Article de méthode

Ingénierie et contrôle fiables des circuits génétiques optogénétiques stables dans les cellules de mammifères

DOI :

10.3791/62109

⸱

6 juillet 2021

 ,  ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Stony Brook University, 2Laufer Center for Physical and Quantitative Biology, Stony Brook University, 3Stony Brook Medical Scientist Training Program

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le contrôle fiable des cellules de mammifères sensibles à la lumière nécessite la normalisation des méthodes optogénétiques. Pour atteindre cet objectif, cette étude décrit un pipeline de construction de circuits géniques, d’ingénierie cellulaire, de fonctionnement de l’équipement optogénétique et de tests de vérification pour normaliser l’étude de l’expression des gènes induite par la lumière en utilisant un circuit génique optogénétique à rétroaction négative comme étude de cas.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Un contrôle fiable de l’expression génique dans les cellules de mammifères nécessite des outils avec un changement de pli élevé, un faible bruit et des fonctions de transfert d’entrée en sortie déterminées, quelle que soit la méthode utilisée. Pour atteindre cet objectif, les systèmes d’expression génique optogénétique ont attiré beaucoup d’attention au cours de la dernière décennie pour le contrôle spatio-temporel des niveaux de protéines dans les cellules de mammifères. Cependant, la plupart des circuits existants contrôlant l’expression des gènes induits par la lumière varient dans l’architecture, sont exprimés à partir de plasmides et utilisent un équipement optogénétique variable, ce qui crée un besoin d’explorer la caractérisation et la normalisation des composants optogénétiques dans les lignées cellulaires stables. Ici, l’étude fournit un pipeline expérimental de construction, d’intégration et de caractérisation fiables de circuits géniques pour contrôler l’expression génique inductible par la lumière dans les cellules de mammifères, en utilisant un circuit optogénétique à rétroaction négative comme exemple de cas. Les protocoles illustrent également comment la normalisation de l’équipement optogénétique et des régimes lumineux peut révéler de manière fiable les caractéristiques du circuit génique telles que le bruit d’expression des gènes et l’ampleur de l’expression des protéines. Enfin, cet article peut être utile pour les laboratoires peu familiers avec l’optogénétique qui souhaitent adopter une telle technologie. Le pipeline décrit ici devrait s’appliquer à d’autres circuits optogénétiques dans les cellules de mammifères, permettant une caractérisation et un contrôle plus fiables et détaillés de l’expression des gènes au niveau transcriptionnel, protéomique et, en fin de compte, phénotypique dans les cellules de mammifères.

Introduction

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À l’instar d’autres disciplines de l’ingénierie, la biologie synthétique vise à normaliser les protocoles, permettant d’utiliser des outils aux fonctions hautement reproductibles pour explorer des questions pertinentes pour les systèmes biologiques1,2. Un domaine de la biologie synthétique où de nombreux systèmes de contrôle ont été construits est le domaine de la régulation de l’expression des gènes3,4. Le contrôle de l’expression génique peut cibler à la fois les niveaux de protéines et la variabilité (bruit ou coefficient de variation, CV = σ/μ, mesuré comme l’écart-type par rapport à la moyenne), qui sont des caractéristiques cellulaires cruciales en raison de leur rôle dans les états cellulaires physiologiques et pathologiques5,6,7,8. De nombreux systèmes synthétiques capables de contrôler les niveaux de protéines et le bruit4,9,10,11,12 ont été conçus, créant des opportunités de normalisation des protocoles à travers les outils.

Un nouvel ensemble d’outils capables de contrôler les réseaux de gènes qui a récemment émergé est l’optogénétique, permettant l’utilisation de la lumière pour contrôler l’expression des gènes13,14,15,16,17. Semblables à leurs prédécesseurs chimiques, les circuits géniques optogénétiques peuvent être introduits dans n’importe quel type de cellule, allant des bactéries aux mammifères, permettant l’expression de tout gène d’intérêt en aval18,19. Cependant, en raison de la génération rapide de nouveaux outils optogénétiques, de nombreux systèmes ont émergé qui varient dans l’architecture des circuits génétiques, le mécanisme d’expression (par exemple, l’intégration à base de plasmides par rapport à l’intégration virale) et l’équipement de contrôle fournissant de la lumière11,16,20,21,22,23,24,25 . Par conséquent, cela laisse place à la normalisation des caractéristiques optogénétiques telles que la construction et l’optimisation des circuits géniques, la méthode d’utilisation du système (par exemple, l’intégration par rapport à l’expression transitoire), les outils expérimentaux utilisés pour l’induction et l’analyse des résultats.

Pour progresser dans la normalisation des protocoles optogénétiques dans les cellules de mammifères, ce protocole décrit un pipeline expérimental pour concevoir des systèmes optogénétiques dans les cellules de mammifères en utilisant un circuit de gène à rétroaction négative (NF) intégré dans les cellules HEK293 (lignée cellulaire du rein embryonnaire humain) à titre d’exemple. NF est un système idéal pour démontrer la normalisation car il est très abondant26,27,28 dans la nature, ce qui permet d’ajuster les niveaux de protéines et de minimiser le bruit. En bref, nf permet un contrôle précis de l’expression des gènes par un répresseur réduisant sa propre expression suffisamment rapidement, limitant ainsi tout changement par rapport à un état stable. L’état d’équilibre peut être modifié par un inducteur qui inactive ou élimine le répresseur pour permettre plus de production de protéines jusqu’à ce qu’un nouvel état d’équilibre soit atteint pour chaque concentration d’inducteur. Récemment, un système optogénétique NF a été créé qui peut produire une réponse dynamique à grande échelle de l’expression des gènes, maintenir un faible bruit et répondre aux stimuli lumineux, ce qui permet un contrôle spatial de l’expression des gènes11. Ces outils, connus sous le nom de tuners inductibles par la lumière (LITers), ont été inspirés par des systèmes antérieurs qui permettaient le contrôle de l’expression génique dans les cellules vivantes4,10,29,30 et ont été intégrés de manière stable dans les lignées cellulaires humaines pour assurer un contrôle à long terme de l’expression des gènes.

Ici, en utilisant le LITer comme exemple, un protocole est décrit pour créer des circuits de gènes sensibles à la lumière, induire l’expression des gènes avec un appareil à plaque lumineuse (LPA, un matériel d’induction optogénétique)31, et analyser les réponses des lignées cellulaires modifiées et contrôlables optogénétiquement aux stimuli lumineux personnalisés. Ce protocole permet aux utilisateurs d’utiliser les outils LITer pour n’importe quel gène fonctionnel qu’ils souhaitent explorer. Il peut également être adapté à d’autres systèmes optogénétiques avec diverses architectures de circuits (par exemple, rétroaction positive, régulation négative, etc.) en intégrant les méthodes et l’équipement optogénétique décrits ci-dessous. Semblables à d’autres protocoles de biologie synthétique, les enregistrements vidéo et les protocoles optogénétiques décrits ici peuvent être appliqués dans des études unicellulaires dans divers domaines, y compris, mais sans s’y limiter, la biologie du cancer, le développement embryonnaire et la différenciation tissulaire.

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Protocole

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1. Conception de circuits génétiques

