Imagerie de faisceaux stéréocilaires avec résolution à l’échelle nanométrique dans des cellules ciliées auditives de mammifères vivants

Résumé

Nous présentons ici un protocole pour la microscopie à conductance ionique à sonde sautillante (HPICM), une technique de sonde à balayage sans contact qui permet l’imagerie à l’échelle nanométrique des faisceaux de stéréocils dans les cellules ciliées auditives vivantes.

Résumé

Les cellules ciliées de l’oreille interne détectent les déplacements induits par le son et transduisent ces stimuli en signaux électriques dans un faisceau de cheveux constitué de stéréocils disposés en rangées de hauteur croissante. Lorsque les stéréocils sont déviés, ils tirent sur de minuscules liens extracellulaires (~ 5 nm de diamètre) interconnectant les stéréocils, qui transmettent des forces aux canaux de transduction mécanosensibles. Bien que la mécanotransduction ait été étudiée dans les cellules ciliées vivantes pendant des décennies, les détails ultrastructuraux fonctionnellement importants de la machinerie de mécanotransduction aux extrémités des stéréocils (tels que la dynamique des liens de pointe ou le remodelage des stéréocils dépendant de la transduction) ne peuvent encore être étudiés que dans les cellules mortes avec microscopie électronique. Théoriquement, les techniques de sonde à balayage, telles que la microscopie à force atomique, ont une résolution suffisante pour visualiser la surface des stéréocils. Cependant, indépendamment du mode d’imagerie, même le moindre contact de la sonde de microscopie à force atomique avec le faisceau stéréocileux endommage généralement le faisceau. Nous présentons ici un protocole détaillé pour l’imagerie par microscopie à conductance ionique à sonde sautillante (HPICM) de cellules ciliées auditives de rongeurs vivants. Cette technique de sonde à balayage sans contact permet l’imagerie en accéléré de la surface de cellules vivantes avec une topographie complexe, comme les cellules ciliées, avec une résolution d’un nanomètre et sans entrer en contact physique avec l’échantillon. Le HPICM utilise un courant électrique traversant la nanopipette en verre pour détecter la surface de la cellule à proximité de la pipette, tandis qu’un système piézoélectrique de positionnement 3D scanne la surface et génère son image. Avec HPICM, nous avons pu imager des faisceaux de stéréocils et les liens interconnectant les stéréocils dans des cellules ciliées auditives en direct pendant plusieurs heures sans dommages notables. Nous prévoyons que l’utilisation de l’IHMHP permettra d’explorer directement les changements ultrastructurels dans les stéréocils des cellules ciliées vivantes pour mieux comprendre leur fonction.

Introduction

Malgré le fait que les faisceaux de stéréocils dans les cellules ciliées auditives sont assez grands pour être visualisés par microscopie optique et déviés dans des cellules vivantes dans une expérience de pince à patch, les composants structurels essentiels de la machinerie de transduction tels que les liens de pointe ne pourraient être imagés qu’avec la microscopie électronique dans les cellules mortes. Dans les cellules ciliées auditives des mammifères, la machine de transduction est située aux extrémités inférieures des maillons de la pointe, c’est-à-dire à l’extrémité des stéréocils de la rangée plus courte¹ et régulée localement par la si....

Protocole

L’étude a été réalisée conformément aux recommandations du Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health. Toutes les procédures animales ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Kentucky (protocole 00903M2005).

1. Fabrication et test des nanopipettes

1. Créer un programme dans l’extracteur de micropipette pour obtenir des pipettes avec une résistance comprise entre 200 et 400 MΩ, ce qui correspond à des diamètres de pointe intérieurs d’environ 50-70 nm. Les paramètres dépendront de l’extracteur de micropipette. P....

Résultats

Le protocole présenté dans cet article peut être utilisé pour visualiser toutes les cellules vivantes avec une topographie complexe. En suivant ces étapes, nous obtenons régulièrement des images de faisceaux de cellules ciliées auditives de rats vivants (Figure 6B, D). Bien qu’ayant une résolution X-Y inférieure à celle des images SEM, nos images HPICM peuvent résoudre avec succès les différentes rangées de stéréocils, la forme des extrémités des stéréocils et même les petit.......

