Article de méthode

Évaluation fonctionnelle de la perméabilité intestinale et de la migration transépithéliale des neutrophiles chez la souris à l’aide d’un modèle normalisé de boucle intestinale

DOI :

10.3791/62093

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11 février 2021

 ,  , 
1Department of Pathology, University of Michigan, Ann Arbor

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fonction épithéliale intestinale dérégulée de barrière et les immuno-réactions sont des cachets de la maladie d’entrailles inflammatoire qui restent mal étudiées en raison d’un manque de modèles physiologiques. Ici, nous décrivons un modèle intestinal de boucle de souris qui emploie un segment bien-vascularisé et extériorisé d’entrailles pour étudier la perméabilité muqueuse et le recrutement de leucocyte in vivo.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La muqueuse intestinale est tapée d’une seule couche de cellules épithéliales qui forme une barrière dynamique permettant le transport paracellulaire des nutriments et de l’eau tout en empêchant le passage des bactéries luminales et des substances exogènes. Une violation de cette couche entraîne une perméabilité accrue au contenu luminal et au recrutement de cellules immunitaires, qui sont les caractéristiques des états pathologiques dans l’intestin, y compris la maladie inflammatoire de l’intestin (MII).

Des mécanismes régulant la fonction épithéliale de barrière et la migration transepithelial (TEpM) des neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) sont insuffisamment compris en raison du manque de méthodes in vivo expérimentales permettant des analyses quantitatives. Ici, nous décrivons un modèle expérimental murin robuste qui emploie un segment intestinal extériorisé de l’iléum ou des deux points proximaux. La boucle intestinale extériorisée (iLoop) est entièrement vascularisée et offre des avantages physiologiques par rapport aux approches ex vivo basées sur la chambre couramment utilisées pour étudier la perméabilité et la migration pmn à travers les monocouches de cellules épithéliales.

Nous démontrons deux applications de ce modèle en détail : (1) mesure quantitative de perméabilité intestinale par la détection de dextrans fluorescence-marqué dans le sérum après injection intraluminale, (2) évaluation quantitative de PMN émigré à travers l’épithélium intestinal dans le lumen d’intestin après introduction intraluminale des chemoattractants. Nous démontrons la faisabilité de ce modèle et fournissons des résultats en utilisant l’iLoop chez les souris dépourvues de la protéine JAM-A associée à la jonction serrée épithéliale par rapport aux contrôles. JAM-A a été montré pour réguler la fonction de barrière épithéliale aussi bien que PMN TEpM pendant des réponses inflammatoires. Nos résultats à l’aide de l’iLoop confirment les études précédentes et soulignent l’importance de JAM-A dans la régulation de la perméabilité intestinale et du PMN TEpM in vivo pendant l’homéostasie et la maladie.

Le modèle iLoop fournit une méthode hautement normalisée pour les études in vivo reproductibles de l’homéostasie intestinale et de l’inflammation et améliorera considérablement la compréhension de la fonction de barrière intestinale et de l’inflammation des muqueuses dans des maladies telles que les MII.

Introduction

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La muqueuse intestinale englobe une seule couche de cellules épithéliales intestinales conaires (CSI), les cellules immunitaires sous-jacentes de propria de lame et les muqueuses musculaires. Outre son rôle dans l’absorption des nutriments, l’épithélium intestinal est une barrière physique qui protège l’intérieur du corps contre les bactéries commensales luminales, les agents pathogènes et les antigènes alimentaires. En outre, les cellules immunitaires IECs et propria de lame coordonnent la réponse immunitaire induisant la tolérance ou la réponse selon le contexte et les stimuli. Il a été rapporté que la perturbation de la barrière épithéliale peut précéder l’apparition de l’inflammation muqueuse pathologique et contribuer à la maladie inflammatoire de l’intestin (MII) englobant à la fois la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn1,2,3,4,5,6,7. Les individus atteints de colite ulcéreuse présentent une migration transépithéliale excessive (TEpM) de neutrophiles polymorphonucléaires (PMN) formant des abcès de crypte, une conclusion qui a été associée à la gravité de la maladie8,9. Bien que la fonction compromise de barrière épithéliale et les immuno-réactions excessives soient des caractéristiques de IBD, il y a un manque d’essais in vivo expérimentaux pour exécuter des évaluations quantitatives de la perméabilité intestinale et du recrutement de cellules immunitaires dans la muqueuse intestinale.