  1. Sélectionner les composants génétiques à combiner en un seul circuit génique/plasmide (p. ex., motifs de séquence d’intégration de l’ADN de mammifère32, éléments sensibles à la lumière33 ou gènes fonctionnels34).
  2. À l’aide de tout logiciel de génie génétique et/ou de clonage moléculaire, stockez les séquences d’ADN pour une utilisation et une référence ultérieures, annotez chaque séquence et examinez toutes les caractéristiques nécessaires (p. ex., codons START, séquences régulatrices ou traduites)35.
  3. Développer ou adopter des parties en fonction de la conception globale du circuit génétique36. À titre d’exemple, pour les répresseurs optogénétiques comme dans les LITers11, fusionner une séquence de gènes codant pour un domaine capable de dégradation inductible par la lumière37,38 ou d’inactivation de la capacité de liaison à l’ADN d’un répresseur39, adjacente et dans le cadre du gène répresseur (par exemple, TetR)4.
    1. Pour les activateurs optogénétiques, assurez-vous de la présence d’un domaine activateur40 qui favorise l’expression des gènes lors de la liaison à l’ADN induite par la lumière41. Pour une autorégulation négative ou positive, assurez-vous de la présence d’un site de liaison régulateur dans ou en amont du promoteur du gène régulateur (p. ex., des sites tetO dans ou en amont du promoteur exprimant TetR)42.
  4. Concevoir les amorces pour l’amplification de la séquence d’ADN ou le séquençage du plasmide à l’aide du logiciel de clonage moléculaire pour chaque circuit de gène.
  5. Valider les amorces par calcul pour la construction de plasmides grâce aux festins intégrés d’un logiciel de clonage moléculaire (par exemple, l’alignement de séquence).
  6. Commandez des amorces d’oligonucléotides auprès du fabricant. Les plasmides construits et utilisés dans ce travail peuvent être trouvés dans le matériau de support original11 avec les amorces conçues et utilisées.
  7. Diluer les amorces à une concentration de stock de 100 mM dans de l’eau double distillée (ddH2O).
  8. Diluer le stock d’amorces de 100 mM à une concentration de 10 mM pour la PCR.
  9. Préparer le mélange PCR avec 1 μL d’amorce avant, 1 μL d’amorce inverse, 1 μL d’ADN modèle à une masse totale de 0,5 à 500 ng pour la génomique ou 0,5 pg-5 ng pour l’ADN plasmidique ou viral, 12,5 μL d’ADN polymérase 2x mélange maître (ou le volume qui satisfait le facteur de dilution du fabricant) et 9,5 μL de ddH2O pour un volume de réaction total de 25 μL.
  10. Incuber le mélange PCR dans un thermocycleur à des réglages appropriés en fonction de l’enzyme choisie43. Les cycles de réaction suggérés comprennent :
    Étape 1 : Un cycle de 30 s d’étape de dénaturation initiale à 95 °C.
    Étape 2 : 40 cycles de 5 s d’étape de dénaturation à 98 °C.
    Étape 3 : Un cycle de 30 s d’étape de recuit à 65 °C (déterminé par des amorces conçues plus tôt).
    Étape 4 : Un cycle de 1 min d’extension à 72 °C (~1 kilobase (kb) longueur du fragment de gabarit).
    Étape 5 : Un cycle d’une extension de 2 min à 72 °C.
    Maintenez la réaction à 4 °C jusqu’à ce qu’elle puisse être testée par électrophorèse sur gel. Ce protocole varie en fonction des réactifs utilisés (p. ex. polymérase et tampons).
  11. Répétez l’étape 1.9 pour amplifier tous les fragments à utiliser dans une réaction d’assemblage d’ADN nécessaire pour relier les produits de PCR linéaire en un seul vecteur d’ADN circulaire.
  12. Exécutez les produits PCR sur un gel d’agarose à 1% suivi de la purification des bandes de la longueur souhaitée.
  13. Préparer le mélange maître pour une réaction d’assemblage d’ADN (tableau 1).
    Remarque : Dans cet exemple, le vecteur-mère est divisé en deux fragments pour augmenter l’efficacité des étapes de PCR sans entraîner de modifications significatives du résultat global de l’assemblage.
  14. Incuber le mélange maître de la réaction d’assemblage de l’ADN dans un thermocycleur à 50 °C pendant 1 h (sauf indication contraire dans le protocole du réactif d’assemblage de l’ADN) et stocker la réaction à 4 °C pour utiliser le produit de réaction pour la transformation bactérienne.
  15. Mettre en place une transformation bactérienne (chimique ou électroporation) à l’aide de cellules E. coli (Escherichia coli) compétentes et du protocole de transformation bactérienne correspondant. Après la transformation, utilisez les plaques de gélose bactériennes Luria-Bertani (LB) contenant le marqueur de sélection bactérienne choisi (par exemple, l’ampicilline) pour plaquer le mélange de transformation. Incuber les plaques à 37 °C pendant la nuit44.
  16. Vérifiez les plaques le lendemain. Pour inoculer les colonies, choisissez des colonies individuelles dans les plaques et remettez-les en suspension dans un bouillon LB liquide avec le marqueur de sélection bactérienne correspondant dans des tubes de culture. Incuber dans un incubateur agitateur à 37 °C, 300 tr/min pendant la nuit.
  17. Effectuer un protocole de préparation de plasmides pour extraire l’ADN plasmidique de la culture bactérienne.
  18. Validez le circuit en deux étapes. Tout d’abord, effectuez une digestion d’essai en utilisant des enzymes de restriction comme vérification brute pour voir si le produit plasmidique approximatif a été obtenu. Deuxièmement, si la digestion d’essai est réussie/confirmée, soumettez le plasmide à une installation de séquençage de Sanger (ou à un procédé utilisant l’équipement disponible) pour obtenir la séquence d’ADN précise afin de la comparer ultérieurement à la séquence attendue dans le logiciel de conception.
    1. Pour effectuer la digestion de test, sélectionnez au moins deux enzymes de restriction qui produisent au moins deux fragments, en fonction du logiciel de clonage moléculaire utilisé. Une fois les enzymes sélectionnées, préparez les échantillons d’essai en ajoutant 1 μL de chaque enzyme, 5 μL de l’ADN généré et 13 μL d’eau avec des sels et des tampons appropriés en fonction des enzymes utilisées. Incuber la réaction à 37 °C pendant 1 h, ou comme le suggère le fabricant de l’enzyme. Exécutez les produits de digestion d’essai sur un gel d’agarose à 1% et déterminez si les bandes sont correctes.
      REMARQUE: Si les bandes sont correctes, passez au séquençage.
    2. Pour effectuer le séquençage, générez des amorces basées sur l’ADN stocké dans le logiciel de sorte que les régions de recuit des amorces soient distantes d’environ 500 bp (paires de bases) et couvrent le fragment d’intérêt (composant du circuit génique) ou le plasmide complet. Diluer les amorces avec de l’eau pure sans nucléase (NF-H2O) à une concentration de 10 mM. Préparer les échantillons de séquençage en ajoutant 1 μL d’ADN de 10 ng/μL, 1 μL d’amorce et 8 μL de NF-H2O à un tube de 0,2 mL. Répétez cette opération pour chaque amorce.
      REMARQUE: Lorsque les échantillons sont préparés, déposez-les à l’installation de séquençage et comparez les résultats avec la séquence plasmidique à l’aide d’un logiciel de clonage moléculaire.
  19. À cette étape, générez environ 100 à 1000 ng/μL d’échantillon d’ADN pour intégrer les plasmides contenant des circuits géniques dans la lignée cellulaire appropriée.

2. Ingénierie stable des lignées cellulaires

  1. Ordonner une lignée cellulaire de mammifères conçue pour la génération rapide de sous-lignées stables qui assurent une expression de haut niveau de la protéine d’intérêt à partir d’un vecteur d’expression de mammifère. Le type de cellule et la facilité d’ingénierie des lignées cellulaires peuvent varier en fonction de ce que les utilisateurs préfèrent ou visent à atteindre.
    1. Par exemple, si les utilisateurs préfèrent l’ingénierie des lignées cellulaires avec un minimum d’étapes intermédiaires, ordonnez les cellules qui contiennent un seul site d’intégration stable (par exemple, FRT) à un locus génomique transcriptionnellement actif. Si l’on préfère une ingénierie cellulaire plus nuancée, créez des sites d’intégration à des endroits privilégiés à l’aide d’outils de génie génétique tels que CRISPR/Cas9.
  2. Cultiver des cellules avec 5 % de CO2 dans de l’air humidifié à 37 °C. Ajuster les conditions de croissance au besoin pour le type de cellule.
  3. Transfecter les circuits de gènes conçus ci-dessus dans les cellules souhaitées obtenues à partir des étapes précédentes pour commencer un processus de génération de lignée cellulaire stable. Pour ce faire, utilisez un mélange de liposomes45 de l’ADN du circuit génique avec une recombinase appropriée (par exemple, Flp-recombinase pour la recombinaison Flp-FRT) ou par d’autres méthodes telles que l’électroporation.
  4. Deux jours après la transfection, divisez les cellules à 25% de confluence.
  5. Six heures après la division des cellules, commencez la sélection des antibiotiques en échangeant le milieu contre un milieu frais contenant 50 μg/mL d’antibiotique hygromycine (ou un autre agent antibiotique correspondant au gène de résistance aux antibiotiques des mammifères choisi lors de la construction du plasmide).
    REMARQUE: Il existe une variété de gènes de résistance aux antibiotiques de mammifères utilisés dans la construction de circuits géniques, chacun ayant une courbe de destruction différente. Par conséquent, quel que soit le gène de résistance aux antibiotiques des mammifères choisi pour la construction du circuit, une courbe de destruction appropriée doit être étudiée dans les cellules d’intérêt. Cette étape garantit que les cellules contenant la charge utile du circuit génétique sont enrichies tandis que celles qui n’ont pas le système sont tuées.
  6. Laissez les cellules se développer dans le milieu de sélection des antibiotiques, passez à un milieu frais tous les 2-3 jours jusqu’à ce que la plaque ou la fiole ait quelques dizaines de foyers. Passage des cultures adhérentes lorsqu’elles sont dans la phase logarithmique avant d’atteindre la confluence.
  7. Une fois qu’il y a suffisamment de foyers, trypsiniser les cellules avec 1 mL de trypsine à 0,25%, 0,1% d’EDTA dans la solution saline équilibrée (HBSS) de Hank sans bicarbonate de calcium, de magnésium et de sodium pendant plusieurs minutes. Neutraliser la trypsine avec un milieu frais et passer toutes les cellules dans un récipient frais.
  8. Une fois que les cellules du récipient frais sont confluentes à 80% à 100%, congelez-les dans un mélange de 45% de vieux milieux, de 45% de milieux frais et de 10% de DMSO. Transférez les cellules restantes dans un tube stérile et effectuez un tri unicellulaire pour isoler les cellules monoclonales dans une plaque de 96 puits.
  9. Environ 2 à 3 semaines après le tri monoclonal, les puits dans la plaque de 96 puits devraient avoir des foyers. Lorsqu’environ 50% à 60% de confluent, divisez les cellules en une plaque de 12 puits.
  10. Une fois que la plaque de 12 puits est confluente à 80% à 100%, divisée en une fiole T-25 traitée par culture tissulaire. Une fois que les cellules de la fiole T-25 sont confluentes à 80% à 100%, congelez les cellules et maintenez un passage pour la caractérisation et le test des lignées cellulaires monoclonales.
    1. Caractériser les lignées cellulaires monoclonales par microscopie et tests de cytométrie en flux pour rapporter les profils d’expression génique basés sur la production induite de rapporteur fluorescent. Vérifier la production fonctionnelle de protéines par marquage d’anticorps fluorescents et test d’immunofluorescence. Testez l’induction de l’expression génique au niveau transcriptionnel via une PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR). Valider la séquence génétique et la précision de l’intégration via le séquençage local et du génome entier des clones.