Discussion

Pour obtenir des images HPICM réussies, les utilisateurs doivent établir un système à faible bruit et à faible vibration et fabriquer des pipettes appropriées. Nous recommandons fortement l’utilisation d’étalons d’étalonnage AFM pour tester la stabilité du système avant d’essayer d’effectuer une imagerie de cellules vivantes. Une fois la résolution du système testée, les utilisateurs peuvent envisager d’imager un organe fixe d’échantillons Corti pour se familiariser avec les paramètres d’imagerie avant de tenter toute im.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Oscilloscope analogique	B& K Precision	2160C	Oscilloscope analogique pour la surveillance en temps réel du courant des nanopipettes et de l’approche de l’axe Z
Normes d’étalonnage AFM	TED PELLA Inc	HS-100MG ; HS-20MG	Ces étalons d’étalonnage de 100 et 20 nm sont utilisés pour tester les performances du système HPICM
Isolateur de vibrations de paillasse	AMETEK/TMC	Everstill K-400	Isolation active des vibrations Capillaires
en verre borosilicaté	World Precision Instruments (WPI)	1B100F-4	Capillaires en verre borosilicaté pour les nanopipettes
D-(+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	À ajouter à la solution de bain pour ajuster l’osmolarité
Numériseur	National Instruments Corporation	PCI-6221	Numériseur d’entrée/sortie multicanaux
Contrôle analogique rapide proportionnel-intégral-dérivé (PID) pour le mouvement Z	Systèmes de recherche Standford	SIM900, SIM960, SIM980	Modules d’instrumentation intégrés dans un contrôleur PID externe pour le mouvement Z. Il nécessite une réponse rapide qui n’est généralement pas mise en œuvre dans les amplificateurs piézoélectriques commerciaux.
Cage de Faraday	AMETEK/TMC	Type II	Nécessaire pour protéger les interférences électromagnétiques
Plat à fond en verre	World Precision Instruments (WPI)	FD5040-100	Utilisé comme plat pour la chambre du tissu
Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS)	Gibco, Thermo Fisher Scientific	14025092	Solution extracellulaire (bain)
Amplificateur d’instrumentation	Brownlee L’amplificateur	Model 440	fournit les décalages, le filtrage et le grossissement ou l’atténuation secondaires requis
Extracteur de micropipettes à base laser	Sutter Instrument	P-2000/G	Extracteur de micropipettes pour fabriquer les nanopipettes. Le laser est nécessaire pour les pipettes à quartz tranchantes.
Lebovitz’s L-15, sans rouge de phénol	Gibco, Thermo Fisher Scientific	21083027	Solution extracellulaire (bain)
Micromanipulateur	Scientifica	PatchStar	Utilisé pour le positionnement « cap » de l’actionneur piézoélectrique
Z Microscope	Nikon	Eclipse TS100	Microscope optique inversé
Amplificateur de patch	Dispositifs moléculaires	Axopatch 200B	L’amplificateur patch clamp mesure le courant à travers la nanopipette
Amplificateur piézoélectrique (axes XY)	Physik Instrumente (PI)	E-500.00, E-505.00, E-509. C2A	Amplification et contrôle PID pour l’étage de traduction piézoélectrique XY
Amplificateur piézoélectrique (axe Z)	Piézosystème jena	ENT 400 & 800	Amplificateur personnalisé composé d’une alimentation ENT 400 et de deux amplificateurs ENT 800 en parallèle pour atteindre un courant maximal de 1,6 nA
Lamelles en plastique	TED PELLA Inc	26028	Utilisé dans la fabrication des chambres pour le tissu  ;
Contrôleur SICM & logiciel*	Ionscope, Royaume-Uni (ionscope.com)	N/A	Contrôleur personnalisé basé sur SBC6711 carte de traitement du signal numérique d’Innovative Integration Ltd
Élastomère de silicone (Sylgard)	World Precision Instruments (WPI)	SYLG184	Utilisé pour fixer les fibres de verre flexibles à la chambre pour le tissu
Colle au silicium	The Dow Chemical Company	734	Utilisé pour coller les différentes parties de la chambre pour le tissu
Tige de tungstène	A-M Systems	717500	Utilisé pour maintenir les brins de fil dentaire dans la chambre pour le
tissu XY Nanopositionneur piézoélectrique	Physik Instrumente (PI)	P-733.2DD	Platine de traduction XY avec capteurs capacitifs
Nanopositionneur piézoélectrique Z Piezosystem	jena	RA 12/24 SG	Piézoactionneur à anneau avec capteur de jauge de contrainte
*Ionscope ne vend plus de contrôleurs SICM séparés. Il existe peu d’autres systèmes commerciaux :  ; NX12-Bio et NX10 SICM,  ;
Park Systems, Corée et les modules SICM d’ICAPPIC Limited, Royaume-Uni (icappic.com). Tous ces systèmes sont basés sur l’original  ;
Principes HPICM. Cependant, l’imagerie des faisceaux stéréocils dans les cellules ciliées nécessite plusieurs modifications personnalisées qui sont...
difficile (voire impossible) dans le closed " prêt à l’emploi" tels que Ionscope ou NX12-Bio/NX10. Actuellement, il n’y en a qu’un.
système modulaire (ICAPPIC) qui a la flexibilité de s’adapter à n’importe quelle expérience SICM/HPICM, mais qui nécessite une certaine intégration de composants.

d’instrumentation Precision