Les méthodes les plus couramment utilisées pour étudier la perméabilité épithéliale intestinale et pmn TEpM emploient des approches ex vivo à base de chambre utilisant des monocouches IEC cultivées sur des inserts de membrane poreuse semi-perméables10,11,12. L’intégrité de la barrière épithéliale est surveillée soit par des mesures de résistance électrique transépithéliale (TEER), soit par le flux paracellulaire du dextrane marqué par l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) du compartiment apical au compartiment basal13,14,15. De même, le PMN TEpM est typiquement étudié en réponse à un chimioattractant qui est ajouté dans la chambre basse16. Les PMN sont placés dans la chambre haute et après une période d’incubation, les PMN qui ont migré dans le compartiment basal sont collectés et quantifiés. Bien que ces méthodes soient utiles, faciles à réaliser et très reproductibles, elles sont évidemment des approches réductionnistes et ne représentent pas nécessairement un reflet précis des conditions in vivo.

Chez la souris, un dosage courant pour étudier la perméabilité paracellulaire intestinale consiste à gavage oral de FITC-dextrane et mesure ultérieure de l’aspect FITC-dextrane dans le sérum sanguin13,17. L’inconvénient de ce test est qu’il représente une évaluation de l’intégrité globale de la barrière du tractus gastro-intestinal plutôt que celle des contributions intestinales régionales. En outre, le bleu d’Evans est couramment utilisé pour évaluer les fuites vasculaires in vivo18 et a également été utilisé pour évaluer la perméabilité muqueuse intestinale chez la souris et le rat19,20,21. La quantification du bleu d’Evans dans la muqueuse intestinale nécessite une extraction à partir de tissus utilisant l’incubation dans le formamide pendant la nuit. Par conséquent, le même tissu ne peut pas être employé pour étudier la perméabilité épithéliale intestinale et l’infiltration de neutrophile.

Ici nous mettons en évidence un protocole simple qui réduit le nombre d’animaux nécessaires pour collecter des données reproductibles sur la perméabilité muqueuse du côlon et la migration transepithelial de leucocyte in vivo. Nous recommandons donc l’utilisation de FITC-dextrans qui sont facilement discernables dans le sérum sanguin sans compromettre l’intégrité des boucles intestinales qui peuvent être récoltées pour davantage d’analyse. A noter, les boucles ligatures intestinales ont été utilisées chez diverses espèces (dont la souris, le rat, le lapin, le veau) pour étudier les infections bactériennes (telles que Salmonella, Listeria monocytogenes et Escherichiacoli)22,23,24,25 ainsi que la perméabilité intestinale26; cependant, au meilleur de notre connaissance il n’y a aucune étude étudiant des mécanismes de PMN TEpM dans des régions spécifiques dans l’intestin telles que l’iléon ou les deux points qui sont généralement impliqués dans IBD.

Ici nous décrivons le modèle intestinal de boucle intestinale de souris (iLoop) qui est une méthode in vivo microchirurgical robuste et fiable qui emploie un segment intestinal bien-vascularisé et extériorisé de l’iléon ou des deux points proximaux. Le modèle iLoop est physiologiquement pertinent et permet d’évaluer l’intégrité de la barrière intestinale et le PMN TEpM sur des souris vivantes sous anesthésie. Nous démontrons deux applications : 1) quantification des niveaux sériques de 4 kDa FITC-dextrane après administration intraluminale dans l’iLoop 2) quantification de PMN transmigré dans l’iLoop lumen après injection intraluminale du puissant chemottractant LeukotrieneB4 (LTB4)27. De plus, en utilisant le modèle iLoop avec des souris Jam-a-nullou des souris hébergeant une perte sélective de JAM-A sur les IECs (Villin-cre; Jam-a fl/fl)par rapport aux souris témoins, nous sommes en mesure de corroborer des études antérieures qui ont rapporté une contribution majeure pour la protéine JAM-A associée à la jonction serrée à la perméabilité intestinale et à la transmigration des neutrophiles15,28,29,30,31.

Le modèle iLoop est une méthode hautement fonctionnelle et physiologique qui peut être utilisée pour corroborer les essais in vitro. En outre, il s’agit d’un modèle expérimental polyvalent qui permet l’étude de divers réactifs qui peuvent être injectés dans la lumière de l’anse, y compris les chimiokines, les cytokines, les agents pathogènes bactériens, les toxines, les anticorps et les thérapeutiques.

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Protocole

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Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux lignes directrices et aux politiques des National Institutes of Health et approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux de l’Université du Michigan.

1. Préparation préopératoire

REMARQUE: Cette méthode a été générée en utilisant des souris adultes issues de l’expérience génétique C57BL/6, âgées de 8 à 12 semaines. Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions exemptes spécifiques strictes d’agent pathogène avec un accès ad libitum au chow et à l’eau normaux. Les résultats ont été obtenus en utilisant C57BL/6, Jam-a - souris nulles (Jam-a-/-) ou des souris hébergeant une perte sélective de JAM-A sur des CISE (Villin-cre; Jam-afl/fl) et littermate Jam-afl/fl contrôles comme décrit précédemment30.