3. Essais d’induction d’appareils à plaques lumineuses

  1. Construire un dispositif LPA31,46 à utiliser pour l’induction lumineuse des cellules modifiées. En bref, plusieurs grandes étapes sont cruciales pour créer un LPA à utiliser pour contrôler l’expression des gènes. Il s’agit notamment de l’impression 3D de composants de cadre LPA, de la construction de cartes de circuits imprimés, de la programmation du circuit via un programmeur de microcontrôleur, de l’assemblage des composants en un LPA final, de la programmation de la carte mémoire via le logiciel IRIS et de l’étalonnage du périphérique fini. Pour une explication plus complète, reportez-vous aux références ci-dessus.
    1. Imprimez les pièces 3D comme indiqué dans Gerhardt et al. (2016 et 2019)31,46.
    2. Assemblez la carte de circuit imprimé comme indiqué dans Gerhardt et al. (2016 et 2019)31,46.
    3. Ajoutez le micrologiciel au circuit LPA assemblé à l’aide d’un programmateur de microcontrôleur, comme indiqué dans Gerhardt et al. (2016 et 2019)31,46.
    4. Combinez des pièces imprimées en 3D et la carte de circuit imprimé assemblée comme indiqué dans Gerhardt et al. (2016 et 2019)31,46. Cela comprend la prise de la plaque de montage, de la carte de circuit imprimé, de l’entretoise à LED (diodes électroluminescentes), de l’adaptateur de plaque, d’une plaque à 24 puits, d’un couvercle de plaque, de boulons de montage, d’écrous d’aile et de composants d’empilage, comme le montrent la vidéo filmée et la figure 2.
    5. Pour la programmation de la carte mémoire et l’étalonnage de l’appareil, suivez les étapes décrites ci-dessous.
  2. Utilisez le logiciel IRIS disponible sur le site Web du Tabor Lab47 pour programmer une carte SD pour l’appareil à plaques lumineuses (LPA)31 et explorer les conditions d’éclairage appropriées nécessaires pour commencer une expérience optogénétique.
    REMARQUE: Le logiciel IRIS est une application Web pour la programmation du matériel électronique optogénétique, connu sous le nom de LPA, développé par le tabor Lab. Le logiciel permet de programmer des valeurs IRIS relatives qui contrôlent les diodes électroluminescentes (LED) individuelles dans chaque puits du matériel LPA.
  3. Choisissez l’option déroulante LPA (4 x 6), puis cliquez sur l’approche d’éclairage appropriée (État stable, Dynamique, Avancé).
    NOTE: Pour ce manuscrit, tous les tests se concentreront sur les exemples à l’état d’équilibre. Cependant, les exemples de réglages avancés peuvent être utilisés pour les durées d’impulsion et les régimes de rapport cyclique.
  4. Choisissez si les LED du haut ou du bas seront éclairées en entrant des valeurs dans les cellules correspondant aux puits de la plaque. Pour les APL utilisés dans ce travail, des LED bleues placées en position supérieure ont été utilisées dans toutes les expériences. Chaque LED, une fois programmée, peut fournir une exposition continue à la lumière avec une intensité lumineuse constante. Le logiciel IRIS permet d’obtenir 4096 niveaux d’intensité qui peuvent être programmés.
  5. Une fois les emplacements des LED choisis, entrez les valeurs d’intensité pour le contour expérimental souhaité. Par exemple, entrez 8 intensités lumineuses différentes (ou durées d’impulsion ou cycles de service) avec trois répétitions techniques par plaque (tableau 2). G.s. fait référence aux unités en niveaux de gris- les valeurs de mesure du niveau d’intensité lumineuse utilisées pour la programmation LPA dans le logiciel IRIS.
    1. Lors de la conception des fichiers expérimentaux IRIS, gardez à l’esprit les effets de bord des puits adjacents sur le dispositif LPA, la toxicité de la lumière due à l’augmentation des intensités d’exposition à la lumière bleue et la détermination du type de dose-réponse souhaité (par exemple, monotone vs non monotone).
    2. Si les utilisateurs programment des cellules dans le LPA dans l’ordre croissant/décroissant d’un paramètre de lumière particulier (par exemple, l’intensité), les puits peuvent produire des effets de bord de diaphonie lumineuse ou même de chaleur qui peuvent influencer les puits adjacents. Cela peut influencer par inadvertance le résultat des extrants mesurés lorsque les expériences sont terminées. Pour atténuer ce problème, les utilisateurs peuvent implémenter une matrice de randomisation sur le logiciel IRIS pour brouiller les emplacements des puits, minimisant ainsi les effets de bord. Un exemple est décrit dans les résultats représentatifs ci-dessous (figure 4A-B).
    3. En outre, des intensités plus élevées de lumière bleue ont été trouvées pour interférer avec la croissance cellulaire et la viabilité48. Par conséquent, pour atténuer la toxicité de la lumière, il est important de produire une courbe d’intensité lumineuse, de durée d’impulsion ou de réponse du rapport cyclique en fonction de la modalité étudiée.
      1. Par exemple, programmez 8 valeurs d’intensité lumineuse avec trois répétitions par plaque de 24 puits, avec une plage allant de l’absence de lumière à une intensité maximale de la LPA. Ensuite, exécutez ces échantillons sur un cytomètre en flux avec une porte SSC-FSC ou une coloration vivante telle que l’iodure de propidium pour quantifier la survie des cellules de population (cellules vivantes par rapport aux événements totaux, y compris les cellules mortes / débris cellulaires) à chaque valeur lumineuse.
      2. Ensuite, déterminez la quantité idéale de survie de la population pour la configuration expérimentale, car tout stimulus peut nuire à la prolifération, à l’expression des gènes ou à la survie (par exemple, définir une survie cellulaire de 80% comme compromis approprié). Par exemple, dans ce travail, une fois étalonné, l’intensité ne dépassait pas 3000 g.s. unités (~3/4 de l’intensité maximale du dispositif LPA). Un exemple de ceci est décrit dans les résultats représentatifs ci-dessous.
    4. En plus de restreindre les valeurs lumineuses en raison de la toxicité, les utilisateurs peuvent souhaiter restreindre les valeurs lumineuses pour caractériser une partie particulière de la dose-réponse, telle que la plage de la réponse monotone.
      1. Pour ce faire, scannez d’abord une large gamme d’intensités lumineuses, de durées d’impulsion ou de cycles d’utilisation en fonction de la modalité analysée lors de la détermination de la dose-réponse souhaitée (tableau 2) pour affiner le régime de lumière d’intérêt, par exemple, où l’expression des gènes est en corrélation positive avec l’augmentation des valeurs lumineuses pour une dose-réponse monotone.
      2. Pour déterminer la plage d’intérêt de la lumière, programmez un seul LPA avec jusqu’à 24 puits d’intensité/durée d’impulsion/rapport cyclique/etc. différents ou plusieurs puits (p. ex., 48, 72, 96, etc.) selon que plusieurs APL sont étalonnés pour fournir des quantités de lumière équivalentes et procéder aux travaux de culture cellulaire ou aux essais décrits ci-dessous. Par conséquent, commencez la caractérisation d’un système optogénétique avec une large gamme de doses de stimuli lumineux pour déterminer l’intervalle de gamme qui donne l’expression génique souhaitée et effectuez ensuite des expériences dans cette gamme de doses raffinées.
      3. Par exemple, dans ce travail, une fois que 3000 unités de g.s. ont été déterminées comme seuil d’intensité lumineuse toxique; ce seuil a été utilisé comme limite supérieure de la lumière pour les essais décrits ci-dessous (p. ex., immunofluorescence).
        REMARQUE: Les étapes ci-dessus sont indépendantes de l’étalonnage optique de la LPA et se réfèrent à un étalonnage au niveau moléculaire pour chaque système optogénétique.
