillons d’ADN (qui comprennent des hybrides ARN-ADN) sur des membranes en nylon

1. Préparez des dilutions d’acides nucléiques aux concentrations souhaitées dans le tampon d’élution (c.-à-d. 50 ng/μL, 25 ng/μL ou 12,5 ng/μL). Ces échantillons avec une gamme de concentrations (200, 100, 50, 25, 12,5 ng) garantissent qu’il y aura des signaux dans la plage linéaire.
   REMARQUE : Assurez-vous de préparer suffisamment d’échantillon pour les réplicats techniques et biologiques, et pour les divers traitements à la RNase, voir l’étape 5.
2. Préparez une membrane en nylon chargée positivement de manière à ce qu’il y ait de la place pour que chaque échantillon de 2 μL occupe une surface de 0,5 cm2.
3. Placez 2 μL de chaque échantillon sur 2 membranes : l’une pour l’anticorps S9.6 et l’autre pour l’anticorps ADNdb. Il est également possible d’utiliser un appareil dot-blot ou slot-blot qui permet de charger des échantillons de plus grands volumes.
4. Laissez les échantillons saturer dans la membrane. Attendez au moins 2 min avant de réticuler la membrane avec la lumière UV.
5. Placez la membrane au centre de l’appareil UV et réticulez la membrane à l’aide d’un réticulant UV à l’aide du réglage « Auto Crosslink » (1 200 μJ x 100).

4. Détection d’un hybride ARN-ADN avec l’anticorps S9.6

1. Incuber la membrane dans une solution bloquante (lait à 5 % dans une solution saline tamponnée au Tris avec 0,05 % de Tween-20 (TBST) pendant 1 h à température ambiante sur un agitateur.
   REMARQUE : Il doit y avoir suffisamment de solution de blocage pour couvrir la membrane.
2. Incuber les membranes pendant la nuit dans de l’anticorps primaire (dans du lait à 5 % dans le TBST) à 4 °C en agitant. Ajouter l’anticorps anti-ADNdb (dilution 1:10 000) à une membrane. Ajouter 1 μg/mL d’anticorps S9.6 dans la deuxième membrane (dilution 1:1 000).
   REMARQUE : L’anticorps S9.6 est disponible dans le commerce ou auprès du Dr S. Leppla, NIAID, National Institutes of Health.
3. Retirez l’anticorps primaire et lavez 3 fois avec du TBST. Effectuez chaque lavage pendant 5 à 10 minutes en secouant à température ambiante.
4. Incuber avec un anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) (anti-souris, dilution 1:5 000) dans du lait à 5 % dans du TBST en agitant à température ambiante.
   REMARQUE : L’anti-ADNdb et l’hybride anti-ARN-ADN sont tous deux des anticorps de souris.
5. Retirez l’anticorps secondaire et lavez-le 3 fois avec du TBST pendant 5 à 10 minutes en agitant à température ambiante.
6. Développer avec des réactifs de chimiluminescence améliorée (ECL) pour acquérir des signaux pour l’imagerie.
7. Quantifiez l’intensité du signal à l’aide d’outils de traitement d’image standard tels que ImageJ.
   REMARQUE : le dépannage est détaillé dans le Tableau 2.

5. Traitements à la ribonucléase pour évaluer la spécificité du signal

REMARQUE : Un traitement par RNase doit être effectué sur les échantillons d’acides nucléiques pour démontrer la spécificité de la liaison S9.6. Le traitement par la RNase H, mais pas par la RNase T1 ou la RNase III, devrait entraîner une réduction de l’immunocoloration S9.6.

1. Digérez les échantillons contenant des hybrides ARN-ADN en les préparant dans quatre tubes séparés. Traitez chacun des 4 échantillons avec de la RNase H 5 U, de la RNase T1 1000 U, de la RNase III 0,5 U ou un simulacre. Incuber des échantillons à 37 °C pendant 15 min dans des volumes de 20 μL.
2. Chargez 2 μL de chaque échantillon sur une membrane comme décrit à la section 3.

6. Préparation de contrôles d’oligonucléotides pour évaluer la spécificité du signal

REMARQUE : Des contrôles d’oligonucléotides peuvent être utilisés pour démontrer la spécificité de la liaison S9.6. S9.6 reconnaît les hybrides ARN-ADN, mais pas les témoins d’ADNdb ou d’ARNdb, comme cela a été rapporté précédemment³⁴.