  1. Préparation de la zone
    1. Effectuez une chirurgie dans un endroit propre. Le modèle de boucle intestinale, cependant, est une chirurgie de non-survie qui ne nécessite pas la technique aseptique/stérile. Observez les pratiques vétérinaires en matière d’assainissement et utilisez des instruments chirurgicaux nettoyés (c.-à-d. frottés au savon, rincés à l’eau suivis d’éthanol à 70 %).
    2. Allumez un tableau chirurgical à température contrôlée (ou des coussins chauffants) et une source de lumière adaptée pour protéger l’animal de l’hypothermie pendant l’anesthésie et la chirurgie.
    3. Préparez des ligatures en coupant des segments de 6 cm de sutures chirurgicales en soie 4-0 non absorbables.
    4. Préparez des gazes de coton (5 cm x 5 cm) qui sont coupées au centre en suivant une forme ellipsoïde. Ceux-ci seront utilisés pour couvrir la laparotomie médiane et empêcher le contact direct entre l’iLoop extériorisé et la fourrure animale. Faites tremper les gazes coupées dans la solution saline équilibrée (HBSS) chaude de Hanks dans un récipient à boîte de Pétri.
    5. Préparez des cotons-tiges humides imbibés de HBSS chaud qui seront utilisés pour manipuler les organes et l’iLoop extériorisé.
    6. Préparez une seringue de 10 ml remplie d’HBSS chaud et fixez-la à une sonde d’alimentation jaune. Cette seringue sera utilisée pour hydrater les tissus exposés pendant la chirurgie et pour rincer doucement l’iLoop du contenu fécal.
  2. Préparation des animaux
    1. Anesthésier l’animal conformément au protocole animal approuvé. Dans ce protocole, un mélange d’isoflurane et d’oxygène est administré par un vaporisateur d’anesthésie. Selon les instructions du fabricant, régler le débit d’oxygène à 1 L/min. Réglez le vaporisateur à 5% et pré-chargez la chambre d’induction. Après 5 min, réduire le vaporisateur d’isoflurane à 2% - 2,5%.
    2. Placez l’animal dans la chambre d’induction pendant 3 min - 5 min, puis transférez l’animal sur une planche de chirurgie chauffée et connectez un bouchon de nosecone d’anesthésie. Retenir l’animal en décubitus dorsal par les quatre membres à l’aide de ruban adhésif.
      NOTA : Comme solution de rechange à l’anesthésie, un mélange de kétamine (80 mg/kg - 100 mg/kg) et de xylazine (5 mg/kg - 10 mg/kg) dilué dans une solution saline (0,9 % de NaCl) peut être administré par injection intrapéritonéale. L’anesthésie doit être maintenue tout au long de la chirurgie par administration intramusculaire de kétamine/xylazine (à 0,1 à 0,25 fois les doses initiales) pour assurer la profondeur anesthésique. S’il est disponible, un vaporisateur d’anesthésie isoflurane est fortement recommandé pour assurer une meilleure reproductibilité, une meilleure capacité de survie et prévenir la douleur animale.
    3. Appliquez une pommade ophtalmique sur les deux yeux pour prévenir la dessiccation cornéenne.
    4. Effectuez un examen physique qui comprend la fréquence cardiaque (environ 500 battements / min) et le rythme, la couleur des muqueuses (rose), le temps de recharge capillaire (< 2 s), la fréquence respiratoire (pas inférieure à 40 - 60 respirations / min) et la température (36,5 ° C)32.
    5. Avant de passer aux étapes suivantes, évaluez la profondeur anesthésique par réflexe de retrait de la pédale. Utilisez un stimulus douloureux (pincement) de la peau entre les orteils et / ou les coussinets des orteils. La souris répondra en contractant et en retirant sa jambe. Ce réflexe de pédale disparaît lorsque l’animal est anesthésié profondément.
      REMARQUE: La surveillance des signes vitaux et le réflexe de pédale sont recommandés tout au long de l’anesthésie au moins toutes les 15 minutes. Les lignes directrices du Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (IACUC) pour l’évaluation de la profondeur anesthésique recommandent la surveillance des éléments suivants: (a) couleur de la queue, du pied et des muqueuses (comme la langue). Couleur rose comme normal et pâle ou bleu comme indicatif d’une diminution de la perfusion sanguine ou d’une détresse respiratoire; b) l’évaluation du schéma respiratoire en tant que respiration régulière par rapport à la respiration irrégulière. Une sonde de température rectale, un oxymètre pour rongeurs et des moniteurs de fréquence cardiaque peuvent être utilisés pour l’évaluation de la température corporelle, du cœur et des fréquences respiratoires, respectivement.