  6. Une fois les valeurs d’intensité lumineuse appropriées programmées dans IRIS, insérez une carte mémoire avec la prise USB 3.0 dans le LPA pour télécharger et transférer les fichiers.
  7. Si l’étalonnage du LPA est terminé31, procéder aux travaux de culture cellulaire pour l’initiation du test d’induction lumineuse. Si l’étalonnage n’a pas été effectué, calibrez le LPA à l’aide d’une méthode d’analyse d’image (étapes 3.7.1 à 3.7.3) une fois que le LPA est programmé avec le programmeur du microcontrôleur.
    1. Programmez brièvement l’APL pour qu’il ait le même niveau d’IRIS que celui décrit par Gerhardt et al. (2016)31.
      REMARQUE: Pour l’étalonnage, le LPA a été programmé pour avoir une valeur de 2000 g.s.
    2. Une fois que l’appareil est programmé avec la carte mémoire et que le bouton de réinitialisation (bouton physique sur le LPA) est enfoncé, acquérez une image de l’ensemble de l’appareil (par exemple, imageur de station de gel, appareil de scanner, etc.). Pour l’étalonnage, acquérez deux images avec l’appareil pivoté de 180°.
    3. Ensuite, utilisez un logiciel open source conçu par Gerhardt et al. (2016)31 pour montrer la variabilité de l’intensité des LED sur la plaque LPA et calculer les valeurs de compensation des LED pour rendre l’intensité égale entre les puits. Un exemple de ceci est décrit dans les résultats représentés ci-dessous (Figure 3). Une fois cet étalonnage terminé, passez au travail de culture cellulaire pour l’initiation du test d’induction lumineuse.
  8. Obtenir des flacons de cellules monoclonales modifiées de la section précédente pour étudier les effets de l’induction de la lumière sur l’expression des gènes.
  9. Retirez l’ancien support de la fiole.
  10. Ajouter 1 mL de trypsine aux cellules et incuber pendant 5 min.
  11. Après 5 min, neutraliser la trypsine en ajoutant 4 mL de milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM ou autre milieu souhaité) complété par les produits chimiques nécessaires (ce travail a utilisé 50 μg/mL d’hygromycine, 1 % de solution de pénicilline/streptomycine, 10 % de sérum fœtal bovin, FBS).
  12. Ajouter environ 75 000 cellules par puits dans une plaque noire de 24 puits dans un volume total de 500 μL. Le nombre de cellules ensemencées peut varier en fonction de la durée de l’expérience souhaitée et du type de cellule utilisé.
    REMARQUE: De plus, notez que la densité d’ensemencement cellulaire affecte le maintien de la culture et potentiellement la durée de l’expérience. Commencer à un nombre inférieur de cellules par puits garantit des durées plus longues avant que la culture n’atteigne la confluence. De plus, le type de composants optogénétiques intégrés dans les circuits géniques d’intérêt influencera le moment où l’expression des gènes atteindra un état stable et affectera donc la durée des expériences. D’autres facteurs peuvent être pris en compte sont les taux de croissance propres à la lignée cellulaire, la composition des milieux et les effets conditionnels de la croissance (c.-à-d. la lumière).
  13. Après le placage, placez les cellules dans un incubateur humidifié avec 5% de CO2 pour leur permettre de se déposer pendant 2 à 6 h.
  14. Après l’incubation, transférer les cellules dans une hotte de culture tissulaire, retirer le couvercle en plastique et ajouter une bande de film adhésif sur le dessus de la plaque (Figure 2D). Cette étape permet un transfert de lumière minimal entre les puits, car le haut et les côtés des puits sont revêtus, et la lumière ne peut maintenant entrer que par le bas du puits où la LED est placée.
  15. Placez la plaque dans les parties 3D ajustées du LPA. Ensuite, couvrez la plaque avec le couvercle LPA imprimé en 3D, qui s’adapte sur les vis de l’appareil à chaque coin.
  16. Branchez l’appareil à la source d’alimentation et appuyez sur le bouton de réinitialisation du périphérique LPA pour vous assurer que les paramètres d’expérience LPA mis à jour sont appliqués.
  17. Incuber les cellules dans le système expérimental pendant une durée appropriée, en fonction de la densité d’ensemencement d’origine, de la vitesse de croissance spécifique à la lignée cellulaire et des conditions de croissance. Dans cet exemple, les lignées cellulaires ont été induites pendant 3 jours en continu pour que l’expression des gènes atteigne un état stable. Cependant, il convient de noter que de nombreux systèmes optogénétiques (p. ex., VVD) peuvent atteindre l’expression des gènes à l’état d’équilibre beaucoup plus tôt (p. ex., 24 h) et que, par conséquent, les temps d’induction expérimentale peuvent être réduits ou prolongés au besoin.
  18. À la fin de l’expérience d’induction lumineuse, utilisez les échantillons pour l’un des quatre essais suivants afin de caractériser les lignées cellulaires modifiées (sections 4 à 7).

4. Microscopie à fluorescence de cellules modifiées induites par la lumière

  1. 24-72 h après l’induction, retirez les cellules du LPA de l’incubateur et placez-les dans une hotte de culture tissulaire.
  2. Retirez la bande de papier d’aluminium et laissez la plaque reposer pendant 1-2 min. Cela empêche la formation de condensation sur le couvercle en plastique, s’il est placé immédiatement sur la plaque.
  3. Après 1-2 min de séance, remettez le couvercle en plastique d’origine sur l’assiette.
  4. Imagez les cellules avec le microscope à contraste de phase ou à fluorescence approprié.
  5. Selon l’instrument, ajustez le temps d’exposition, l’intensité de la source lumineuse et le gain pour l’affichage des cellules modifiées. Dans cette expérience, les paramètres suivants ont été appliqués : 50 ms pour le temps d’exposition à la source lumineuse FITC/GFP (protéine fluorescente verte) et 1 à 5 ms pour le temps d’exposition au contraste de phase à une intensité de 100 % pour chacun.
    REMARQUE: Il convient de noter que les temps d’exposition optimaux, les niveaux de gain et les intensités des sources lumineuses sont souvent dérivés empiriquement de l’expérience de ce travail pour minimiser la sursaturation dans le rapporteur de fluorescence, minimiser les dommages cellulaires et capturer des images adéquates pour une analyse qualitative et quantitative. Lors de la détermination des niveaux de chacun de ces paramètres, les aspects à garder à l’esprit comprennent la maximisation des rapports signal/bruit, la minimisation de la phototoxicité, la minimisation de la sursaturation des signaux de fluorescence et l’augmentation de la capacité à amplifier les signaux de fluorescence faibles.
    1. Optimiser ces paramètres de manière grossièrement ad hoc; toutefois, les valeurs expérimentales antérieures (p. ex., l’intensité de la source lumineuse causant une sursaturation du rapporteur de fluorescence) peuvent guider les futurs paramètres expérimentaux, le cas échéant. Par exemple, les paramètres de gain, les temps d’exposition et les valeurs initiales d’intensité lumineuse d’un circuit (LITer1.0) ou d’une configuration expérimentale (par exemple, intensité lumineuse) peuvent être utilisés comme point de départ lors du passage à un circuit génétique similaire mais différent (LITer2.0)11 ou à une modalité lumineuse différente (par exemple, cycle d’utilisation légère).
  6. Rationalisez l’imagerie des plaques à l’aide d’un modèle de coordonnées programmé dans le logiciel de microscopie, ce qui permet à toute la taille de la plaque (par exemple, 24 puits) d’avoir une acquisition d’image automatisée à partir de plusieurs emplacements d’image par puits.