1. Dissoudre les oligonucléotides (tableau 3) dans un tampon de recuit (10 mM Tris, pH 8,0 ; 50 mM NaCl, 1 mM EDTA) jusqu’à 100 μM.
2. Préparez 4 tubes de réaction pour
   1. Hybride ARN-ADN #1 : Mélangez 10 μL de brin supérieur d’ARNss avec 10 μL de brin inférieur d’ADNsb et 80 μL de tampon de recuit.
   2. Hybride ARN-ADN #2 : Mélangez 10 μL de brin supérieur d’ADNsb avec 10 μL de brin inférieur d’ARNss et 80 μL de tampon de recuit.
   3. ARNdb : Mélangez 10 μL de brin supérieur d’ARNsb avec 10 μL de brin inférieur d’ARNsb et 80 μL de tampon de recuit.
   4. ADNdb : Mélangez 10 μL de brin supérieur d’ADNsb avec 10 μL de brin inférieur d’ADNsb et 80 μL de tampon de recuit.
3. Chauffer les 4 mélanges de l’étape 6.2 à 95 °C pendant 10 min.
4. Laissez les tubes refroidir lentement à température ambiante pour permettre le recuit des brins. Les étalons recuits peuvent être stockés à -20 °C pour une utilisation ultérieure.
   REMARQUE : L’efficacité du recuit doit être vérifiée par électrophorèse sur gel non dénaturant. Les duplex migrent plus lentement que les oligonucléotides non recuits (tableau 2).
5. Chargez 2 μL de chaque échantillon sur 2 membranes, l’une pour l’anticorps S9.6 et l’autre pour l’anticorps ADNdb, comme décrit à la rubrique 3.
6. Effectuez les étapes décrites dans la section 4.

7. Quantification et normalisation de l’intensité du signal de la boucle R S9.6 à l’aide d’ImageJ.

1. Enregistrez des images de S9.6, coloration de l’ADNdb au format TIFF et analysez-les à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).
2. Sélectionnez l’option d’inversion de l’image (Modifier | Inverser). Après l’inversion, chaque point sera visible en blanc sur un fond sombre.
3. Utilisez l’outil de sélection d’image ovale pour sélectionner un ovale suffisamment grand pour entourer le plus grand point de l’image.
4. Utilisez le gestionnaire de retour sur investissement pour ajouter la zone sélectionnée pour la quantification. Assurez-vous que les options « Afficher tout » et « Étiquettes » sont sélectionnées afin que les régions d’intérêt puissent être visualisées.
5. Utilisez la même zone de sélection ovale que celle utilisée à l’étape 7.3 pour ajouter des régions d’intérêt supplémentaires autour de chaque point à quantifier. Utilisez le raccourci Commande + Maj + E pour copier la zone sélectionnée de l’étape 7.3 vers chacun des points suivants.
6. Mesurer la densité intégrée de chacune des régions d’intérêt.
7. Divisez l’intensité du signal S9.6 pour chaque échantillon par la mesure de l’ADNdb pour obtenir le rapport signal S9.6/ADNdb. Vérifiez les résultats en répétant les expériences (au moins des triplés pour l’acquisition du signal S9.6 et de l’ADNdb). L’erreur type de la moyenne peut être calculée à partir des rapports de signal S9.6/dsDNA.

Results

Traitement enzymatique pour évaluer la spécificité de l’anticorps S9.6 (ARN-ADN).
Des fibroblastes primaires de la peau humaine ont été cultivés¹⁷. L’ADN avec des hybrides ARN-ADN a été isolé et quantifié. Deux μg des échantillons ont été digérés avec de la RNase T1, de la RNase H ou de la RNase III pendant 15 min à 37 °C. Un échantillon fictif a également été analysé à des fins de comparaison avec les échantillons traités à la RNase. Les échantillons (200, 100, 50, 25, 12,5 ou 6,25 ng) ont été étalés sur deux membranes différentes, comme décrit à la section 3. Les membranes étaient réticulées, bloquées et l’une d’entre elles a été sondée avec l’anticorps S9.6 (Figure 1A).

Les résultats ont montré que le signal S9.6 est en corrélation avec l’abondance de l’échantillon chargé. Le traitement avec la RNase H, mais pas la RNase T1 ou la RNase III, entraîne une réduction de la coloration S9.6.

Une deuxième membrane a été sondée avec un anticorps ADNdb (Figure 1B) pour la normalisation. L’image J a été utilisée pour analyser les intensités du signal. Les échantillons de 50 ng ont été sélectionnés pour la quantification, car les intensités des signaux des anticorps S9.6 et de l’ADNdb se situaient dans la plage dynamique. Les intensités du signal ont été normalisées à celles des échantillons fictifs. Les données sont présentées à la figure 2.