2. Génération de la boucle iléale

  1. Préparation de la peau: Frottez la fourrure de la ligne médiane abdominale avec des tampons d’alcool ou une éponge de gaze imbibée d’éthanol à 70%. Ne mouillez pas une large zone de fourrure avec de l’alcool pour prévenir l’hypothermie.
  2. À l’aide de ciseaux, effectuez une laparotomie médiane. Faites une incision verticale au milieu de l’abdomen (environ 2 cm de long) et exposez le péritoine. Veillez à ne pas blesser les organes intra-abdominaux.
  3. Placez de la gaze de coton humide prédécoupée sur la cavité intra-abdominale exposée.
  4. Utilisez des cotons-tiges humides pour mobiliser et extérioriser le caecum. Placez soigneusement le caecum sur la gaze de coton humide.
    REMARQUE: Le caecum est localisé dans le quadrant caudal gauche de la cavité abdominale chez une majorité de souris indépendantes du sexe de l’animal.
  5. Utilisez des cotons-tiges humides pour mobiliser et extérioriser doucement l’iléon dont la section terminale (extrémité distale) est fixée au caecum(figure 1B).
  6. Déployer au moins 6 cm d’iléon terminal sur la gaze de coton humide sans perturber les vaisseaux mésentériques et l’approvisionnement en sang. L’approvisionnement en sang est maintenu s’il n’y a pas de saignement et que le tissu conserve sa couleur rose(figure 1B).
    NOTA : Évitez de sécher les tissus exposés en maintenant les tissus humides en tout temps avec du HBSS chaud (toutes les 2 à 3 min) à l’aide d’une seringue de 10 mL fixée à une sonde d’alimentation jaune (étape 1.1.6).
  7. Près du caecum, identifiez l’artère principale fournissant l’iléon dans le mésentère. Localisez ensuite deux sites de ligature dans le mésentère qui sont exempts de vaisseaux sanguins critiques.
  8. À l’aide d’une pince tissulaire émoussée, saisissez fermement l’iléon terminal (le plus proche du caecum) et à l’aide d’une pince à pointe fine, fenestratez le mésentère en évitant les vaisseaux sanguins. Placez la suture de soie à travers la perforation et attachez un nœud chirurgical pour créer la première ligature (extrémité distale de la boucle).
  9. Utilisez la règle pour mesurer 4 cm de la première ligature et créer la seconde ligature (extrémité proximale de la boucle) comme mentionné à l’étape 2.8(figure 1C).
  10. Avec des ciseaux fins soigneusement coupés à côté de chaque ligature pour isoler la boucle iléale de 4 cm, en gardant intact l’approvisionnement en sang et la membrane mésentérique.
    REMARQUE: Coupez les deux extrémités du segment extériorisé de l’iLoop, puis rincez doucement comme une étape nécessaire qui empêche l’interférence avec le contenu luminal (matières fécales), facilitant ainsi la dispersion uniforme des stimuli FITC-dextrans ou chimiotactiques sur toute la longueur du segment isolé ainsi que permettant une quantification plus précise des leucocytes par cytométrie de flux. Cette procédure permet également une distension uniforme de la muqueuse après injection de volumes spécifiés de réactif et une meilleure reproductibilité entre les animaux.
  11. Rincer doucement le contenu du segment de la boucle iléale avec du HBSS chaud à l’aide d’une sonde d’alimentation jaune flexible fixée à une seringue de 10 mL (voir étape 1.1.6).
  12. Lilaguez les deux extrémités coupées de la boucle iléale rincée à l’aide d’une suture de soie.
  13. Utilisez une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G pour injecter lentement 250 μL de réactif tel que FITC-dextrans (étape 4.2) ou chimiokine (étape 5.3) dans la lumière intestinale. L’anse iléale va gonfler provoquant une distension modérée de la muqueuse (Figure 1D).
    REMARQUE: Injecter un réactif dans la lumière de la boucle du côté opposé de l’artère mésentérique. Veillez à ne pas retirer la boucle iléale de l’animal lors de l’injection pour éviter de déchirer les vaisseaux sanguins et d’induire des saignements.
  14. À l’aide de cotons-tiges humides, remettez doucement la boucle iléale, l’iléon proximal et le caecum.
  15. Utilisez un porte-aiguille, une pince anatomique et des sutures de soie non absorbables 3.0 avec aiguille de coupe inversée pour fermer la paroi abdominale.
  16. Placez l’animal dans une chambre d’anesthésie à température réglée pendant la période d’incubation.