5. Cytométrie en flux de cellules modifiées induites par la lumière

  1. 24-72 h après l’induction, retirez les cellules de la LPA dans l’incubateur ou du microscope après l’imagerie et placez-les dans la cagoule de culture tissulaire.
  2. Si elle est retirée directement du LPA, retirez la bande de papier d’aluminium et laissez la plaque reposer pendant une minute ou deux.
  3. Aspirer le milieu de chaque puits (de l’ensemble de la plaque de 24 puits si tous les puits sont utilisés).
  4. Ajouter 100 μL de 0,25% de trypsine à chaque puits, couvrir la plaque avec un couvercle en plastique et la replacer dans l’incubateur.
  5. Laissez les cellules intactes dans l’incubateur pendant 5 min.
  6. Après 5 min, retirez la plaque et retournez-la dans la hotte de culture tissulaire.
  7. Neutraliser chaque trypsinisé avec 400 μL de DMEM.
  8. Étiqueter un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL avec une passoire cellulaire (ou un tube de cytométrie en flux approprié qui peut être filtré pour éliminer de gros amas de cellules non entièrement trypsinisées) avec un nom correspondant à chaque puits.
  9. Utilisez une pipette P1000 pour pipeter le contenu de chaque puits de haut en bas 6 à 8 fois pour briser les amas de cellules et créer des échantillons unicellulaires pour la cytométrie en flux49.
  10. Transférer tout le contenu de chaque puits (~500 μL) dans les tubes étiquetés avec la crépine.
  11. Amenez les cellules à l’instrument de cytométrie en flux approprié avec des lasers des longueurs d’onde correctes (peut apporter des tubes avec des cellules sur ou hors glace).
    REMARQUE : Le cytomètre en flux utilisé dans ce travail faisait partie d’un établissement de base situé à l’hôpital universitaire.
  12. Créez une porte de diffusion vers l’avant et latérale (FSC et SSC, respectivement) pour capturer les cellules individuelles de la taille et de la granularité appropriées afin d’exclure les débris et les amas cellulaires sur le logiciel de cytométrie en flux.
  13. Une fois la porte définie, capturez environ 10 000 cellules avec la porte appropriée. Ajustez ce nombre en fonction de la quantité de données cellulaires recherchées par les utilisateurs. Répétez l’opération pour chaque tube contenant les cellules de l’expérience.
  14. Une fois l’expérience terminée, importez les données dans le logiciel de cytométrie en flux disponible pour analyse.
  15. Créez une porte FSC-SSC (comme auparavant lors de l’acquisition) et appliquez-la à chaque lot de données expérimentales. Un puits de référence de la population cellulaire non induite est utilisé pour créer cette porte dans ce manuscrit, mais d’autres mesures pour la création de portes existent, telles que les portes basées sur la densité.
  16. Avec les conditions expérimentales fermées par une porte FSC-SSC, tracez les données de cytométrie en flux sous forme d’histogrammes ou représentez-les d’une autre manière pour illustrer les modèles d’expression obtenus. Dans cette expérience, la fluorescence a été capturée par les canaux GFP/FITC ou PE/TexasRed.

6. Extraction de l’ARN et PCR quantitative des composants du circuit génique

  1. 24-72 h après l’induction, retirez les cellules de la LPA dans l’incubateur ou du microscope après l’imagerie et placez-les dans la cagoule de culture tissulaire.
  2. Si elle est retirée directement du LPA, retirez la bande de papier d’aluminium et laissez la plaque reposer pendant une minute ou deux.
  3. Aspirer le milieu de chaque puits (de l’ensemble de la plaque de 24 puits si tous les puits sont utilisés).
  4. Procédez à l’extraction de l’ARN des cellules à l’aide du kit d’extraction d’ARN approprié.
  5. Une fois l’extraction de l’ARN terminée, effectuer une réaction de transcription inverse de chaque échantillon (tableau 3).
  6. De plus, effectuer une PCR quantitative de chaque échantillon (tableau 4). Utilisez une ADN polymérase et un protocole associé pour mettre en place des réactions PCR. Pour cette étape, mettez en place une réaction multiplexée avec un gène d’entretien ménager et un gène d’intérêt, ou créez des réactions distinctes. Dans cet exemple, les niveaux de GFP, de KRAS et de glycéraldéhyde-3-phosphate déshydrogénase (GAPDH) ont été sondés. Après avoir terminé l’expérience qRT-PCR, procédez à l’analyse via le logiciel disponible pour illustrer le changement de pli du circuit génique au niveau de l’ARN.