S9.6 à l’aide de témoins nucléotidiques synthétiques.
Pour évaluer la spécificité de l’anticorps S9.6, nous avons utilisé des oligonucléotides correspondant à l’ARNdb, à l’ADNdb et à l’ARN-ADN comme décrit dans la section 6. Une série de dilutions de nucléotides d’ARN-ADN, d’ARNdb et d’ADNdb a été préparée et appliquée sur la membrane de nylon comme décrit à la section 3. La membrane a été sondée avec l’anticorps S9.6 (Figure 3). Les résultats ont montré que l’anticorps S9.6 se lie spécifiquement aux hybrides ARN-ADN de manière dose-dépendante et a montré une réactivité croisée minimale aux ARNdb et aux ADNdb.

Figure 1 : Spécificité de S9.6 telle que montrée par le dot-blot chargé en acides nucléiques à partir de fibroblastes humains. Des échantillons d’acides nucléiques provenant de fibroblastes humains ont été traités par simulation ou traités avec de la RNase T1, de la RNase H ou de la RNase III, puis chargés sur des membranes en nylon dans une série de dilutions de 200, 100, 50, 25, 12,5 et 6,25 ng par point de 2 μL. Les membranes ont ensuite été sondées avec l’anticorps S9.6 (A) ou l’anticorps ADNdb (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Quantification de la coloration de la boucle R S9.6. Des échantillons de 50 ng de la figure 1 ont été sélectionnés pour la quantification avec ImageJ. Le signal S9.6 a été divisé par l’intensité du signal d’ADNdb, puis normalisé à l’échantillon fictif en suivant les étapes décrites à la section 7. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Transfert de points S9.6 à l’aide de contrôles oligonucléotidiques. S9.6 contre une série de dilutions d’oligonucléotides synthétiques sous forme d’ARNdb, d’ADNdb ou d’hybride ARN-ADN. S9.6 se lie spécifiquement aux hybrides ARN-ADN de manière dose-dépendante. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tampon de lyse cellulaire	Pour 10mL	Pour 200mL	Conc. finale
Eau, sans nucléases	9 ml	180 ml	-
10 % NP-40	0,5 ml	10 ml	0.5%
2M KCl	0,4 ml	8 ml	80 millions d’euros
TUYAUX DE 0,5 M (pH 8,0)	100 uL	2 ml	5 millions d’euros
Tampon de lyse nucléaire	Pour 10mL	Pour 200mL	Conc. finale
Eau, sans nucléases	8,65 ml	173 ml	-
10 % FDS	1 ml	20 ml	1%
1 M de Tris-HCl (pH 8,0)	0,25 ml	5 ml	25 millions d’euros
0,5 M EDTA	100 uL	2 ml	5 millions d’euros
Tampon d’élution	Pour 10mL	Pour 200mL	Conc. finale
1M Tris-Cl, pH 8,5	0,1 mL	2 mL	10 millions d’euros
Eau, sans nucléases	9,9 ml	198 ml	-

Tableau 1. Préparation des tampons

Pas	Problème	Raison possible	Solution
1.9	N/A	Vérifier le fractionnement des cellules	La qualité de la séparation nucléaire et cytoplasmique peut être évaluée en ajoutant des cocktails d’inhibiteurs de protéase standard aux tampons de lyse cellulaire et nucléaire (Tableau 1).  Les fractions cytoplasmiques et nucléaires peuvent être évaluées par western blot pour confirmer la restriction adéquate du marquage avec des marqueurs cytoplasmiques (par exemple, GAPDH ou HSP90) dans les fractions cytoplasmiques et le marquage avec des marqueurs nucléaires (par exemple, HDAC1 ou Histone H3) dans les fractions nucléaires. La contribution de la contamination mitochondriale dans la fraction nucléaire peut être évaluée par analyse qPCR avec des sondes spécifiques de l’ADN mitochondrial.
2.1	L’échantillon est trop visqueux	Le nombre de cellules est trop élevé.	Réduisez l’ADN de moitié et poursuivez avec l’étape de sonication 2.1
2.12	Pas de granulés visibles	Matériau de départ insuffisant ou perte lors de l’extraction.	Commencez depuis le début en utilisant plus de cellules.
2.13	Faible concentration d’ADN
3.1	Pas assez d’ADN pour les dilutions
3.4	L’échantillon ne sature pas la membrane		Trempez la membrane dans 1x TBST. Laissez sécher l’excédent de tampon et commencez à l’étape 3.4
4.6	Un motif inégal ou moucheté est détecté		Ajoutez du dodécylsulfate de sodium (FDS) à 0,1 % à l’échantillon et passez à l’étape 3.1.
4.6	Les points ont une apparence d’anneau de café		Ajouter 0,01 % de Sarkosyl à l’échantillon et poursuivre à l’étape 3.1
5.2	La commande RNaseH ne montre aucune diminution du signal	La digestion de la ribonucléase est incomplète.	Augmenter l’incubation ou augmenter la concentration enzymatique.
6.5	Pas de signal pour les commandes d’oligo	Duplex n’a pas été formé. Les oligonucléotides n’ont pas été correctement recuits.	Vérifiez les rapports entre les oligonucléotides et le tampon de recuit.
6.5	Le signal S9.6 n’est pas spécifique aux hybrides	Le lot d’anticorps S9.6 a une liaison non spécifique	Valider la sensibilité et la spécificité de nouveaux lots d’anticorps S9.6 à l’aide de traitements enzymatiques RNase ou d’une analyse d’oligonucléotides synthétiques.