3. Génération de la boucle proximale du côlon (pcLoop)

Remarque : Pour plus d’informations sur les souris qui ont été utilisées pour la génération du pcLoop, consultez les informations fournies au début de la section de protocole.

  1. Effectuez les étapes 2.1. - 2.4. comme décrit ci-dessus pour la boucle iléale.
  2. À l’aide de cotons-tiges humides, extériorisez tout l’iléon et placez-le sur le dessus d’une gaze de coton humide. Identifier le côlon proximal et l’approvisionnement en sang situé dans le mésocolon. Mobiliser le côlon proximal et en utilisant des pinces à pointe fine créer la première ligature dans une zone exempte de vaisseaux dans le mésocolon à environ 0,5 cm distal du caecum (Figure 2B).
  3. Mesurer 2 cm à partir de la première ligature et créer une deuxième ligature à une zone exempte d’apport sanguin dans le mésocolon (Figure 2C).
  4. À l’aide de ciseaux fins soigneusement coupés à côté de chaque ligature pour isoler un pcLoop de 2 cm de long.
    Remarque : Comme mentionné dans la note à l’étape 2.10, il est important de couper les deux extrémités pour isoler un pcLoop qui est doucement nettoyé du contenu luminal. Coupez soigneusement le tissu du côlon et le mésocolon pour empêcher les petits vaisseaux de saigner dans la lumière intestinale. Si nécessaire, utilisez la cautérisation thermique pour limiter les saignements au site d’incision.
  5. Rincer doucement le pcLoop avec du HBSS chaud pour éliminer les matières fécales à l’aide d’une sonde d’alimentation jaune flexible fixée à une seringue de 10 mL (voir l’étape 1.1.6).
  6. Lir les deux extrémités coupées du pcLoop rincé à l’aide d’une suture de soie.
  7. Utilisez une seringue de 1 mL avec aiguille 30G pour injecter lentement 200 μL de réactif tel que FITC-dextrans (étape 4.2) ou chimiokine (étape 5.3) dans la lumière intestinale. Le pcLoop va gonfler provoquant une distension modérée de la muqueuse (Figure 2D).
    REMARQUE: Injectez le réactif dans le lumen pcLoop du côté opposé de l’artère mésentérique. Assurez la cohérence entre les animaux et créez un pcLoop de 2 cm de long pour assurer une distension égale de la muqueuse.
  8. Utilisez des cotons-tiges humides pour replacer doucement le pcLoop ligature, l’iléon et le caecum dans la cavité abdominale.
  9. Utilisez un porte-aiguille, une pince anatomique et des sutures de soie non absorbables 3.0 avec aiguille de coupe inversée pour fermer la paroi abdominale.
  10. Placez l’animal dans une chambre d’anesthésie à température réglée pendant la période d’incubation.

4. Évaluation quantitative de la perméabilité intestinale : dosage FITC-dextrane de 4 kDa

  1. Effectuez une boucle iléale ou pcLoop (comme décrit ci-dessus).
  2. À l’aide d’une seringue de 1 mL avec aiguille de 30 G, injecter dans la lumière intestinale soit 250 μL (iléon - étape 2.13) soit 200 μL (côlon - étape 3.7) de solution fitc-dextrane à 4 kDa (1 mg / mL dans HBSS). Gardez la solution de FITC-dextrane inutilisée à l’abri de la lumière pour préparer la courbe standard après la collecte du sérum.
  3. Pour la boucle iléale, suivez les étapes 2.14 à 2.16, pour les étapes pcLoop 3.8 à 3.10. Brièvement, mettez les organes et iLoop en place dans la cavité abdominale, fermez la paroi abdominale.
  4. Placez l’animal pendant 120 min dans une chambre d’anesthésie chauffée.
  5. Après la période d’incubation, ouvrez la paroi abdominale, accédez au cœur et effectuez une ponction cardiaque à l’aide d’une seringue de 1 mL avec aiguille 25G pour recueillir le sang. Transférer le sang dans un tube activateur de caillot sérique de 1,3 mL, mélanger doucement et garder sur la glace à l’abri de la lumière. Recueillir au moins 500 μL de sang par souris.
    REMARQUE: Les animaux sont euthanasiés lorsqu’ils sont sous anesthésie en utilisant une méthode physique telle que la décapitation ou la luxation cervicale, et conformément au protocole animal approuvé.
  6. Tube activateur de caillot de sérum centrifuge pendant 5 min à 10 000 x g à température ambiante selon les recommandations du fabricant. Recueillir le sérum (surnageant) et le transférer dans un tube de centrifugation de 1,7 mL. Gardez le tube sur la glace et à l’abri de la lumière.
  7. Quantification de la fluorescence dans le sérum sanguin
    1. Préparer une courbe standard de FITC-dextrane 4 kDa dans le sérum de souris témoins (solution saline ou HBSS est une alternative valable). Créer une dilution sérielle double avec une concentration initiale de 1 mg/mL de FITC-dextrane. Les concentrations mesurées de FITC-dextrane 4 kDa varient entre 0,25 mg/mL et 2 μg/mL.
    2. Transférer un volume égal de l’échantillon et des étalons sur une plaque noire de 96 puits (fond plat) et mesurer le FITC dans un lecteur de plaque de fluorescence (excitation 490 nm, émission 520 nm), conformément aux instructions du fabricant et aux protocoles publiés33. Calculer la concentration de FITC en fonction de la courbe standard ou présenter des valeurs de perméabilité sous forme de changement de pli normalisée au groupe témoin expérimental.