7. Immunofluorescence des composants du circuit génique

  1. Utilisez un bain de glace ou un congélateur pour refroidir le méthanol.
  2. 24-72 h après l’induction, retirez les cellules de la LPA dans l’incubateur ou du microscope après l’imagerie et placez-les dans la cagoule de culture tissulaire.
  3. Si elle est retirée directement du LPA, retirez la bande de papier d’aluminium et laissez la plaque reposer pendant 1 à 2 minutes.
  4. Aspirer le milieu de chaque puits (de l’ensemble de la plaque de 24 puits si tous les puits sont utilisés).
  5. Ajouter 100 μL de 0,25% de trypsine à chaque puits, couvrir la plaque avec un couvercle en plastique et la replacer dans l’incubateur.
  6. Laissez les cellules intactes dans l’incubateur pendant 5 min.
  7. Après 5 min, retirez la plaque et retournez-la dans la hotte de culture tissulaire.
  8. Neutraliser chaque trypsinisé avec 400 μL de DMEM.
  9. Étiquetez les tubes mini-centrifuges avec des noms correspondant à chaque puits.
  10. Utilisez une pipette P1000 et pipettez le contenu de chaque puits de haut en bas 6 à 8 fois pour briser les amas de cellules.
  11. Transférer tout le contenu de chaque puits (~500 μL) dans les tubes étiquetés.
  12. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
  13. Une fois terminé, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique.
  14. Remettez en suspension les cellules (utilisez une pipette P1000 et une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas cellulaires) dans 750 à 1000 μL de paraformaldéhyde à 4% (dilué dans une solution saline tamponnée au phosphate, PBS).
  15. Laissez les cellules reposer pendant 15 minutes à température ambiante.
  16. Après l’incubation, ajouter 750-1000 μL de PBS. Pipette de haut en bas plusieurs fois.
  17. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
  18. Une fois terminé, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique.
  19. Remettez en suspension les cellules (utilisez une pipette P1000 et une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas de cellules) dans 750 à 1000 μL de méthanol glacé.
  20. Laissez les cellules reposer pendant 30 minutes sur de la glace ou dans un congélateur à -20 °C.
  21. Après l’incubation, ajouter 750-1000 μL de PBS. Pipette de haut en bas plusieurs fois.
  22. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
  23. Une fois terminé, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique.
  24. Selon le type d’anticorps utilisés, modifiez le protocole à partir de ce moment. Suivez les étapes 7.24.1 à 7.24.14 ou 7.24.15 à 7.24.22.
    1. Si vous utilisez un anticorps primaire et secondaire, remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette P1000/P200 et d’une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas cellulaires dans 100 μL d’anticorps primaire. Dans ce cas, une dilution de 1:800 pour les anticorps de base a été faite, y compris l’anticorps KRAS ou l’anticorps ERK, et a été laissée reposer pendant 1 h à température ambiante. Les anticorps ont été dilués dans un tampon d’incubation fabriqué à partir de 1x PBS avec 0,5 g de BSA.
      REMARQUE: Déterminez empiriquement la dilution exacte de l’anticorps en créant une courbe standard des dilutions d’anticorps par rapport à l’antigène d’intérêt.
    2. Après avoir ajouté des anticorps, recouvrir les tubes d’une feuille pour éviter les effets légers sur les anticorps marqués.
    3. Après l’incubation, ajouter 750-1000 μL du tampon d’incubation. Pipette de haut en bas plusieurs fois.
    4. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
    5. Une fois terminé, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique.
    6. Remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette P1000/P200 et d’une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas cellulaires dans 100 μL d’anticorps secondaires. Dans ce cas, les cellules ont été remises en suspension dans un anticorps secondaire de 100 μL à une dilution de 1:800 pour l’anticorps KRAS ou de 1:2000 pour l’anticorps ERK et laissées reposer pendant 30 min à température ambiante. Semblable aux anticorps primaires, diluez les anticorps secondaires dans le tampon d’incubation comme décrit ci-dessus. Déterminer les dilutions des anticorps secondaires en fonction des résultats empiriques d’une courbe standard.
    7. Après avoir ajouté des anticorps, recouvrir les tubes d’une feuille pour éviter les effets de la lumière sur les anticorps marqués.
    8. Après l’incubation, ajouter 750-1000 μL du tampon d’incubation. Pipette de haut en bas plusieurs fois.
    9. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
    10. Une fois terminé, jetez le surnageant et déplacez les échantillons vers une hotte chimique.
    11. Remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette P1000 et d’une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas de cellules dans 500 μL de PBS.
    12. Transférer tout le contenu de chaque tube (~500 μL) dans les tubes étiquetés avec des crépines.
    13. Amenez les cellules à des instruments de cytométrie en flux appropriés avec des lasers des longueurs d’onde correctes (peuvent amener des tubes avec des cellules sur ou hors glace).
      REMARQUE: Il convient de noter que le fait d’avoir plusieurs témoins est important pour progresser dans la mesure et l’analyse de la cytométrie en flux de l’expression des gènes cellulaires modifiés. Par exemple, avoir des cellules complètement non colorées, des cellules colorées avec un anticorps primaire seul et des cellules colorées avec un anticorps secondaire seul peut être utile pour comparer les résultats avec les signaux de fond des anticorps.
    14. Ensuite, procédez à l’analyse décrite à la section 5.
    15. Si vous n’utilisez qu’un anticorps primaire, remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette P1000/P200 et d’une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas cellulaires dans 100 μL d’anticorps primaire marqué. Déterminer la dilution appropriée des anticorps et incuber pendant 1 h à température ambiante. Déterminez empiriquement la dilution de l’anticorps à partir de la courbe standard.
    16. Après avoir ajouté des anticorps, recouvrir les tubes d’une feuille pour éviter les effets légers sur les anticorps marqués.
    17. Après l’incubation, ajouter 750-1000 μL du tampon d’incubation. Pipette de haut en bas plusieurs fois.
    18. Centrifuger les cellules pendant 5 min à 400 x g.
    19. Remettez en suspension les cellules à l’aide d’une pipette P1000 et d’une pipette de haut en bas 6 à 8 fois dans chaque tube pour briser les amas de cellules dans 500 μL de PBS.
    20. Transférer tout le contenu de chaque tube (~500 μL) dans des tubes étiquetés avec des crépines.
    21. Amenez les cellules à des instruments de cytométrie en flux appropriés avec des lasers des longueurs d’onde correctes (peuvent amener des tubes avec des cellules sur ou hors glace).
      REMARQUE: Il convient de noter que le fait d’avoir plusieurs témoins est important pour progresser dans la mesure et l’analyse de la cytométrie en flux de l’expression des gènes cellulaires modifiés. Avoir des cellules complètement non colorées et des cellules colorées avec des anticorps primaires seuls est utile pour comparer les résultats avec les signaux de fond des anticorps.
    22. À partir de ce moment, procédez à l’analyse décrite à la section 5.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’assemblage du circuit génique et la génération de lignées cellulaires stables dans cet article étaient basés sur des cellules HEK-293 modifiées commerciales contenant un site FRT unique et stable transcriptionnellement actif (Figure 1). Les circuits géniques ont été construits en vecteurs qui avaient des sites FRT dans le plasmide, permettant l’intégration Flp-FRT dans le génome cellulaire HEK-293. Cette approche ne se limite pas aux cellules Flp-In, car les sites FRT peuvent être ajoutés ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les lecteurs de cet article peuvent avoir un aperçu des étapes essentielles à la caractérisation des circuits de gènes optogénétiques (ainsi que d’autres systèmes d’expression génique), y compris 1) la conception, la construction et la validation de circuits de gènes; 2) l’ingénierie cellulaire pour l’introduction de circuits géniques dans des lignées cellulaires stables (p. ex., recombinaison Flp-FRT); 3) l’induction des cellules modifiées avec une plate-forme à base de lumière telle que le LPA; 4) caractérisation initi...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous tenons à remercier le laboratoire Balázsi pour ses commentaires et suggestions, le Dr Karl P. Gerhardt et le Dr Jeffrey J. Tabor de nous avoir aidés à construire le premier LPA, et le Dr Wilfried Weber pour avoir partagé les plasmides LOV2-degron. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health [R35 GM122561 et T32 GM008444]; Le Centre Laufer de biologie physique et quantitative; et une bourse d’études supérieures en sciences et en génie de la défense nationale (NDSEG). Financement de la redevance pour le libre accès : NIH [R35 GM122561].