Tableau 2 : Dépannage

ARNss, brin supérieur	5'-UGGGGGCUCGUCCGGGAUAUGGGAACCACUGAUCCC-3'
ADNsb, brin supérieur	5'-TGGGGGCTCGTCCGGGATATGGGAACCACTGATCCC-3'
ARNss, brin inférieur	5'-GGGAUCAGUGGUUCCCAUCCCGGACGAGCCCCCA-3'
ADNsb, brin inférieur	5'-GGGATCAGTGGTTCCCATATCGGACGAGCCCCCA-3'

Tableau 3. Contrôler les séquences d’oligonucléotides

Discussion

Les acides nucléiques à 3 brins, les R-loops, se forment à différentes étapes du cycle de vie de l’ARN et sont de plus en plus présents pour réguler les processus cellulaires. Pour bien comprendre les R-loops, des techniques fiables de détection des R-loops sont nécessaires. Ici, nous décrivons une approche pour interroger l’abondance des R-loops à l’aide de l’anticorps S9.6 ^8,23,24. Cette méthode permet une évaluation rapide de l’abondance de la boucle R à partir de cellules et d’échantillons de culture tissulaire. Il ne nécessite pas d’équipement spécial, ni une grande quantité de matériau de départ. Il garantit des résultats spécifiques et reproductibles en utilisant une combinaison de traitements RNase.

Certains ont fait part de leurs inquiétudes quant à la spécificité de l’anticorps S9.6. Comme pour tout réactif, il peut y avoir une variabilité d’un lot à l’autre avec l’anticorps S9.6. Notre protocole comprend la RNase H, la RNase T1 et la RNase III pour vérifier la spécificité du signal. De plus, nous utilisons des oligonucléotides synthétiques pour assurer la spécificité de chaque lot d’anticorps S9.6.

La biologie de la boucle R est un domaine en pleine croissance ; le développement de méthodes de détection et de quantification fiables, comme celle présentée ici, facilitera les études mécanistes pour élucider quand les R-loops se forment, comment elles sont régulées et ce qu’elles régulent. Avec des contrôles appropriés, ce test dot-blot est une méthode simple pour dépister l’abondance de la boucle R dans les milieux cliniques et de recherche.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anticorps anti-ADNdb	Abcam	ab27156
Anticorps hybride anti-ARN-ADN (S9.6)	Kerafast	ENH001
Biorupter sonicator	Diagenode	UCD-200
EB Buffer	Qiagen	19086 EDTA 19086
EDTA (0.5M)	Invitrogen	AM9261
Hybond N+ membrane nylon	GE healthcare Life Sciences	RPN203B
KCl (2M)	Invitrogen	AM9640G
NP-40 (Igepal CA-630)	Sigma	I8896
PBS	Invitrogen	10010-023
Phénol :chloroforme :alcool isoamylique	Invitrogen	15593031
PIPES (0.5M, pH 8.0)	VWR	AAJ61406-AE
Proteinase K	Qiagen	19131
RNase III	Invitrogen	AM2290
RNase H	New England Biolabs	M0297
RNase T1	ThermoFisher Sci.	EN0541
FDS (10 %)	Invitrogen	15553027
acétate de sodium (3M, pH 5,2)	Invitrogen	AM9740
Solution saline tamponnée au Tris (10X)	Corning	46-012-CM
Tris-HCl (1M, pH 8.0)	KD Medical	RGF-3360
TrypLE	Invitrogen	12605010
Tween-20	Sigma	P9416
UV Stratalinker 2400	Stratagene	Stratalinker 2400
Stylo de marquage Whatman	Sigma	WHA10499001