5. Évaluation quantitative du PMN migré dans la lumière intestinale après stimulation intraluminale avec des chimiokines

REMARQUE: Très peu de PMN résident dans la muqueuse intestinale au niveau de base. Le traitement préparatoire des animaux avec des cytokines pro-inflammatoires a comme conséquence un environnement inflammatoire qui facilite le recrutement de PMN de la circulation sanguine dans la muqueuse intestinale.

  1. À l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G, effectuer l’injection intrapéritonéale (i.p.) d’une solution stérile de 100 ng de facteur de nécrose tumorale α (TNFα) et de 100 ng d’interféron-γ (INFγ) dans 200 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  2. Après 4 à 24 h de prétraitement avec des cytokines pro-inflammatoires, effectuez une boucle iléale ou pcLoop (comme décrit ci-dessus).
  3. À l’aide d’une seringue de 1 mL avec une aiguille de 30 G, injecter dans la lumière intestinale soit 250 μL (iléon - étape 2.13) ou 200 μL (côlon - étape 3.7) de solution chimioattractante Leukotriene B4 (LTB4)1 nM dans HBSS.
    REMARQUE: Leukotriene B4 (LTB4)est employé dans ce protocole comme chemoattractant efficace pour PMN. D’autres chimioattractants tels que le ligand chimiométhionyl-leucyl-phénylalanine (fMLF) ou la chimiokine (motif C-X-C) 1 (CXCL1/KC) peuvent également être utilisés pour induire un recrutement significatif de PMN dans la lumière du côlon30.
  4. Pour la boucle iléale, suivez les étapes 2.14 à 2.16. Pour le pcLoop, suivez les étapes 3.8 à 3.10. Brièvement, mettez les organes et iLoop en place dans la cavité abdominale, fermez la paroi abdominale.
  5. Placez l’animal pendant 60 min dans une chambre d’anesthésie chauffée.
  6. Collecte du contenu de la boucle intestinale
    1. Préparer les solutions et les conserver sur la glace : Pour la boucle iléale et le pcLoop, préparer un tampon de lavage contenant 2 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), 5 mM de dithiothreitol (TNT) et 2 % de FBS dans du PBS stérile sans calcium ni magnésium.
    2. Après la période d’incubation et sous anesthésie, ouvrez la paroi abdominale et retirez l’iLoop (boucle iléale ou pcLoop). Euthanasier les animaux lorsqu’ils sont sous anesthésie en utilisant une méthode physique telle que la décapitation ou la luxation cervicale, et conformément au protocole animal approuvé.
    3. Boucle de rinçage avec du PBS froid pour éliminer tout contaminant sanguin résiduel et absorber l’excès de PBS avec des lingettes tissulaires. Recueillir soigneusement le contenu de la boucle dans un tube à centrifuger de 1,7 mL (environ 250 μL pour la boucle iléale et 200 μL pour pcLoop). Rincer la boucle avec un tampon de lavage à froid de 500 μL et, immédiatement après la collecte, placer le tube sur de la glace.
      REMARQUE: La TNT aide à dissoudre le mucus. Si le contenu luminal d’iLoop est très visqueux (selon le fond génétique de la souris), diluez-le 1:2 ou 1:3 avec un tampon de lavage contenant de la TNT.
    4. Faire passer la solution à teneur en luminal à travers un filtre à mailles en nylon de 35 μm à l’aide d’un tube à fond rond de 5 mL avec capuchon de passoire cellulaire. Cette étape aide à éliminer les fragments de tissu et les agrégats cellulaires. Rincez la passoire cellulaire avec 1 mL de tampon de lavage.
    5. Tube centrifuge à 400 x g pendant 5 min à 4 °C. Jeter le surnageant, rincer la pastille avec un tampon de lavage de 500 μL à 1 mL, puis centrifuger à 400 x g pendant 5 min, 4 °C.
    6. Ressusciter la pastille de cellules luminales iLoop dans 200 μL de tampon de cytométrie en flux (FCB) contenant 2 % de FBS dans du PBS stérile sans calcium ni magnésium. Les cellules peuvent être conservées dans un tube ou transférées sur une plaque inférieure ronde de 96 puits pour la coloration et l’analyse de cytométrie en flux.