Contributions de l’auteur : M.T.G. et G.B. ont conçu le projet. M.T.G., D.C. et L.G., ont effectué les expériences. M.T.G., D.C., L.G. et G.B. ont analysé les données et préparé le manuscrit. G.B. et M.T.G. ont supervisé le projet.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes PCR de 0,2 mLde 951010006Eppendorfpour la réalisation de la PCR
0,25 % Trypsine EDTA 1XThermo Fisher ScientificMT25053CIréactif pour la division et la récolte de cellules de mammifères
0,5-10 &mu ; L Pipette à volume réglableEppendorf3123000020outil utilisé pour les réactions de pipetage
100-1000 &mu ; L Pipette à volume réglableEppendorf3123000039outil utilisé pour les réactions de pipetage
20-200 &mu ; L Pipette à volume réglableEppendorf3123000055outil utilisé pour les réactions de pipetage
2-20 &mu ; L Pipette à volume réglableEppendorf3123000039outil utilisé pour les réactions de pipetage
Tube à fond rond en polystyrène de 5 mL avec capuchon de filtre cellulaireRéactif Corning352235pour cytométrie en flux
Centrifugeuse 5702R, avec rotor 4 x 100, adaptateurs de 15 et 50 ml,de 22628113Eppendorfpour les travaux d’élevage de mammifères
AgaroseDenville ScientificGR140-500réactif pour l’électrophorèse sur gel
Feuilles d’aluminium pour plaques à 96 puits VWR® ;60941-126outil utilisé pour recouvrir les plaques dans les expériences d’induction de lumière
AmpicillineSigma AldrichA9518-5Gréactif pour sélectionner les bactéries avec le bon plasmide
Mélangeur vortex analogiqueThermo Fisher Scientific02215365PRoutil pour effectuer des réactions de PCR, de transformation ou d’extraction de gel
DF0140010Bacto Dehydrated AgarFisherpour bactéries en croissance
BD LSRAriaBD656700outil pour trier les lignées cellulaires modifiées en populations monoclonales
BD LSRFortessaBD649225outil pour caractériser les lignées cellulaires modifiées
BSA, Bovin Serum AlbumineGovernment Scientific SourceSIGA4919-1Gréactif pour tampon
d’incubation IFPlaque de culture cellulaire 12 puits, transparente, à fond plat avec couvercle, polystyrène, apyrogène, standard-TCPlaque 353043Corningutilisée pour la culture de cellules monoclonales
CentrifugeuseVWR22628113instrument pour la culture cellulaire de mammifères
Hotte chimiqueN/A/A Instrumentpour la réalisation de réactions IF
Plaque de culture cellulaire transparente 24 puits à fond plat avec couvercleBD353047plaque utilisée pour la croissance de cellules monoclonales
Bouchon filtrant CytoOne T25 Fiole TCUSA ScientificCC7682-4825pour la croissance de cellules de mammifères
Diméthylsulfoxyde (DMSO)Réactif Fischer ScientificBP231-100utilisé pour la congélation de cellules de mammifères modifiées
Bromure d’éthidiumThermo Fisher Scientific15-585-011réactif pour électrophorèse
sur gelMicroplaque de culture Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated TC, avec couvercleCorning353072récipient pour la culture de cellules monoclonales triées
FCS ExpressDe Novo Logiciel :N/ALogiciel pour la caractérisation des données de cytométrie en flux
Sérum de veau fœtal, régulier, USDA 500 mLCorning35-010-CVpour la croissance de cellules de mammifères
Boîtes de Pétri Fisherbrand avec couvercle transparent - Faîte surélevée ; 100 x 15 mmFisher ScientificFB0875712équipement pour la croissance des bactéries
Gibco  ; DMEM, High GlucoseThermo Fisher Scientific11-965-092réactif pour la croissance de cellules de mammifères
Hs00932330_m1 KRAS isoforme un Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182sonde qPCR
Hygromycine B (50 mg/mL), 20 mLLife Technologies10687-010réactif pour sélectionner des cellules avec une intégration appropriée du circuit génique
iScript Reverse Transcription SupermixBio-Rad Laboratories1708890réactif pour convertir l’ARN en ADNc
Laboratoire Congélateur -20 ° ; CVWR76210-392équipement pour le stockage des réactifs expérimentaux
Congélateur de laboratoire -80 ° ; CPanasonicMDF-U74VCÉquipement pour le stockage des réactifs expérimentaux
Réfrigérateur de laboratoire +4 ° ; CVWR76359-220Équipement pour le stockage des réactifs expérimentaux
LB Broth (Lennox) , 1 kgSigma-AldrichL3022-250Gréactif pour la croissance des bactéries
LIPOFECTAMINE 3000Life TechnologiesL3000008reagemt pour la transfection de circuits de gènes dans des cellules de mammifères
MATLAB 2019Logiciel MathWorksN/Apour l’analyse des données expérimentales
MéthanolAcros Organics413775000réactif pour réaction d’immunofluorescence
Tubes de microcentrifugation, polypropylène 1,7 mLRécipient en plastiqueVWR20170-333
Mr04097229_mr EGFP/YFP Taqman Gene Expression AssayLife Technologies4331182sonde qPCR
MultiTherm ShakerBenchmark ScientificH5000-HCéquipement pour bactéries transformation
Spectrophotomètre NanoDrop LiteThermo Fisher ScientificÉquipement ND-NDL-US-CANpour la mesure de la concentration d’ADN/ARN
NEB Q5 ADN polymérase haute fidélité 2x Master MixNEBM0492Sréactif pour PCR de fragments de circuit génique
NEB10-beta Competent E. coli (High Efficiency)New England Biolabs (NEB)Cellules bactériennesC3019Hpour l’amplification du circuit de gènes d’intérêt
NEBuilder HiFi DNA Assembly Master MixNew England Biolabs (NEB)E2621Lréactif pour combiner les fractions de circuits géniques
Eclipse Ti-E microscope inversé avec une caméra DS-Qi2Nikon Instruments Inc.N/AInstrument de quantification de l’expression génique
NIS-ElementsNikon Instruments Inc.N/ALogiciel pour la caractérisation des données de microscopie à fluorescence
oligonucléotidesIDTRéactif N/Autilisé pour la PCR des composants du circuit génique
Panasonic MCO-170 AICUVHL-PA Série cellIQ CO2 Incubateur avec UV et H2O2Contrôle PanasonicMCO-170AICUVHL-PAcroissance de cellules
de mammifèresParaformaldéhyde, 16 % Microscopie électronique de qualitéMicroscopie électronique Sciences15710-Sréactif
PBS, solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (D-PBS) (1x)de 14190144Invitrogenpour la culture de cellules de mammifères,réactif pour tampon d’incubation IF
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL), 100xFisher Scientific15140-122réactif pour la croissance de cellules de mammifères
Anticorps primaire ERKTechnologie de signalisation cellulaire4370SAnticorps primaire ERK pour l’immunifluorescence
Anticorps primaire KRASSigma-AldrichAnticorpsKRAS primaire WH0003845M1 pour l’immunifluorescence
QIAprep Spin Miniprep Kit (250)Qiagen27106Kit de réactifs pour la purification des plasmides du circuit génique
QIAquick Gel Extraction Kit (50)Qiagen28704kit de réactifs pour la purification des fragments de circuits génétiques
Système de PCR en temps réel QuantStudio 3Équipement EppendorfA28137pour qRT-PCR
Application de quantification relativeThermo Fisher ScientificN/ALogiciel pour la quantification de l’amplification de l’ARN/ADNc
RNeasy Plus Mini KitQiagen74134Kit pour l’extraction de l’ARN de cellules de mammifères modifiées
AnticorpsERK secondaireTechnologie de signalisation cellulaire8889SAnticorps secondaire ERK pour l’immunifluorescence
Anticorps KRAS secondaireInvitrogenA11005Anticorps KRAS secondaire pour l’immunifluorescence
Pipettes sérologiques 5,0 mLOlympus Plastics12-102réactifs utilisés pour la mise en place d’une variété de réactions chimiques
Système d’imageur SmartView Pro MajorScienceUVCI-1200outil pour l’imagerie des bandes de PCR correctes
SnapGene Viewer (gratuit) ou SnapGeneSnapGeneN/Alogiciel de conception et d’analyse de séquences d’ADN
Incubateur supérieur de scèneTokai HitINU-TIZoutil pour la réalisation de réactions de PCR, de transformation ou d’extraction de gel
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Fisher Scientific4444557réactif pour la PCR de fragments
de circuit géniqueTaqMan Human GAPD (GAPDH) Contrôle endogène (sonde VIC/MGB), amorce limitée, 2500 rxnLife Technologies4326317Esonde qPCR
ThermocycleurBio-Rad1851148outil pour le transport de réactions de PCR, de transformation ou d’extraction de gel
VisiPlate-24 Noir, Noir Microplaque 24 puits avec fond transparent, stérile et traitée pour culture tissulaire PlaquePerkinElmer1450-605utilisée pour l’induction lumineuse expériences
Pipettes Pasteur jetables VWR, verre, pipette en verre borosilicaté, pointe courte, capacité=2 mL, longueur totale=14,6 cmVWR14673-010réactif pour culture cellulaire de mammifères
VWR Mini systèmes d’électrophorèse horizontale, système de gel Mini10VWR89032-290équipement pour électrophorèse sur gel d’ADN
Flp-In 293Thermo Fisher ScientificR75007Lignée cellulaire modifiée avec FRT site
Réactif équipement 120 V Réactif Scientific N Flacon Réactif Nikon Instrument pour la Réactif