  7. Coloration et analyse de cytométrie en flux
    1. Contrôles de compensation : globules blancs
      1. Préparer une seringue de 1 mL avec une aiguille de 25 G préremplie d’EDTA stérile de 0,5 M (pH 8,0). 10 % d’EDTA par volume sanguin prévu (100 μL d’EDTA pour 1 mL de sang).
      2. Recueillir le sang sous anesthésie par ponction cardiaque. Transférer le sang dans un tube de 1,7 mL, puis centrifuger à 400 x g pendant 10 min, 4 °C.
        REMARQUE: Pendant que la souris est sous anesthésie, utilisez une méthode physique pour confirmer la mort conformément au protocole animal approuvé (comme la luxation cervicale).
      3. Aspirez le surnageant. Ressusciter le culot dans 1 mL de tampon de lyse ammonium-chlorure-potassium (ACK) pour la lyse des globules rouges. Incuber pendant 3 min - 5 min sur la glace. Centrifuger 400 x g pendant 5 min, 4 °C. Si la pastille est toujours rouge, répétez cette étape du tampon de lyse ACK jusqu’à ce que la pastille devienne blanche.
      4. Ressusciter le culot dans 1 mL FCB et plaque 0,5 x 106- 1 x 106 de cellules par puits. Préparez cinq puits d’une plaque à fond rond de 96 puits. Placez la plaque sur de la glace.
        Remarque : utilisez la même plaque de 96 puits qui contient le contenu luminal de boucle (voir étape 5.6.6).
    2. Coloration par cytométrie de flux
      1. Centrifuger la plaque de 96 puits pendant 5 min à 400 x g,4 °C. Jeter le surnageant et les ressusciter avec 50 μL de CD16/CD32 purifié anti-souris pour rat sous forme de bloc Fc (1 μg par 100 μL de FCB). Incuber pendant 5 min - 10 min sur la glace.
      2. Immunomarquage de la teneur en luminal iLoop : Préparer un mélange contenant tous les anticorps conjugués au fluorochrome (dilution 1:50 dans fcb) : anti-CD45-PerCP, anti-CD11b-PE et anti-Ly-6G-Alexa Fluor 647. Ajouter 50 μL de la combinaison par puits, pour un volume final de 100 μL.
      3. Immunomarquage des globules blancs pour les compensations (dilution de 1:50 dans le FCB) : Utiliser 50 μL de FCB seul (échantillon non coloré, puits 1), 50 μL de chaque anticorps conjugué au fluorochrome individuel (puits 2 à 4), 50 μL de la combinaison de tous les anticorps conjugués au fluorochrome (puits 5). Volume final de 100 μL.
      4. Incuber la plaque pendant 30 min sur de la glace à l’abri de la lumière.
      5. Centrifuger la plaque pendant 5 min à 400 x g,4 °C. Jeter le surnageant et laver avec 200 μL de FCB. Répétez cette étape de lavage deux fois.
      6. Ajouter 150 μL/puits fcb aux échantillons de sang.
      7. Ajouter 100 μL/FCB de puits à l’échantillon de teneur en luminal iLoop. Puis 50 μL/puits de billes fluorescentes.
    3. Analyse cytométrique de flux
      1. Porte pour les événements positifs CD45 et pour l’expression de Ly-6G-/Gr-1 et CD11b30.
      2. Utilisez 100 μL du volume de l’échantillon comme condition d’arrêt.
      3. Calculer le nombre absolu de PMN qui a migré dans le lumen iLoop en suivant les informations fournies par le fabricant des billes de comptage fluorescentes.
        NOTA : Les données peuvent être présentées comme (1) le nombre total de NMP dans la lumière30,34,35,(2) le nombre de NMP par gramme de tissu ainsi que (3) le nombre de NMP parmm3 en utilisant la formule pour le volume d’un cylindre : V= π(pi) r 2 h (V pour le volume, r pour le rayon et h pour la hauteur).

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Résultats

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Une représentation schématique des modèles de boucle iléale et de pcLoop est représentée à la figure 1 et à la figure 2,respectivement. Les images anatomiques montrent les étapes critiques de la procédure, y compris l’extériorisation du segment intestinal(figure 1B et figure 2B),l’identification d’un emplacement approprié pour les ligatures qui permet une perturbation minimale de l’appr...