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Sedlmayer, F., Hell, D., Muller, M., Auslander, D., Fussenegger, M. Designer cells programming quorum-sensing interference with microbes. Nature Communications. 9 (1), 1822(2018).
  2. Cho, J. H., Collins, J. J., Wong, W. W. Universal chimeric antigen receptors for multiplexed and logical control of T cell responses. Cell. 173 (6), 1426-1438 (2018).
  3. Saxena, P., et al. A programmable synthetic lineage-control network that differentiates human IPSCs into glucose-sensitive insulin-secreting beta-like cells. Nature Communications. 7, 11247(2016).
  4. Nevozhay, D., Zal, T., Balazsi, G. Transferring a synthetic gene circuit from yeast to mammalian cells. Nature Communications. 4, 1451(2013).
  5. Chang, H. H., Hemberg, M., Barahona, M., Ingber, D. E., Huang, S. Transcriptome-wide noise controls lineage choice in mammalian progenitor cells. Nature. 453 (7194), 544-547 (2008).
  6. Balazsi, G., van Oudenaarden, A., Collins, J. J. Cellular decision making and biological noise: from microbes to mammals. Cell. 144 (6), 910-925 (2011).
  7. Lee, J., et al. Network of mutually repressive metastasis regulators can promote cell heterogeneity and metastatic transitions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (3), 364-373 (2014).
  8. Dar, R. D., Hosmane, N. N., Arkin, M. R., Siliciano, R. F., Weinberger, L. S. Screening for noise in gene expression identifies drug synergies. Science. 344 (6190), 1392-1396 (2014).
  9. Becskei, A., Seraphin, B., Serrano, L. Positive feedback in eukaryotic gene networks: cell differentiation by graded to binary response conversion. EMBO Journal. 20 (10), 2528-2535 (2001).
  10. Nevozhay, D., Adams, R. M., Murphy, K. F., Josic, K., Balazsi, G. Negative autoregulation linearizes the dose-response and suppresses the heterogeneity of gene expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (13), 5123-5128 (2009).
  11. Guinn, M. T., Balazsi, G. Noise-reducing optogenetic negative-feedback gene circuits in human cells. Nucleic Acids Research. 47 (14), 7703-7714 (2019).
  12. Shimoga, V., White, J. T., Li, Y., Sontag, E., Bleris, L. Synthetic mammalian transgene negative autoregulation. Molecular Systems Biology. 9, 670(2013).
  13. Ye, H., Daoud-El Baba, M., Peng, R. W., Fussenegger, M. A synthetic optogenetic transcription device enhances blood-glucose homeostasis in mice. Science. 332 (6037), New York, N.Y. 1565-1568 (2011).
  14. Pudasaini, A., El-Arab, K. K., Zoltowski, B. D. LOV-based optogenetic devices: light-driven modules to impart photoregulated control of cellular signaling. Frontiers in Molecular Biosciences. 2, 18(2015).
  15. Liu, Y., et al. Robust and intensity-dependent synaptic inhibition underlies the generation of non-monotonic neurons in the mouse inferior colliculus. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 131(2019).
  16. Benzinger, D., Khammash, M. Pulsatile inputs achieve tunable attenuation of gene expression variability and graded multi-gene regulation. Nature Communications. 9 (1), 3521(2018).
  17. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  18. Duan, L., et al. Understanding CRY2 interactions for optical control of intracellular signaling. Nature Communications. 8 (1), 547(2017).
  19. Kim, N., et al. Spatiotemporal control of fibroblast growth factor receptor signals by blue light. Chemistry & Biology. 21 (7), 903-912 (2014).
  20. Jung, H., et al. Noninvasive optical activation of Flp recombinase for genetic manipulation in deep mouse brain regions. Nature Communications. 10 (1), 314(2019).
  21. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. Light-inducible gene regulation with engineered zinc finger proteins. Methods in Molecular Biology. 1148, 89-107 (2014).
  22. Hallett, R. A., Zimmerman, S. P., Yumerefendi, H., Bear, J. E., Kuhlman, B. Correlating in vitro and in vivo activities of light-inducible dimers: A cellular optogenetics guide. ACS Synthetic Biology. 5 (1), 53-64 (2016).
  23. Lee, D., Hyun, J. H., Jung, K., Hannan, P., Kwon, H. B. A calcium- and light-gated switch to induce gene expression in activated neurons. Nature Biotechnology. 35 (9), 858-863 (2017).
  24. Milias-Argeitis, A., et al. In silico feedback for in vivo regulation of a gene expression circuit. Nature Biotechnology. 29 (12), 1114-1116 (2011).
  25. Milias-Argeitis, A., Rullan, M., Aoki, S. K., Buchmann, P., Khammash, M. Automated optogenetic feedback control for precise and robust regulation of gene expression and cell growth. Nature Communications. 7, 12546(2016).
  26. Chen, R., et al. Rhythmic PER abundance defines a critical nodal point for negative feedback within the circadian clock mechanism. Molecular Cell. 36 (3), 417-430 (2009).
  27. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  28. Sato, T. K., et al. Feedback repression is required for mammalian circadian clock function. Nature Genetics. 38 (3), 312-319 (2006).
  29. Kramer, B. P., Fischer, C., Fussenegger, M. BioLogic gates enable logical transcription control in mammalian cells. Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 478-484 (2004).
  30. Madar, D., Dekel, E., Bren, A., Alon, U. Negative auto-regulation increases the input dynamic-range of the arabinose system of Escherichia coli. BMC Systems Biology. 5, 111(2011).
  31. Gerhardt, K. P., et al. An open-hardware platform for optogenetics and photobiology. Scientific Reports. 6, 35363(2016).
  32. Szczesny, R. J., et al. Versatile approach for functional analysis of human proteins and efficient stable cell line generation using FLP-mediated recombination system. PLoS One. 13 (3), 0194887(2018).
  33. Taxis, C. Development of a synthetic switch to control protein stability in eukaryotic cells with light. Methods in Molecular Biology. 1596, 241-255 (2017).
  34. Grav, L. M., et al. Minimizing clonal variation during mammalian cell line engineering for improved systems biology data generation. ACS Synthetic Biology. 7 (9), 2148-2159 (2018).
  35. Brophy, J. A., Voigt, C. A. Principles of genetic circuit design. Nature Methods. 11 (5), 508-520 (2014).
  36. Yeoh, J. W., et al. An automated biomodel selection system (BMSS) for gene circuit designs. ACS Synthetic Biology. 8 (7), 1484-1497 (2019).
  37. Usherenko, S., et al. Photo-sensitive degron variants for tuning protein stability by light. BMC Systems Biology. 8, 128(2014).
  38. Muller, K., Zurbriggen, M. D., Weber, W. An optogenetic upgrade for the Tet-OFF system. Biotechnology and Bioengineering. 112 (7), 1483-1487 (2015).
  39. Klotzsche, M., Berens, C., Hillen, W. A peptide triggers allostery in tet repressor by binding to a unique site. Journal of Biological Chemistry. 280 (26), 24591(2005).
  40. Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
  41. Herrou, J., Crosson, S. Function, structure and mechanism of bacterial photosensory LOV proteins. Nature Reviews Microbiology. 9 (10), 713-723 (2011).
  42. Yao, F., et al. Tetracycline repressor, tetR, rather than the tetR-mammalian cell transcription factor fusion derivatives, regulates inducible gene expression in mammalian cells. Human Gene Therapy. 9 (13), 1939-1950 (1998).
  43. Erlich, H. A. PCR technology : Principles and Applications for DNA Amplification. , Stockton Press. New York. (1989).
  44. Sambrook, J., Russell, D. W., Sambrook, J. The condensed protocols from Molecular cloning : a laboratory manual. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2006).
  45. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (21), 7413-7417 (1987).
  46. Gerhardt, K. P., Castillo-Hair, S. M., Tabor, J. J. DIY optogenetics: Building, programming, and using the Light Plate Apparatus. Methods in Enzymology. 6224, 197-226 (2019).
  47. TaborLab IRIS. TaborLab IRIS Software. , Available from: http://taborlab.github.io/Iris/index.html (2021).
  48. Stockley, J. H., et al. Surpassing light-induced cell damage in vitro with novel cell culture media. Scientific Reports. 7 (1), 849(2017).
  49. Gordon, A., et al. Single-cell quantification of molecules and rates using open-source microscope-based cytometry. Nature Methods. 4 (2), 175-181 (2007).
  50. Ordovas, L., et al. Efficient recombinase-mediated cassette exchange in hPSCs to study the hepatocyte lineage reveals AAVS1 locus-mediated transgene inhibition. Stem Cell Reports. 5 (5), 918-931 (2015).
  51. Gomez Tejeeda Zanudo, J., et al. Towards control of cellular decision-making networks in the epithelial-to-mesenchymal transition. Physical Biology. 16 (3), 031002(2019).
  52. Sweeney, K., Moreno Morales, N., Burmeister, Z., Nimunkar, A. J., McClean, M. N. Easy calibration of the Light Plate Apparatus for optogenetic experiments. MethodsX. 6, 1480-1488 (2019).
  53. Ravindran, P. T., Wilson, M. Z., Jena, S. G., Toettcher, J. E. Engineering combinatorial and dynamic decoders using synthetic immediate-early genes. Communications Biology. 3 (1), 436(2020).
  54. Chen, X., Wang, X., Du, Z., Ma, Z., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression in mammalian cells and in mice using the LightOn system. Current Protocols in Chemical Biology. 5 (2), 111-129 (2013).
  55. Guinn, M. T. Engineering human cells with synthetic gene circuits elucidates how protein levels generate phenotypic landscapes. State University of New York at Stony Brook. , Ann Arbor. Ph.D (2020).
  56. Farquhar, K. S., et al. Role of network-mediated stochasticity in mammalian drug resistance. Nature Communications. 10 (1), 2766(2019).
  57. Polstein, L. R., Gersbach, C. A. A light-inducible CRISPR-Cas9 system for control of endogenous gene activation. Nature Chemistry & Biology. 11 (3), 198-200 (2015).
  58. Guinn, M. T., et al. Observation and control of gene expression noise: Barrier crossing analogies between drug resistance and metastasis. Frontiers in Genetics. 11, 586726(2020).
  59. Levine, J. H., Lin, Y., Elowitz, M. B. Functional roles of pulsing in genetic circuits. Science. 342 (6163), 1193-1200 (2013).
  60. Rullan, M., Benzinger, D., Schmidt, G. W., Milias-Argeitis, A., Khammash, M. An optogenetic platform for real-time, single-cell interrogation of stochastic transcriptional regulation. Molecular Cell. 70 (4), 745-756 (2018).
  61. Perkins, M. L., Benzinger, D., Arcak, M., Khammash, M. Cell-in-the-loop pattern formation with optogenetically emulated cell-to-cell signaling. Nature Communications. 11 (1), 1355(2020).

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