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Discussion

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Les mécanismes responsables du dysregulation de la fonction intestinale de barrière et du recrutement de cellules immunitaires dans des conditions pathologiques telles que IBD sont incomplètement compris. Ici, nous détaillons un modèle murin in vivo robuste qui emploie un segment intestinal extériorisé bien vascularisé de l’iléon ou du côlon proximal et permet l’évaluation de la perméabilité intestinale, des études de migration des neutrophiles ainsi que d’autres applications.

L’iLoop est une ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs remercient le Dr Sven Flemming de l’Université de Wuerzburg pour ses contributions à l’établissement du modèle de boucle proximale du côlon, Sean Watson pour la gestion des colonies de souris et Chithra K. Muraleedharan pour avoir aidé à l’acquisition des images du modèle iLoop. Ce travail a été soutenu par la Fondation allemande pour la recherche/DFG (BO 5776/2-1) à KB, R01DK079392, R01DK072564 et R01DK061379 à C.A.P.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Équipement et matériel
Tampons imbibés d’alcoolBD326895
Aiguille BD PrecisionGlide, 25G x 5/8305122AiguilleBD
PrecisionGlide, 30G x 1/2"BD305106
BD Seringue à tuberculine 1ml sans aiguilleBD309659
Tube à centrifuger 15mlCorning14-959-53A
Microplaque en polystyrène noir solide à 96 puitsFisherScientific07-200-592
Plat de culture non traité Corning, 10cmMilliporeSigmaCLS430588
Applicateur à embout en coton (coton-tige), 6", stérileFisherScientific25806 2WC
Dynarex Éponges de gaze remplies de coton, Non stérile, 2 » x 2Medex3249-1
EZ-7000 vaporisateur d’anesthésie (système classique, y compris les unités de chauffage)E-Z SystemsEZ-7000
Falcon Centrifuge Tube 50ml  ;VWR21008-940
Fisherbrand Ruban d’étiquetage coloréFisherScientific15-901-10R
Porte-aiguille Halsey (porte-aiguille)  ;FST12001-13
Kimwipes, petit (lingette tissuFisherScientific06-666
1.7ml Tubes de microcentrifugation  ;Thomas Scientific  ;c2170
Micro Tube 1.3ml Z (tube activateur de caillot sérique)Sarstedt  ;41.1501.105
Moria Ciseaux finsFST14370-22
5ml Tube à fond rond en polystyrène avec capuchon de filtre cellulaire (35 µ ; m maille de nylon)Falcon352235
Puralube Pommade vétérinaire, lubrifiant oculaire stérileDechra12920060
Pince à anneau (pince à tissus émoussés)FST11103-09
Roboz Surgical 4-0 Silk Black Braided, 100 YDFisherScientificNC9452680
Semken Forceps (pince anatomique)FST1108-13
Sofsilk Suture noire enduite non résorbable en soie tressée Taille 3-0, 18", Aiguille 19mm longueur 3/8 cercle coupe inversée  ;HenryScheinSS694
Pince fine d’Etudiant, coudéeFST91110-10
Seringue 10ml PP/PE sans aiguilleMillipore Sigma  ;
96 Well Cell Culture Plate Corning3799
Tubes d’alimentation jaunes pour rongeurs 20G x 30 mmInstechFTP-20-30
Solutions and Buffers
Accugene 0.5M EDTALonza51201
Tampon de lyse ammoniaque-chlorure-potassium (ACK)BioWhittaker10-548E
Solution saline équilibrée Hanks'Corning21-023-CV
Solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésiumCorning21-040-CV
Strong>Reagents
Alexa Fluor 647 Anti-Mouse Ly-6G Anticorps (1A8)BioLegend127610
CD11b Anticorps monoclonal, PE, eBioscience (M1/70)ThermoFisher12-0112-81
CountBright Perles de comptage absoluesInvitrogenC36950
DithiotreitolFisherScientificBP172-5
Sérum de veau fœtal, R& D Systems511550
Fluorescéine Isothiocyanate-Dextran, poids moléculaire moyen 4.000Sigma60842-46-8
IsofluraneHalocarbure12164-002-25
Leucotriène B4Millipore Sigma71160-24-2
PerCP Rat Anti-Souris CD45 (30-F11)BD Pharmingen557235
Rat purifié Anti-souris CD16/CD32 (bloc BD FC de souris)BD Bioscience553142
Souris recombinante IFN-&gamma ;Peprotech315-05
Souris recombinante TNF-& alpha ;Peprotech315-01A
"")Z248029<

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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Migration des neutrophilesbarri re pith lialejonctions serr esessai au FITC dextranmaladie inflammatoire chronique de l intestincytom trie en fluxprot ine JAM A

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